Name: correlative super-resolution and electron microscopy to resolve protein localization in zebrafish retina
Uploaded: 2017-11-10T12:30:00
Duration: 12 min 28 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Correlative Super-resolution and Electron Microscopy to Resolve Protein Localization in Zebrafish Retina at JoVE.com

Финансирование Ион и RGB: Швейцарской национальной науки фонд Ambizione-Оценка Грант PZ00P3 142404/1 и PZ00P3 163979.

все эксперименты были проведены в соответствии с заявлением Арво для использования животных в глазной и видение исследования и были утверждены местными властями.
 1. Подготовка ультратонких разделы на кремниевых пластин фиксации образцов <ol><li><ol><li>подготовить фиксирующие раствор, содержащий 0.1% глютаральдегид, 4% формальдегида в буфер cacodylate 0,1 М. 
		Примечание: осторожно! Соблюдайте осторожность при работе с буфером глютаральдегид, формальдегид и cacodylate, носить надлежащие средства личной защиты и работают в зонта.</li>
		<li>Усыпить 5 дней после оплодотворения личинки данио рерио (5 dpf) с tricaine (этиловый метансульфонат 3-аминобензоат, 0,4% w/v в PBS (фосфат буфер солевой, рН 7)) как описано 15.</li>
		<li>Исправить личинки, погружение в предварительно охлажденные фиксирующие решения на льду. Удалите головы и инкубировать на ночь при 4 ° C с плавное покачивание.</li>
		<li>Вскрыть глаз путем обрезки ткани вокруг глаз с помощью тонкой щипцы и microdissection скальпель (под бинокль) охлажденные фиксирующие решения на пластине местная агарозы 1%. Передать трубку с свежими предварительно охлажденные фиксатором глаза.</li>
		<li>Мыть дважды в PBS (фосфат буфер солевой, рН 7,4) за 5 мин каждый мыть при комнатной температуре (RT).</li>
	</ol></li> <li>Желатин инфильтрации и монтажа <ol><li>теплой до 15 мл местные продукты бренда желатина 12% w/v в PB (фосфатного буфера, 0,1 М рН 7,4) на 40 ° C. Удалите PBS и добавить желатин решение в пробирки, содержащие глаз. Нажмите трубка мягко для обеспечения желатин инфильтраты образца и проинкубируйте 10-30 мин при 40 ° C в thermoblock с нежным встряхивания или на водяной бане.</li>
		<li>Заполнить 12 мм x 5 мм x 3 мм кремния или полиэтилена плоский встраивание формы с теплой желатин в водяной бане 40 ° C. Добавьте два глаза за плесень с помощью пипетки, выровнять их должным образом под бинокль с помощью иглы рассечение и пусть желатин остыть при комнатной температуре в течение 1 мин и затвердевают при 4 ° C на 20 мин</li>
		<li>Повторно отделка блок желатина под бинокль, чтобы соответствовать один глаз на блок с помощью лезвия бритвы.</li>
		<li>Передавать 2,3 М сахарозы в PB желатин встроенных глаза на льду. Инкубируйте на 4 ° C на ночь.</li>
		<li>Обмен новым 2,3 М раствора сахарозы и хранить при 4 ° С или 20 ° C; после этого шага, образцы готовы для разрезания или могут храниться при температуре-20 ° C в течение нескольких недель до месяцев.</li>
		<li>Повторно отделка блок желатина почти размер глаза перед передачей крио контактный. Замораживание в жидком азоте и передачи криоультрамикротом.</li>
