Name: correlative super-resolution and electron microscopy to resolve protein localization in zebrafish retina
Uploaded: 2017-11-10T12:30:00
Duration: 12 min 28 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Correlative Super-resolution and Electron Microscopy to Resolve Protein Localization in Zebrafish Retina at JoVE.com

מימון יון ו- RGB: השוויצרי הלאומי למדע קרן Ambizione ניקוד-להעניק PZ00P3 142404/1 ו- PZ00P3 163979.

כל הניסויים בוצעו על פי המשפט ארוו שימוש בבעלי חיים של לרפואת עיניים ומחקר חזון ואושרו על-ידי הרשויות המקומיות.
 1. הכנה של זגוגית בסעיפים על שבבי סיליקון קיבוע הדגימה <ol><li><ol><li>להכין את הפתרון מקבע המכיל 0.1% גלוטראלדהיד, 4% פורמלדהיד במאגר cacodylate 0.1 M. 
		הערה: זהירות! באמצעי זהירות כאשר עובדים עם מאגר גלוטראלדהיד, פורמלדהיד, cacodylate, ללבוש ציוד מגן אישי המתאים והעבודה בשכונה fume.</li>
		<li>המתת חסד 5 ימים פוסט הפריה (5 dpf) הזחלים דג זברה עם tricaine (אתיל 3-aminobenzoate methanesulfonate, 0.4% w/v ב- PBS (פוספט מאגר מלוחים, pH 7)) כפי שתואר לעיל 15.</li>
		<li>לתקן את הזחלים על ידי טבילה בפתרון מקבע טרום מקורר על קרח. להסיר את הראש, דגירה בין לילה ב 4 ° C עם נדנדה עדין.</li>
		<li>לנתח את העיניים על ידי חיתוך לרקמת סביב העין באמצעות מלקחיים בסדר אזמל microdissection (תחת משקפת) בתמיסה מקבע צוננת על צלחת מיטות agarose 1%. להעביר את העיניים צינור עם מקבע טריים מצוננים מראש.</li>
		<li>לשטוף פעמיים ב- PBS (פוספט מאגר מלוחים, pH 7.4) עבור 5 דקות כל כביסה בטמפרטורת החדר (RT).</li>
	</ol></li> <li>חדירה הג'לטין ואת הרכבה <ol><li>לחמם 15 מ"ל מזון מקומי המותג ג'לטין 12% w/v ב PB (מאגר פוספט, 0.1 M pH 7.4) בגיל 40 מעלות צלזיוס. להסיר את PBS ולהוסיף ג'לטין פתרון הצינורות המכילים את העיניים. הקש על הצינור בעדינות כדי להבטיח תסנין ג'לטין המדגם תקופת דגירה של 10-30 דקות ב 40 מעלות צלזיוס thermoblock עם טלטול עדין או באמבט מים.</li>
		<li>למלא 12 מ מ x 5 מ מ x 3 מ מ סיליקון או פוליאתילן שטוח הטבעה בתבניות עם ג'לטין חמים בתוך אמבט מים 40 ° C. להוסיף שתי עיניים לכל עובש באמצעות פיפטה של, ליישר אותן כראוי תחת המשקפת באמצעות מחט לנתיחה ותני הג'לטין להתקרר בטמפרטורת החדר במשך 1 דקה, להקשיח ב 4 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות</li>
		<li>מחדש לקצץ את הבלוק ג'לטין תחת התאום להתאמת עין אחת לכל בלוק באמצעות סכין גילוח.</li>
		<li>להעביר את העיניים ג'לטין מוטבע 2.3 M סוכרוז ב PB על קרח. דגירה ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.</li>
		<li>Exchange 2.3 M סוכרוז פתרון חדש, חנות 4 ° C או-20 ° C; לאחר שלב זה, דוגמאות מוכנים חלוקתה או שניתן לאחסן ב-20 מעלות צלזיוס למשך מספר שבועות עד חודשים.</li>
		<li>חתוך מחדש את הבלוק ג'לטין כדי כמעט בגודל של העין לפני העברת הקפאה-pin. הקפאה בחנקן נוזלי, העברה הקפאה-ultramicrotome.</li>