	</ol></li> <li>Cryosectioning <ol><li>Вырезать 110 Нм толщиной секций при-120 ° C с алмазным ножом в криоультрамикротом.</li>
		<li>Выбрать разделы с проводной цикл, содержащий капельку метилцеллюлоза 2% (в воде) и 2,3 М раствора сахарозы (1:1). Перенести разделы кремниевой пластины 7 x 7 мм. Хранить разделы на 4 ° C до дальнейшей обработки.</li>
	</ol></li></ol> 2. Immunolabelling <ol><li>мыть пластин с PBS при 0 ° С 20 мин на четыре капли, поместив пластин вниз на капли. Мыть в PBS 2 x 2 мин при комнатной температуре.</li>
	Глицин <li>Инкубировать 3 раза в 0,15% в PBS, за 1 мин. Вымойте 3 x 1 мин/мыть с PBS. Предварительно incubate с PBG (PBS с BSA бычий сывороточный альбумин 0,5% и 0,2% желатина типа B) для 5 минут</li>
	<li>Инкубировать с кролик анти Tom20 (см. Таблицу материалов) в PBG (4 мкг/мл) за 30 мин при комнатной температуре.</li>
	<li>Мыть 6 x за 1 мин/мыть в PBG. Предварительно incubate с PBG на 5 мин на RT. инкубировать с анти кролик Alexa 647 F(ab&#39;) 2 (см. Таблицу материалов) в PBG (7.5 мкг/мл) за 30 мин</li>
	<li>Мыть 6 x за 1 мин/мыть в PBG. Вымойте 3 x 2 мин в PBS. Проинкубируйте с DAPI (4 мкг/мл) в PBS для 10 s. мыть 2 x 2 мин в PBS.</li>
</ol> 3. Супер-резолюции микроскопии <ol><li>инкубировать вафельные кратко (10 s), поместив ее на капли раствора 1:1 глицерина (80%) и визуализации буфера, содержащий кислорода, очистки системы (200 мм фосфатного буфера, содержащий 10% глюкозы, 0.5 мг/мл glucoseoxidase, 40 мкг/мл каталазы, 15 мм бета mercaptoethylamine гидрохлорид (MEA HCL), рН 8,0).</li>
	<li>Передача пластин (раздел вниз) Петри стекла (толщиной 170 ± 5 μm) снизу на свежие капли 1:1 смесь глицерина (80%) и визуализации буфера (как шаг 3.1).</li>
	<li>Удалить со всех сторон, с пипеткой, большая часть жидкости под пластины. Использование полосы силиконовые исправить пластины на нижней части Петри. 
	Примечание: Силиконовые полосы сделаны из двухкомпонентный клей силиконовый (3 x 12 мм).</li>
	Разделы <li>изображения на инвертированного микроскопа с помощью высокая числовая апертура (например 160 X / NA 1,43; см. Таблицу материалов) масло погружения супер резолюции выделенный цели. До обработки изображений, позволяют сбалансировать Микроскоп температуры для того, чтобы свести к минимуму и уменьшить боковые и осевого смещения выборки.</li>
	<li>Центр области интересов и приобрести первые widefield эпифлуоресцентного ссылкой изображения. Изменить режим работы супер резолюции. Отрегулируйте время экспозиции камеры до 15 мс и установите электрон умножения (EM) получить максимум 300.</li>
	<li>Освещения образца с 642 Нм непрерывная волна лазера на мощность максимальная лазера (соответствующий ~2.8 кВт/см 2) в режиме эпифлуоресцентного. Как только одной молекулы мигает хорошо отделены в каждом кадре, так что вероятность низка, что отдельные сигналы пересекаются, установите мощность лазера до ~0.7 кВт/см 2. Запись изображений в формате raw в режиме эпифлуоресцентного путем приобретения минимум 30 000 кадров. 
	Примечание: Все эти параметра может изменяться в зависимости от различных образцов и маркировки плотностями.</li>