	</ol></li> <li>Cryosectioning <ol><li>110 לחתוך nm עבה-סעיפים ב-120 ° C עם סכין יהלום הקפאה-ultramicrotome.</li>
		<li>לבחור את הסעיפים עם לולאה קווית המכיל droplet של 2% methylcellulose (במים) 2.3 M סוכרוז פתרון (1:1). להעביר חלקים רקיק סיליקון 7 מ"מ x 7 מ"מ. לאחסן סעיפים ב 4 ° C עד עיבוד נוסף-</li>
	</ol></li></ol> 2. Immunolabelling <ol><li>לשטוף מוצרי קונדיטוריה עם PBS ב-0 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות על 4 טיפות על ידי הנחת את מוצרי קונדיטוריה במהופך על הטיפות. כביסה ב- PBS 2 x 2 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>דגירה 3 פעמים ב- 0.15% גליצין ב- PBS, עבור 1 דקות כל אחד. לשטוף x 3 עבור 1 דקות/לשטוף עם PBS. Incubate מראש עם זה פשוט (PBS עם 0.5% אלבומין שור BSA וסוג ג'לטין 0.2% B) עבור 5 דק</li>
	<li>Incubate עם הארנב אנטי-Tom20 (ראה טבלה של חומרים) בזה פשוט (4 µg/mL) במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>לרחוץ x 6 עבור מינימום 1/שטיפת בזה פשוט. Incubate מראש עם זה פשוט עבור 5 דקות ב- RT. Incubate עם אלקסה 647 F(ab&#39;) נגד הארנב 2 (ראה את הטבלה של חומרים) בזה פשוט (7.5 µg/mL) במשך 30 דקות</li>
	<li>לרחוץ x 6 עבור מינימום 1/שטיפת בזה פשוט. רחץ 3 x 2 min ב- PBS. דגירה עם דאפי (4 µg/mL) ב- PBS 10 ס' לשטוף 2 x 2 min ב- PBS.</li>
</ol> 3. מיקרוסקופ סופר-ברזולוציה <ol><li>Incubate כשהפחד לזמן קצר (10 s) על-ידי הצבתו על droplet של פתרון 1:1 של גליצרול (80%) והדמיה מאגר המכיל חמצן ניקוי מערכת (200 מ"מ פוספט מאגר המכיל 10% גלוקוז, 0.5 מ"ג/מ"ל glucoseoxidase, 40 µg/mL קטלאז, 15 מ מ בטא-mercaptoethylamine הידרוכלוריד (MEA HCL), pH 8.0).</li>
	<li>להעביר את מוצרי קונדיטוריה (סעיף כלפי מטה) הזכוכית התחתונה (עובי 170 ± 5 מיקרומטר) פטרי על גבי טיפה טריים של תערובת 1:1 של גליצרול (80%) והדמיה מאגר (כמו שלב 3.1).</li>
	<li>להסיר מכל הכיוונים, עם פיפטה, רוב הנוזל מתחת לחם הקודש. השתמש סיליקון פסים כדי לתקן את וופל לתחתית הפטרי. 
	הערה: סיליקון פסים עשויים שני סיליקון-דבק (3 מ"מ x 12 מ"מ).</li>
	חלקים <li>התמונה במיקרוסקופ הפוכה באמצעות צוהר מספרית גבוהה (למשל 160 X / נה 1.43; ראה הטבלה של חומרים) שמן טבילה רזולוציה סופר אובייקטיבית ייעודי. לפני הדמיה, תן הדגימה equilibrate לטמפרטורת מיקרוסקופ על מנת למזער/להפחית להיסחף לרוחב ו צירית.</li>
	<li>מרכז את תחום העניין ולרכוש את התמונות הראשונות של הפניה epifluorescence widefield. לשנות מצב הפעולה של סופר רזולוציה. להתאים את זמן החשיפה של המצלמה כדי 15 ms ולהגדיר את האלקטרון הכפלת רווח (EM) למספר המרבי של 300.</li>
	<li>מאירים מדגם עם 642 ננומטר לייזר מתמשך wave-עוצמת הלייזר המרבי (תואם ל- ~2.8 kW/cm 2) במצב epifluorescence. ברגע מולקולה בודדת ומהבהבת מופרדים היטב בכל אחת מהמסגרות, כך הסבירות היא נמוכה כי אותות נפרדים חופפים, להגדיר את עוצמת הלייזר ~0.7 kW/ס מ 2. להקליט את תמונת raw במצב epifluorescence על-ידי השגת מינימום של מסגרות 30,000. 