	<li>От исходных данных, создать список событий реконструкции (локализации каждого одной молекулы скачок в raw изображений) с помощью обнаружения порога 30 фотонов (должен корректироваться по образцу), нажав &#34; вычислить &#34; в &#39; t серии анализ &#39; под &#39; инструменты &#39;.</li>
	<li>Визуализировать изображения супер резолюции Гаусса фитинга 16 применения рендеринга пикселей размером 4 Нм, нажав &#34; создать образ &#34; в &#39; Группа обработки списка событий &#39; под &#39; инструменты. &#39; 
	Примечание: Для создания супер решена изображения интегрированные программные инструменты системы, используемые в данном исследовании были заняты. Однако, описанные супер резолюции изображений может быть выполнена на любой другой системе локализации на основе одной молекулы, и данные могут обрабатываться с открытым исходным кодом программного обеспечения инструменты как гроза 17.</li>
</ol> 4. Платиновый затенение <ol><li>удаления кремния полосы и добавить каплю PBS недалеко от края пластины поднять его вверх от Петри. Промойте пластины 2 x 2 мин в PBS, то пост исправить ее с 0.1% глютаральдегид в PBS для 5 минут промыть 2 x 2 мин/мыть в PBS.</li>
	<li>Инкубировать вафельные дважды за 5 мин/инкубации в 1 капле метилцеллюлоза 2% в воде на льду. Вставьте вафля в пластиковых пробирок и центрифуги на 14 100 x g для 90 s. горе его на заготовка SEM алюминия с проведением углерода цемента.</li>
	<li>Добавить слой от 2 до 10 Нм платины/углерода на образце, роторный затенение на 8° с помощью электрона луча параметры устройства испарения: 1.55 кв, 55 мА, 0,3 Нм/s и угол 8°, вращение уровень 4.</li>
</ol> 5. Сканирующая электронная микроскопия <ol><li>изображения секций с сканирование электрона мicroscope на 1,5 кв, 2 мм рабочих расстояние и с в объектив детектор средних электронов.</li>
</ol> 6. Выравнивание света и электронной микроскопии изображений <ol><li>Открыть обоих типов изображений с 18 Фиджи, нажав &#34; файл | Открытые &#34;. Отрегулируйте размер холста, нажав &#34; изображение | Отрегулируйте | Размер холста &#34; и принести оба изображения в стек, нажав &#34; изображение | Стеки | Изображения в стек &#34;. Сохранить как тип файла tiff стек.</li>
	<li>В Фиджи, откройте новый интерфейс TrackEM2 19, нажав &#34; файл | новый | TrackEM2 (новый) &#34;. Импорт стек с оба изображения, щелкнув правой кнопкой мыши на окне черный и выбрав &#34; импорта стека &#34;.</li>
	<li>Выравнивание свет микроскопия image для электронной микроскопии изображений вручную с ориентиров, с помощью щелчка правой кнопкой мыши на изображении и выбрав &#34; выровнять | Выровнять слой вручную с достопримечательностями &#34;.
	<ol><li>Выбрать выберите инструмент (черная стрелка) для добавления достопримечательностей. Используйте форму ядер как ссылку для выбора же края в обоих изображений (дополнительный рис. 1). Добавьте несколько пунктов (минимум три точки должны быть выбраны). Применить выравнивание с Аффинная модель правой мышью, нажав кнопку и выбрав &#34; применить преобразование | Аффинная модель &#34;.</li>
	</ol></li> <li>Изменить прозрачность слоя (см. дополнительный рис. 1), для оценки качества выравнивания.</li></ol>

<ol>
	<li>Hauser, M., Wojcik, M., Kim, D., Mahmoudi, M., Li, W., Xu, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+Super-Resolution+Microscopy:+New+Dimensions+and+New+Opportunities.">Correlative Super-Resolution Microscopy: New Dimensions and New Opportunities.</a> Chem Rev. , (2017).</li><li>Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+fluorophores+for+optimal+performance+in+localization-based+super-resolution+imaging.">Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging.</a> Nat Methods. 8 (12), 1027-1036 (2011).</li><li>F&#246;lling, J., Bossi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+nanoscopy+by+ground-state+depletion+and+single-molecule+return.">Fluorescence nanoscopy by ground-state depletion and single-molecule return.</a> Nat Methods. 5 (11), 943-945 (2008).</li><li>Betzig, E., Patterson, G. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution.">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science (New York, N.Y.). 313 (5793), 1642-1645 (2006).</li><li>Kopek, B. G., Shtengel, G., Grimm, J. B., Clayton, D. A., Hess, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+photoactivated+localization+and+scanning+electron+microscopy.">Correlative photoactivated localization and scanning electron microscopy.</a> PLOS one. 8 (10), e77209 (2013).</li><li>Paez-Segala, M. G., Sun, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fixation-resistant+photoactivatable+fluorescent+proteins+for+CLEM.">Fixation-resistant photoactivatable fluorescent proteins for CLEM.</a> Nat Methods. 12 (3), 215-218 (2015).</li><li>Narayan, K., Subramaniam, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focused+ion+beams+in+biology.">Focused ion beams in biology.</a> Nat Methods. 12 (11), 1021-1031 (2015).</li><li>Tokuyasu, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunochemistry+on+ultrathin+frozen+sections.">Immunochemistry on ultrathin frozen sections.</a> Histochem J. 12 (4), 381-403 (1980).</li><li>Suleiman, H., Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+protein+architecture+of+the+kidney+glomerular+basement+membrane.">Nanoscale protein architecture of the kidney glomerular basement membrane.</a> eLife. 2, e01149 (2013).</li><li>Kopek, B. G., Shtengel, G., Xu, C. S., Clayton, D. A., Hess, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+3D+superresolution+fluorescence+and+electron+microscopy+reveal+the+relationship+of+mitochondrial+nucleoids+to+membranes.">Correlative 3D superresolution fluorescence and electron microscopy reveal the relationship of mitochondrial nucleoids to membranes.</a> Proc Nat Acad Sci U S A. 109 (16), 6136-6141 (2012).</li><li>Avanesov, A., Malicki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+retina+in+the+zebrafish+model.">Analysis of the retina in the zebrafish model.</a> Methods Cell Biol. 100, 153-204 (2010).</li><li>Bachmann-Gagescu, R., Phelps, I. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ciliopathy+gene+cc2d2a+controls+zebrafish+photoreceptor+outer+segment+development+through+a+role+in+Rab8-dependent+vesicle+trafficking.">The ciliopathy gene cc2d2a controls zebrafish photoreceptor outer segment development through a role in Rab8-dependent vesicle trafficking.</a> Hum Mol Gen. 20 (20), 4041-4055 (2011).</li><li>Bachmann-Gagescu, R., Dona, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ciliopathy+Protein+CC2D2A+Associates+with+NINL+and+Functions+in+RAB8-MICAL3-Regulated+Vesicle+Trafficking.">The Ciliopathy Protein CC2D2A Associates with NINL and Functions in RAB8-MICAL3-Regulated Vesicle Trafficking.</a> PLOS Gen. 11 (10), e1005575 (2015).</li><li>Mateos, J. M., Guhl, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topographic+contrast+of+ultrathin+cryo-sections+for+correlative+super-resolution+light+and+electron+microscopy.">Topographic contrast of ultrathin cryo-sections for correlative super-resolution light and electron microscopy.</a> Sci Rep. 6, 34062 (2016).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2000).</li><li>Thompson, R. E., Larson, D. R., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precise+nanometer+localization+analysis+for+individual+fluorescent+probes.">Precise nanometer localization analysis for individual fluorescent probes.</a> Biophys J. 82 (5), 2775-2783 (2002).</li><li>Ovesn&#253;, M., K&#345;&#237;&#382;ek, P., Borkovec, J., Svindrych, Z., Hagen, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ThunderSTORM:+a+comprehensive+ImageJ+plug-in+for+PALM+and+STORM+data+analysis+and+super-resolution+imaging.">ThunderSTORM: a comprehensive ImageJ plug-in for PALM and STORM data analysis and super-resolution imaging.</a> Bioinformatics. 30 (16), 2389-2390 (2014).</li><li>Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Cardona, A., Saalfeld, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TrakEM2+software+for+neural+circuit+reconstruction.">TrakEM2 software for neural circuit reconstruction.</a> PLOS one. 7 (6), e38011 (2012).</li><li>Wurm, C. A., Neumann, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+distribution+of+mitochondrial+import+receptor+Tom20+is+adjusted+to+cellular+conditions+and+exhibits+an+inner-cellular+gradient.">Nanoscale distribution of mitochondrial import receptor Tom20 is adjusted to cellular conditions and exhibits an inner-cellular gradient.</a> Proc Nat Acad Sci U S A. 108 (33), 13546-13551 (2011).</li><li>Slot, J. W., Geuze, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryosectioning+and+immunolabeling.">Cryosectioning and immunolabeling.</a> Nat Prot. 2 (10), 2480-2491 (2007).</li></ol>