	הערה: כל פרמטר אלה עשויים להשתנות בהתאם פרטים שונים ולקרוא צפיפויות.</li>
	<li>מן הנתונים הגולמיים, ליצור רשימה אירוע שחזור (הגרסא המקומית של כל מצמוץ מולקולה בודדת בתמונה raw) באמצעות סף גילוי של 30 פוטונים (צריך להיות מותאם על פי המדגם) על-ידי לחיצה על &#34; הערך &#34;, &#39; t-סדרה ניתוח &#39; תחת &#39; כלי &#39;.</li>
	<li>לדמיין את התמונה ברזולוציה סופר על ידי התאמה לפי עקומת גאוס 16 החלת גודל פיקסל עיבוד של 4 nm על ידי לחיצה על &#34; ליצור תמונה &#34; ב &#39; אירוע רשימת עיבוד לוח &#39; תחת &#39; כלים. &#39; 
	הערה: עבור יצירת תמונת סופר נפתרה בכלי תוכנה משולבת של המערכת השתמשו במחקר זה הועסקו. עם זאת, ההדמיה ברזולוציה סופר תיאר יכולה להתבצע בכל מערכת הלוקליזציה מבוסס אחרים של מולקולה בודדת, ואת הנתונים יכול להיות מעובד עם כלי תוכנה קוד פתוח כמו רעמים 17.</li>
</ol> 4. Shadowing פלטינה <ol><li>להסיר סיליקון פסים ולהוסיף טיפה של PBS בקרבת קצות כשהפחד להרים אותו מן הפטרי. לשטוף את לחם הקודש 2 x 2 min ב- PBS, אז פוסט לתקן אותו עם גלוטראלדהיד 0.1% ב- PBS עבור 5 דק לשטוף 2 x למשך 2 דקות/לשטוף ב- PBS.</li>
	<li>דגירה כשהפחד פעמיים במשך 5 דקות הדגירה בטיפה 1 של methylcellulose 2% במים על קרח. הכנס את פרוסת סיליקון שפופרת צנטרפוגה ו centrifuge ב 14,100 x g עבור הר ש 90 שזה על גדם אלומיניום SEM עם ניצוח מלט פחמן.</li>
	<li>להוסיף שכבה של 2-10 nm של פלטינה/פחמן על הדגימה על-ידי הוספת צל רוטרי ב ° 8 באמצעות אלקטרון לשגר הגדרות התקן אידוי: 1.55 kV, 55 אמא, nm 0.3/s, ואת זווית של ° 8, סיבוב רמה 4-</li>
</ol> 5. מיקרוסקופ אלקטרונים סורק <ol><li>התמונה מקטעים בסריקת אלקטרון microscope-1.5 kV, 2 מ מ עבודה מרחוק, עם In עדשה משני אלקטרונים גלאי.</li>
</ol> 6. יישור של אור ושל תמונות מיקרוסקופ אלקטרונים <ol><li>פתוח שני סוגים של תמונות עם פיג'י 18 על ידי לחיצה על &#34; קובץ | פתוח &#34;. התאם גודל בד על ידי לחיצה &#34; תמונה | התאם | גודל בד ציור &#34; להביא גם תמונות בערימה על ידי לחיצה &#34; תמונה | ערימות | תמונות לערום &#34;. לשמור בה את המחסנית כסוג קובץ tiff.</li>
	<li>ב פיג'י, לפתוח ממשק חדש של 19 TrackEM2 על-ידי לחיצה על &#34; קובץ | חדש | TrackEM2 (חדש) &#34;. לייבא את המחסנית עם שתי תמונות על-ידי לחיצה ימנית על החלון השחור ובחירה &#34; ייבוא מחסנית &#34;.</li>
	<li>אור ישר תמונת מיקרוסקופ כדי תמונת מיקרוסקופ אלקטרונים באופן ידני עם ציוני דרך על-ידי באמצעות לחיצה ימנית על התמונה ובחירה &#34; ישר | יישור השכבה באופן ידני עם ציוני דרך &#34;.
	<ol><li>פיק בחר כלי (החץ השחור) כדי להוסיף ציוני דרך. השתמש בצורת גרעינים כהפניה כדי לבחור בקצוות אותו בתמונות הן (משלים איור 1). הוסף מספר נקודות (שלוש נקודות המינימום צריך להיבחר). להחיל יישור עם מודל affine על-ידי העכבר הימני לחיצה ובחירה &#34; להחיל שינוי צורה | מודל affine &#34;.</li>
	</ol></li> <li>לשנות את שקיפות השכבה (ראה איור משלים 1) כדי להעריך את האיכות של היישור.</li></ol>