Авторы не имеют ничего сообщать.

Этот метод сочетает в себе супер решена белка локализации с сведения о контексте, чтобы определить точное положение белков в органеллы. Мы здесь продемонстрировать завершения эксперимента, чтобы визуализировать выражение Tom20 в наружной мембраны митохондрий, и ее связь с другими органеллы как ядра или внешних сегментов фоторецепторных в личиночной данио рерио сетчатки.
Tokuyasu крио резании требует определенной подготовки приобрести хорошо сохранившиеся разделы. Однако это метод, работающих во многих лабораториях с продемонстрировали успех21. Передача секций кремниевой пластины очень проста, и никаких особых действий предпринимать не требуется. Использование глицерина в буфере визуализации является весьма критический шаг, чтобы избежать высыхания секций. Для супер-резолюции изображений наилучшие результаты получаются при Вафля находится очень близко к стекло нижней части Петри. Полосы силиконовые помочь поддержание пластин в этом положении. Особое внимание должно быть принято при удалении полосы для того, чтобы избежать повреждения разделов.
Толщина крио секций, около 100 Нм, тоньше, чем оптическое разрешение в Z-измерение, дополнительно облегчает точность этого метода соотносится как суперразрешением микроскопии сигнал идет только от этого тонкого слоя и Сканирующий электронный микроскоп сигнал отображается топографии образца. Этот метод может также сочетаться с многоцветной изображений. Однако особое внимание необходимо принять что образец может быть imaged тех же условиях (например визуализации буфера) и кросс talk должны быть предотвращены.
Одним из недостатков метода является его двумерный подход, поскольку лишь ограниченное количество последовательных секций (около 3 до 7 в вафельных) могут быть собраны. Таким образом проекты, касающиеся анализа тома не будет идеальным. Однако это метод, который может быть применен для определения выражения протеина в любом типе ткани путем простой секционирование в образце. Мы предоставляем метод без использования агентов Классический контраст как уранила ацетат или свинца цитрата. Контраст, Платиновый затенение обеспечивает очень информативный топографических контраст, но в некоторых случаях мембраны трудно решить. Это может создать проблемы для проектов, которые, например, необходимо определить выражение белков в небольших пузырьков.
Наш протокол, основанный на Tokuyasu крио секции, использует стандартное оборудование для получения результатов коррелятивных суперразрешением и сканирующих электронных микроскопов. Простые шаги, чтобы обеспечить стабильность и воспроизводимость в подготовке образца коллекцию секций на кремниевых пластин и использование платины для контраста.