<ol>
	<li>Hauser, M., Wojcik, M., Kim, D., Mahmoudi, M., Li, W., Xu, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+Super-Resolution+Microscopy:+New+Dimensions+and+New+Opportunities.">Correlative Super-Resolution Microscopy: New Dimensions and New Opportunities.</a> Chem Rev. , (2017).</li><li>Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+fluorophores+for+optimal+performance+in+localization-based+super-resolution+imaging.">Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging.</a> Nat Methods. 8 (12), 1027-1036 (2011).</li><li>F&#246;lling, J., Bossi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+nanoscopy+by+ground-state+depletion+and+single-molecule+return.">Fluorescence nanoscopy by ground-state depletion and single-molecule return.</a> Nat Methods. 5 (11), 943-945 (2008).</li><li>Betzig, E., Patterson, G. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution.">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science (New York, N.Y.). 313 (5793), 1642-1645 (2006).</li><li>Kopek, B. G., Shtengel, G., Grimm, J. B., Clayton, D. A., Hess, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+photoactivated+localization+and+scanning+electron+microscopy.">Correlative photoactivated localization and scanning electron microscopy.</a> PLOS one. 8 (10), e77209 (2013).</li><li>Paez-Segala, M. G., Sun, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fixation-resistant+photoactivatable+fluorescent+proteins+for+CLEM.">Fixation-resistant photoactivatable fluorescent proteins for CLEM.</a> Nat Methods. 12 (3), 215-218 (2015).</li><li>Narayan, K., Subramaniam, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focused+ion+beams+in+biology.">Focused ion beams in biology.</a> Nat Methods. 12 (11), 1021-1031 (2015).</li><li>Tokuyasu, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunochemistry+on+ultrathin+frozen+sections.">Immunochemistry on ultrathin frozen sections.</a> Histochem J. 12 (4), 381-403 (1980).</li><li>Suleiman, H., Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+protein+architecture+of+the+kidney+glomerular+basement+membrane.">Nanoscale protein architecture of the kidney glomerular basement membrane.</a> eLife. 2, e01149 (2013).</li><li>Kopek, B. G., Shtengel, G., Xu, C. S., Clayton, D. A., Hess, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+3D+superresolution+fluorescence+and+electron+microscopy+reveal+the+relationship+of+mitochondrial+nucleoids+to+membranes.">Correlative 3D superresolution fluorescence and electron microscopy reveal the relationship of mitochondrial nucleoids to membranes.</a> Proc Nat Acad Sci U S A. 109 (16), 6136-6141 (2012).</li><li>Avanesov, A., Malicki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+retina+in+the+zebrafish+model.">Analysis of the retina in the zebrafish model.</a> Methods Cell Biol. 100, 153-204 (2010).</li><li>Bachmann-Gagescu, R., Phelps, I. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ciliopathy+gene+cc2d2a+controls+zebrafish+photoreceptor+outer+segment+development+through+a+role+in+Rab8-dependent+vesicle+trafficking.">The ciliopathy gene cc2d2a controls zebrafish photoreceptor outer segment development through a role in Rab8-dependent vesicle trafficking.</a> Hum Mol Gen. 20 (20), 4041-4055 (2011).</li><li>Bachmann-Gagescu, R., Dona, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ciliopathy+Protein+CC2D2A+Associates+with+NINL+and+Functions+in+RAB8-MICAL3-Regulated+Vesicle+Trafficking.">The Ciliopathy Protein CC2D2A Associates with NINL and Functions in RAB8-MICAL3-Regulated Vesicle Trafficking.</a> PLOS Gen. 11 (10), e1005575 (2015).</li><li>Mateos, J. M., Guhl, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topographic+contrast+of+ultrathin+cryo-sections+for+correlative+super-resolution+light+and+electron+microscopy.">Topographic contrast of ultrathin cryo-sections for correlative super-resolution light and electron microscopy.</a> Sci Rep. 6, 34062 (2016).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2000).</li><li>Thompson, R. E., Larson, D. R., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precise+nanometer+localization+analysis+for+individual+fluorescent+probes.">Precise nanometer localization analysis for individual fluorescent probes.</a> Biophys J. 82 (5), 2775-2783 (2002).</li><li>Ovesn&#253;, M., K&#345;&#237;&#382;ek, P., Borkovec, J., Svindrych, Z., Hagen, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ThunderSTORM:+a+comprehensive+ImageJ+plug-in+for+PALM+and+STORM+data+analysis+and+super-resolution+imaging.">ThunderSTORM: a comprehensive ImageJ plug-in for PALM and STORM data analysis and super-resolution imaging.</a> Bioinformatics. 30 (16), 2389-2390 (2014).</li><li>Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Cardona, A., Saalfeld, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TrakEM2+software+for+neural+circuit+reconstruction.">TrakEM2 software for neural circuit reconstruction.</a> PLOS one. 7 (6), e38011 (2012).</li><li>Wurm, C. A., Neumann, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+distribution+of+mitochondrial+import+receptor+Tom20+is+adjusted+to+cellular+conditions+and+exhibits+an+inner-cellular+gradient.">Nanoscale distribution of mitochondrial import receptor Tom20 is adjusted to cellular conditions and exhibits an inner-cellular gradient.</a> Proc Nat Acad Sci U S A. 108 (33), 13546-13551 (2011).</li><li>Slot, J. W., Geuze, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryosectioning+and+immunolabeling.">Cryosectioning and immunolabeling.</a> Nat Prot. 2 (10), 2480-2491 (2007).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

שיטה זו משלבת לוקליזציה חלבון סופר-נפתרה עם מידע בהקשר כדי לקבוע את מיקום מדויק של חלבונים ב- אברון. נדגים כאן השלמת הניסוי כדי להמחיש את הביטוי של Tom20 הממברנה החיצונית של המיטוכונדריה, ויחסה אחרים organelles כמו גרעינים או מקטעים החיצוני של קולט אור ברשתית דג זברה זחל.
Tokuyasu הקפאה-חלוקתה דורש הכשרה לרכוש חלקים שהשתמרה היטב. עם זאת, זוהי שיטה המועסקים מעבדות רבות עם הצלחה והפגינו21. העברת המקטעים פרוסות הסיליקון היא פשוטה מאוד, אין שיקולים מיוחדים נדרשים. השימוש של גליצרול במאגר הדמיה הוא שלב קריטי מאוד כדי למנוע ייבוש של הסעיפים. עבור הדמיה ברזולוציה סופר התוצאות הטובות ביותר מתקבלים כאשר כשהפחד קרוב מאוד בתחתית הכוס צלחת פטרי. הפסים סיליקון לסייע לשמירה על כשהפחד בתנוחה זו. טיפול מיוחד יש לנקוט בעת הסרת הפסים על מנת למנוע נזק הסעיפים.
העובי של הסעיפים-הקפאה, בסביבות 100 ננומטר, דק יותר רזולוציה אופטית ב Z-המימד, בנוסף מקלה את הדיוק של שיטת correlative כמו האות מיקרוסקופ סופר-ברזולוציה מגיע רק שכבה דקה זו את מיקרוסקופ אלקטרונים סריקה אות מציגה את הטופוגרפיה של המדגם. שיטה זו יכולה גם להיות משולב עם הדמיה ססגוניות. אולם, יש לקחת טיפול מיוחד כי המדגם יכולים לדימות תחת אותם תנאים (למשל מאגר הדמיה), קרוס לדבר יש למנוע.
מגבלה אחת של השיטה היא שלה דו מימדי מתקרב, מאז ניתן לאסוף רק מספר מוגבל של טורי מקטעים (בערך 3 עד 7 לכל פרוסת סיליקון). לפיכך, פרויקטים העוסקים ניתוח אמצעי האחסון לא יהיה אידיאלי. עם זאת, היא שיטה שניתן להחיל לזהות ביטוי חלבון בכל סוג של רקמה על-ידי חלוקתה פשוטה של המדגם. אנו מספקים שיטה ללא שימוש של סוכנים בניגוד קלאסית כמו ציטראט uranyl אצטט או עופרת. החדות על-ידי הוספת צל פלטינה מספקת ניגודיות הטופוגרפי מאוד אינפורמטיבי, אך במקרים מסוימים ממברנות שקשה לפתור. זה עשוי להוות בעיות עבור פרוייקטים צריך, לדוגמה, כדי לקבוע את הביטוי של חלבונים בתוך שלפוחית קטנה.
פרוטוקול שלנו, המבוסס על Tokuyasu הקפאה-מקטעים, משתמשת ציוד סטנדרטי כדי לקבל תוצאות correlative סופר רזולוציה ומיקרוסקופים אלקטרון סריקה. האוסף של קטעים על שבבי סיליקון המחפשים לשלב בין טיפול אלטרנטיבי ונוחות צעדים פשוטים כדי לספק יציבות הפארמצבטית כדי הכנת הדוגמא השימוש של פלטינה עבור חדות.