Методы определения субцеллюлярные Локализация белков и их связь с различных отсеков ячейки являются важнейшими инструментами для понимания их функции и возможности взаимодействия. Супер-резолюции микроскопии в сочетании с электронной микроскопии предоставляет такие сведения1. Микроскопия истощение земли государства следуют отдельные молекулы возвращение (GSDIM) представляет собой технологию микроскопии суперразрешением, совместим с широким спектром органических и генетически закодированный флуорофоров2 и достигает латеральное разрешение до 20 Нм 3. Включение методов с высоким разрешением, чем стандартные дифракционный микроскопии улучшает точность корреляции4,5,6. Рекомендуется для достижения наилучшего соотношения белков с конкретным субцеллюлярные отсека и уменьшить объем неопределенности7 использование того же раздела ультратонких для света и электронной микроскопии. Среди различных методов, резания Tokuyasu крио раздел протокол не требует обезвоживания или встраивание смолы и, Кроме того, сохраняет антигенностью многих эпитопов и обеспечивает хорошие ткани Ультраструктура8. Несколько методов продемонстрировали применимость этих разделов в коррелятивном света и электронной микроскопии (Клем)4,5,9,10.
Данио рерио сетчатки является полезной моделью для изучения визуальной разработки и механизмов болезней человека, учитывая его высоко сохраняется структура и функции различных позвоночных. В частности, сетчатки фоторецепторов отображения той же архитектуры как млекопитающих фоторецепторов, с базальной синапса, apico-basally удлиненные ядра, кластеризация митохондрий в сегменте более апикальной внутренний и наружный сегмент состоит из мембраны диски в наиболее апикальной позиция11. Локализация белков различных сотовых отделений, сохраняемой между данио рерио и человека, позволяя исследование биологической функции человека болезни соответствующих белков12,13.
Здесь мы представляем протокол подготовить личиночной данио рерио сетчатки образцы для устранения Локализация белков митохондриальных внешней мембраны Tom20 коррелятивных суперразрешением света и электронной микроскопии. Метод основан на сборе крио разделы на кремниевых пластин и получение контраст по топографической информации производится после нанесения тонкого слоя платины. Эти шаги являются четкие технические усовершенствования с точки зрения удобства использования, воспроизводимость и время выполнения экспериментов. Недавно мы продемонстрировали применимость метода для обнаружения ядерной поры и митохондриальных протеинов в мыши ткани14.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde EM Grade</td>
			<td>EMS, USA</td>
			<td>#16220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cacodylate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>#8.20670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#886-86-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose, peqGOLD Universal</td>
			<td>VWR International GmbH</td>
			<td>35-1020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat embedding molds</td>
			<td>BEEM Flat</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Local food brand gelatin</td>
			<td>Dr.Oetker</td>
			<td>Extra Gold</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Merck</td>
			<td>#1.07687</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylcellulose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#M-6385</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#G-7126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin type B</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#G-6650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>#A6588.0050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon wafer</td>
			<td>Si-Mat Silicon Materials</td>
			<td></td>
			<td>Type: P/Boron; Orientation &#60;111&#62; ON; Growth method: CZ; Resistivity:1-30 ohm/cm; Surface: polished; Laser cut at 7 x7 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryo-pin</td>
			<td>Baltic Preparation</td>
			<td>#16701950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wired loop &#34;Perfect loop&#34;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone stripes</td>
			<td>Picodent</td>
			<td>Twinsil 22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glucoseoxidase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#G7141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>catalase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#C40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>beta-Mercaptoethylamine hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#M6500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Tom20</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>#sc - 11415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlexaFluor 647 AffiniPure F(ab&#39;)2 fragment donkey anti rabbit IgG</td>
			<td>Jackson Immuno-Research</td>
			<td>#711-606-152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>ROCHE, Switzerland</td>
			<td>#10236276001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#49782</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom petri dish</td>
			<td>Ibidi, Germany</td>
			<td>u-Dish 35mm, high glass bottom, #81158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SEM aluminium stub</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>#G301F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conducting carbon cement Leit-C</td>
			<td>Plano, Germany</td>
			<td>AG3300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond Knife (Cryo Immuno)</td>
			<td>Diatome</td>
			<td>DCIMM3520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryo-ultramicrotome</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>Leica EM FCS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Widefield-TIRF microscope GSD Leica SR GSD 3D</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>160x 1.43 TIRF objective</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>11523048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SEM - Zeiss Supra 50 VP</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Supra 50 VP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIB-SEM - Zeiss Auriga 40</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Auriga 40</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

correlative super-resolution and electron microscopy to resolve protein localization in zebrafish retina