שיטות לקביעת ההתאמה subcellular של חלבונים והקשר שלהן כדי תאים שונים של התא הן כלי חיוני להבין את הפונקציות שלהם ואת האינטראקציות האפשריות. סופר-רזולוציה מיקרוסקופיה בשילוב עם מיקרוסקופ אלקטרונים מספק מידע כזה1. מיקרוסקופ המחסור בקרקע ואחריו החזרה מולקולה בודדת (GSDIM) היא טכנולוגיה מיקרוסקופ סופר-ברזולוציה תואם עם מגוון רחב של fluorophores אורגניים, גנטית מקודד2 , משיגה רזולוציה לרוחב עד 20 ננומטר 3. שילוב של שיטות עם רזולוציה גבוהה יותר מאשר במיקרוסקופ רגיל מוגבל עקיפה משפר את הדיוק של המתאם4,5,6. על מנת להשיג המתאם הטוב ביותר של ביטוי חלבון עם תא subcellular מסוים וכדי להקטין את עוצמת הקול של חוסר ודאות7 השימוש באותו מקטע ודק במיוחד עבור אור ואלקטרון מומלץ. בין השיטות השונות אופטים, פרוטוקול הקפאה-סעיף Tokuyasu אינה דורשת התייבשות או שרף הטבעה, בנוסף, משמר את antigenicity של epitopes רבים ומספק רקמות טוב ultrastructure8. מספר שיטות הוכיחו את הישימות של מקטעים אלה correlative ואור מיקרוסקופ אלקטרונים (קלם)4,5,9,10.
הרשתית דג זברה הוא מודל חשוב ללמוד פיתוח ויזואלי ו מנגנוני מחלות אנושיות נתון מאוד שנשמרת מבנהו ותפקודו על פני בעלי חוליות. Photoreceptors מסוים, רשתית תצוגה אותה ארכיטקטורת כמו photoreceptors יונקים, עם סינפסה הבזליים, גרעין apico-basally מוארך, קיבוץ באשכולות של המיטוכונדריה על קטע הפנימי יותר הפסגה, קטע החיצוני מורכב של קרום דיסקים המיקום הכי הפסגה11. לוקליזציה של חלבון כדי התאים הסלולר מגוונות הוא שנשמרת בין דג זברה, אנושי, המאפשר חקירת הפונקציה הביולוגי של האדם חלבונים מחלות רלוונטיות12,13.
כאן אנו מציגים פרוטוקול להכין דג זברה זחל רשתית דגימות לפתור הלוקליזציה של החלבון מיטוכונדריאלי הממברנה החיצונית Tom20 על-ידי אור רזולוציה סופר correlative ואלקטרון. השיטה מבוססת על איסוף הקפאה-סעיפים על שבבי סיליקון, קבלת ניגודיות הטופוגרפי מידע שנוצר אחרי היישום של שכבה דקה של פלטינה. השלבים הבאים הם שיפורים טכניים ברור מבחינת נוחות השימוש, הפארמצבטית, ואת זמן להשלים ניסויים. לאחרונה הראו את הישימות של השיטה כדי לזהות נקבוביות הגרעין וחלבונים מיטוכונדריאלי העכבר רקמות14.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde EM Grade</td>
			<td>EMS, USA</td>
			<td>#16220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cacodylate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>#8.20670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#886-86-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose, peqGOLD Universal</td>
			<td>VWR International GmbH</td>
			<td>35-1020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat embedding molds</td>
			<td>BEEM Flat</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Local food brand gelatin</td>
			<td>Dr.Oetker</td>
			<td>Extra Gold</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Merck</td>
			<td>#1.07687</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylcellulose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#M-6385</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#G-7126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin type B</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#G-6650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>#A6588.0050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon wafer</td>
			<td>Si-Mat Silicon Materials</td>
			<td></td>
			<td>Type: P/Boron; Orientation &#60;111&#62; ON; Growth method: CZ; Resistivity:1-30 ohm/cm; Surface: polished; Laser cut at 7 x7 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryo-pin</td>
			<td>Baltic Preparation</td>
			<td>#16701950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wired loop &#34;Perfect loop&#34;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone stripes</td>
			<td>Picodent</td>
			<td>Twinsil 22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glucoseoxidase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#G7141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>catalase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#C40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>beta-Mercaptoethylamine hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#M6500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Tom20</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>#sc - 11415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlexaFluor 647 AffiniPure F(ab&#39;)2 fragment donkey anti rabbit IgG</td>
			<td>Jackson Immuno-Research</td>
			<td>#711-606-152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>ROCHE, Switzerland</td>
			<td>#10236276001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#49782</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom petri dish</td>
			<td>Ibidi, Germany</td>
			<td>u-Dish 35mm, high glass bottom, #81158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SEM aluminium stub</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>#G301F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conducting carbon cement Leit-C</td>
			<td>Plano, Germany</td>
			<td>AG3300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond Knife (Cryo Immuno)</td>
			<td>Diatome</td>
			<td>DCIMM3520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryo-ultramicrotome</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>Leica EM FCS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Widefield-TIRF microscope GSD Leica SR GSD 3D</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>160x 1.43 TIRF objective</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>11523048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SEM - Zeiss Supra 50 VP</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Supra 50 VP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIB-SEM - Zeiss Auriga 40</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Auriga 40</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

correlative super-resolution and electron microscopy to resolve protein localization in zebrafish retina

אנו מציגים שיטה לחקור לוקליזציה חלבון subcellular ברשתית דג זברה זחל על ידי שילוב של מיקרוסקופ אור סופר רזולוציה וסריקת מיקרוסקופ אלקטרונים. עקיפה תת מגבלת רזולוציה היכולות של מיקרוסקופ אור סופר-רזולוציה אפשר לשפר את הדיוק של הנתונים מתואם. בקצרה, 110 ננומטר בעובי הקפאה-מועברים רקיק סיליקון ומקטעים, לאחר immunofluorescence מכתים, הם צילמו על ידי מיקרוסקופ אור סופר רזולוציה. לאחר מכן, הסעיפים נשמרים ב methylcellulose ו פלטינה מוצלל לפני הדמיה במיקרוסקופ אלקטרונים סריקה (SEM). תמונות מ האופנים האלה-מיקרוסקופ שני ימוזגו בקלות באמצעות ציוני דרך רקמות עם תוכנת קוד פתוח. כאן נתאר שיטת המותאמים עבור הרשתית דג זברה זחל. עם זאת, שיטה זו ישימה גם סוגים אחרים של רקמות ואורגניזמים. נדגים כי המידע המשלים מתקבל על ידי המתאם הזה הוא שאפשר לפתור הביטוי של חלבונים מיטוכונדריאלי ביחס עם הממברנות ואת cristae של המיטוכונדריה כמו גם לגבי תאים אחרים של התא.

הביטוי של החלבון Tom20, יחידת משנה של ה translocase מיטוכונדריאלי הממברנה החיצונית מורכבת20, נקבע, בסעיפים דק של דג זברה זחל הרשתית, על ידי מיקרוסקופ אור super-resolution (איור 1), מידע זה היה השלים עם האות הטופוגרפי מתקבל על ידי סריקת מיקרוסקופ אלקטרונים לאחר הצללת פלטינה הנוכשה. אלה נתונים correlative לאשר הלוקליזציה של חלבון בשיתוף עם תא מסוים, הממברנה החיצונית מיטוכונדריאלי, בנוסף לספק מידע על הזיקה של החלבון עם אחרים organelles של התא.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56113/56113fig1.jpg"> 
איור 1: קלם על הרשתית דג זברה. א הגדלה נמוכה widefield תמונה של דג זברה 5 dpf סעיף ברשתית, גרעינים צבעונית עם דאפי (ציאן). B. סריקת מיקרוסקופ אלקטרונים באותו האזור. ג. הגדלה גבוהה יותר widefield תמונה של מסגרת גרעינים ב מוכתם דאפי (ציאן), צביעת מיטוכונדריאלי Tom20 מופיע באדום. ד Widefield תמונה של אותו סעיף בהגדלה גבוהה יותר. התבנית של Tom20 הביטוי הוא האשכולות של המיטוכונדריה. אי ביטוי של Tom20 (נקודות אדומות) זוהה על ידי מיקרוסקופ GSDIM. הגרעינים מוכתם עם דאפי (ציאן). פ באותו מקטע כמו E שילוב רזולוציה סופר correlative וסריקה מיקרוסקופ אלקטרונים. Tom20 מכתים (נקודות אדומות) מופיע על האשכול מיטוכונדריאלי (ז) בקרום החיצוני של המיטוכונדריה. קרינה פלואורסצנטית דאפי האות הגרעינים (N) תואמת הטופוגרפיה של תמונת SEM. G. התמונה בהגדלה של מסגרת ב- F. סריקה תמונת מיקרוסקופ אלקטרונים מספק בהקשר לתמונה GSDIM (נקודות אדומות). Cristae מיטוכונדריאלי נראה בבירור, ההכתמה Tom20 הוא מקומי כדי בקרום החיצוני של המיטוכונדריה. הממברנות של המקטע החיצוני photoreceptors (OS) נפתרות בבירור. התמונה פיקסל בגודל 5 ננומטר. גודל ברים: A, B ו- c: 10 מיקרומטר; D: מיקרומטר 2; E ו- f: 1 מיקרומטר וז: 0.2 µm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56113/56113fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
משלים איור 1: יישור של תמונות אור ואלקטרון. A-צילום מסך מתוך ממשק TrackEM2 עם תמונות SEM וציוני ממוספרות (צהוב) לאורך גרעינים שונים. B. צילום מסך מתוך ממשק TrackEM2 עם פלורסצנטיות תמונות וציוני ממוספרות (צהוב) לאורך דאפי שונים צבעונית גרעינים. כדי לשנות את שקיפות השכבה המחוונים בחלק העליון השמאלי של התפריט יכול לשמש. סרגל קנה מידה: 1 מיקרומטר. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56113/Supplementary_Figure_1.tif">אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Correlative Super-resolution and Electron Microscopy to Resolve Protein Localization in Zebrafish Retina at JoVE.com