Мы представляем метод расследовать локализация внутриклеточных белков в сетчатке личиночной данио рерио, комбинируя суперразрешением светлую микроскопию и растровая электронная микроскопия. Суб дифракционный предел резолюции возможности суперразрешением света Микроскопы позволяют улучшение точности коррелированных данных. Вкратце 110 Нм толщиной крио секции передаются кремниевой пластины и, после окрашивания иммунофлюоресценции, отражаются с суперразрешением световой микроскопии. Впоследствии разделы сохраняются в метилцеллюлоза и платины, затененных до изображений в сканирующий электронный микроскоп (SEM). Изображения из этих двух способов микроскопии легко объединяются с помощью ткани достопримечательности с открытым исходным кодом. Здесь мы описываем метод адаптированы для личинок данио рерио сетчатки. Однако этот метод применяется также для других видов организмов и тканей. Мы демонстрируем, что дополнительную информацию, полученные от этой корреляции способен решить выражение митохондриальных протеинов в связи с мембраны и макул митохондрий, а также относительно других отсеков ячейки.

Выражение протеина Tom20, субъединицы ацилкарнитин митохондриальных внешней мембраны комплекс20, определяется, в шлифов личиночной данио рерио сетчатки, супер резолюции световой микроскопии (рис. 1) и эта информация была дополнена топографических сигнала, полученные путем сканирования электронной микроскопии после Платиновый затенение те же разделы. Эти корреляционные данные подтверждают локализация протеина в ассоциации с конкретного отсека, внешней митохондриальной мембраны и, также представить информацию о соотношении белка с другие органеллы клетки.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56113/56113fig1.jpg"> 
Рисунок 1: Клем на сетчатке данио рерио. А. малое увеличение widefield образ раздела 5 dpf данио рерио сетчатки, ядер, окрашенных с DAPI (голубой). Б. сканирующая электронная микроскопия того же района. C. выше увеличение widefield изображение кадра в ядрах б. витражи с DAPI (голубой) и Tom20 митохондриальных пятнать отображается красным цветом. D. Widefield изображение же секции на увеличение. Шаблон Tom20 выражение находится в кластеры митохондрий. E. выражение из Tom20 (красные точки) определяется GSDIM микроскопии. Ядер окрашенных DAPI (голубой). F. же раздел как E объединение коррелятивных суперразрешением и растровая электронная микроскопия. Tom20 окрашивание (красные точки) появляется в митохондриальной кластера (M) в наружной мембраны митохондрий. Флуоресценции DAPI сигнала в ядрах (N) соответствует топографии SEM изображения. Г. высокое увеличение изображения кадра в F. Сканирования электронная микроскопия image предоставляет контекст для GSDIM изображения (красные точки). Митохондриальной макул ясно видны и Tom20 окрашивание локализован для наружной мембраны митохондрий. Мембраны внешнего сегмента фоторецепторов (OS) ясно разрешаются. Размер 5 пикселей изображения Нм. Масштаб бары: A, B и C: 10 мкм; D: 2 мкм; E и F: 1 мкм и G: 0,2 мкм. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56113/56113fig1large.jpg" target="_blank">пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
Дополнительный рисунок 1: выравнивание изображения света и электронной микроскопии. A. скриншот из интерфейса TrackEM2 с изображением SEM и пронумерованных достопримечательности (желтый) вдоль различных ядер. Б. скриншот из интерфейса TrackEM2 с изображением флуоресценции и пронумерованных достопримечательности (желтый) вдоль различных DAPI окрашенных ядер. Чтобы изменить прозрачность слоя может использоваться ползунков на левой верхней части меню. Линейки: 1 µm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56113/Supplementary_Figure_1.tif">пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Correlative Super-resolution and Electron Microscopy to Resolve Protein Localization in Zebrafish Retina at JoVE.com

Correlative Super-resolution and Electron Microscopy to Resolve Protein Localization in Zebrafish Retina

Этот протокол описывает необходимые шаги для получения результатов локализация внутриклеточных белков на сетчатке данио рерио, соотнося суперразрешением светлую микроскопию и сканирование электронной микроскопии изображений.

Корреляционные суперразрешением и электронной микроскопии решить локализация белка в Zebrafish сетчатки

We present a method to investigate the subcellular protein localization in the larval zebrafish retina by combining super-resolution light microscopy and ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion (FDAP)

Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion FDAP

Измерение белка стабильности в жизни у эмбрионов данио рерио с помощью флуоресцентной упадок после фотопреобразования (FDAP)

Protein stability influences many aspects of biology, and measuring the clearance kinetics of proteins can provide important insights into biological ...

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

Анализ данио рерио Личинки скелетных мышц целостности с синий краситель Эванса

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Large-scale Scanning Transmission Electron Microscopy (Nanotomy) of Healthy and Injured Zebrafish Brain

Large-scale Scanning Transmission Electron Microscopy Nanotomy of Healthy and Injured Zebrafish Brain

Крупномасштабное Сканирование просвечивающей электронной микроскопии (Nanotomy) здоровых и оскорбленные данио мозга

Large-scale 2D electron microscopy (EM), or nanotomy, is the tissue-wide application of nanoscale resolution electron microscopy. Others and we previously ...

Analysis of Zebrafish Kidney Development with Time-lapse Imaging Using a Dissecting Microscope Equipped for Optical Sectioning

Анализ развития данио почки с течением времени покадровой визуализации Использование рассекает микроскопа, оборудованного для оптического секционирования

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method ...

Using Light Sheet Fluorescence Microscopy to Image Zebrafish Eye Development

Использование Light Sheet флуоресцентной микроскопии для изображения развития данио глаз

Light sheet fluorescence microscopy (LSFM) is gaining more and more popularity as a method to image embryonic development. The main advantages of LSFM ...

Analysis of Protein-protein Interactions and Co-localization Between Components of Gap, Tight, and Adherens Junctions in Murine Mammary Glands

Анализ белково-белковых взаимодействий и ко-локализация между компонентами разрывов, затянутых и адгезивных соединений в молочных железах мышей

Cell-cell interactions play a pivotal role in preserving tissue integrity and the barrier between the different compartments of the mammary gland. These ...

Multimodal Hierarchical Imaging of Serial Sections for Finding Specific Cellular Targets within Large Volumes

Смешанных иерархических изображений последовательных секций для нахождения конкретных клеточных мишеней в больших объемах

Targeting specific cells at ultrastructural resolution within a mixed cell population or a tissue can be achieved by hierarchical imaging using a ...

Immunohistochemical Detection of 5-Methylcytosine and 5-Hydroxymethylcytosine in Developing and Postmitotic Mouse Retina

Иммуногистохимическое определение 5-метилцитозин и 5-Гидроксиметилцитозин в развивающихся и Постмитотические мыши сетчатки

The epigenetics of retinal development is a well-studied research field, which promises to bring a new level of understanding about the mechanisms of a ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

Визуализация узлов и Notochordal пластины в Gastrulating эмбрионов мыши, используя растровая электронная микроскопия и вся гора иммунофлуоресценции

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

A Layered Mounting Method for Extended Time-Lapse Confocal Microscopy of Whole Zebrafish Embryos

Слойный монтаж Метод для расширенного времени Lapse Конфокальная микроскопия целых эмбрионов зебрафиш

Dynamics of development can be followed by confocal time-lapse microscopy of live transgenic zebrafish embryos expressing fluorescence in specific tissues ...