Correlative Super-resolution and Electron Microscopy to Resolve Protein Localization in Zebrafish Retina

פרוטוקול זה מתאר את השלבים הדרושים כדי להשיג תוצאות לוקליזציה חלבון subcellular על דג זברה הרשתית על ידי התאמת מיקרוסקופ אור סופר רזולוציה וסריקת תמונות מיקרוסקופ אלקטרונים.

רזולוציה סופר correlative ואלקטרון לפתרון חלבון לוקליזציה ברשתית דג זברה

We present a method to investigate the subcellular protein localization in the larval zebrafish retina by combining super-resolution light microscopy and ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion (FDAP)

Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion FDAP

מדידת יציבות חלבון בחיים עוברי דג הזברה שימוש הקרינה רדיואקטיבית לאחר photoconversion (FDAP)

Protein stability influences many aspects of biology, and measuring the clearance kinetics of proteins can provide important insights into biological ...

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

ניתוח של יושרה שריר שלד דג הזברה זחלים עם אוונס הכחול צבע

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Large-scale Scanning Transmission Electron Microscopy (Nanotomy) of Healthy and Injured Zebrafish Brain

Large-scale Scanning Transmission Electron Microscopy Nanotomy of Healthy and Injured Zebrafish Brain

סריקה הילוכים בקנה מידה גדול מיקרוסקופית אלקטרונים (Nanotomy) של בריאה ונפצעו דג הזברה המוח

Large-scale 2D electron microscopy (EM), or nanotomy, is the tissue-wide application of nanoscale resolution electron microscopy. Others and we previously ...

Analysis of Zebrafish Kidney Development with Time-lapse Imaging Using a Dissecting Microscope Equipped for Optical Sectioning

ניתוח של פיתוח כליה דג הזברה עם זמן לשגות הדמיה באמצעות מיקרוסקופ לנתח מצויד עבור חתך אופטי

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method ...

Using Light Sheet Fluorescence Microscopy to Image Zebrafish Eye Development

באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי גיליון אור פיתוח תמונה דג הזברה העין

Light sheet fluorescence microscopy (LSFM) is gaining more and more popularity as a method to image embryonic development. The main advantages of LSFM ...

Analysis of Protein-protein Interactions and Co-localization Between Components of Gap, Tight, and Adherens Junctions in Murine Mammary Glands

ניתוח אינטראקציות חלבון חלבון שיתוף לוקליזציה בין רכיבי פערים, צמודים, ו adherens צמתים Murine בלוטות החלב

Cell-cell interactions play a pivotal role in preserving tissue integrity and the barrier between the different compartments of the mammary gland. These ...

Multimodal Hierarchical Imaging of Serial Sections for Finding Specific Cellular Targets within Large Volumes

הדמיה הירארכי עם מודאלים מרובים סעיפים טורי למציאת מטרות תאיות ספציפיים בתוך כמויות גדולות

Targeting specific cells at ultrastructural resolution within a mixed cell population or a tissue can be achieved by hierarchical imaging using a ...

Immunohistochemical Detection of 5-Methylcytosine and 5-Hydroxymethylcytosine in Developing and Postmitotic Mouse Retina

Immunohistochemical זיהוי של 5-Methylcytosine, 5-Hydroxymethylcytosine בפיתוח ואת הרשתית העכבר Postmitotic

The epigenetics of retinal development is a well-studied research field, which promises to bring a new level of understanding about the mechanisms of a ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

להמחיש את צומת ואת צלחת Notochordal Gastrulating עוברי העכבר באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סריקה כל הר Immunofluorescence

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

A Layered Mounting Method for Extended Time-Lapse Confocal Microscopy of Whole Zebrafish Embryos

שיטת הרכבה שכבתית עבור מיקרוסקופ זמן מורחב מיקרוסקופיה של כל העוברים דגים

Dynamics of development can be followed by confocal time-lapse microscopy of live transgenic zebrafish embryos expressing fluorescence in specific tissues ...