Name: use of a recombinant mosquito densovirus as a gene delivery vector for the functional analysis of genes in mosquito larvae
Uploaded: 2017-10-06T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Use of a Recombinant Mosquito Densovirus As a Gene Delivery Vector for the Functional Analysis of Genes in Mosquito Larvae at JoVE.com

Forfatterne bekrefter økonomisk støtte fra National nøkkelen forskning og utvikling Program i Kina (2016YFC1200500 til Xiao-Guang Chen), National Natural Science Foundation av Kina (81672054 og 81371846), naturlige forskningsprogram Team Science Foundation i Guangdong (2014A030312016), og vitenskapelige og teknologiske programmet Guangzhou (201508020263). Vi erkjenner takknemlig Professor Jonathan Carlson (Colorado State University) for vennlig gir pUCA og p7NS1-GFP plasmider og kritisk lesing dette manuskriptet.

alle protokoller ble godkjent av den etiske komiteen av Southern medisinsk University.
 1. utforme en kunstig Intron Merk: den kunstige intron brukt i dette arbeidet er 65 bp i lengde, og rekkefølgen er 5 &#39; - GTAAGAGTCGATCGACGCGTTACTAACTGGTACCTCTTCTTTTTTTTTTGATATCCTGCAG - 3 &#39;.
<ol><li>Sett Hpa jeg begrensning nettsted på begge ender av kunstige intron så at Hpa jeg fordøyelsen kan frigi intron fra plasmider (se ...

<ol>
	<li>Tolle, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosquito-borne+diseases.">Mosquito-borne diseases.</a> Current problems in pediatric and adolescent health care. 39, 97-140 (2009).</li><li>Petersen, L. R., Jamieson, D. J., Powers, A. M., Honein, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+Virus.">Zika Virus.</a> The New England journal of medicine. 374, 1552-1563 (2016).</li><li>Roberts, D. R., Andre, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insecticide+resistance+issues+in+vector-borne+disease+control.">Insecticide resistance issues in vector-borne disease control.</a> The American journal of tropical medicine and hygiene. 50, 21-34 (1994).</li><li>Attaran, A., Roberts, D. R., Curtis, C. F., Kilama, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Balancing+risks+on+the+backs+of+the+poor.">Balancing risks on the backs of the poor.</a> Nature medicine. 6, 729-731 (2000).</li><li>Volohonsky, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+Expression+of+the+Anti-parasitic+Factor+TEP1+in+the+Malaria+Mosquito+Anopheles+gambiae.">Transgenic Expression of the Anti-parasitic Factor TEP1 in the Malaria Mosquito Anopheles gambiae.</a> PLoS pathogens. 13, 1006113 (2017).</li><li>Galizi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+synthetic+sex+ratio+distortion+system+for+the+control+of+the+human+malaria+mosquito.">A synthetic sex ratio distortion system for the control of the human malaria mosquito.</a> Nature communications. 5, 3977 (2014).</li><li>Bourtzis, K., Lees, R. S., Hendrichs, J., Vreysen, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=More+than+one+rabbit+out+of+the+hat:+Radiation,+transgenic+and+symbiont-based+approaches+for+sustainable+management+of+mosquito+and+tsetse+fly+populations.">More than one rabbit out of the hat: Radiation, transgenic and symbiont-based approaches for sustainable management of mosquito and tsetse fly populations.</a> Acta tropica. 157, 115-130 (2016).</li><li>Kumar, S. S., Puttaraju, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improvised+microinjection+technique+for+mosquito+vectors.">Improvised microinjection technique for mosquito vectors.</a> The Indian journal of medical research. 136, 971-978 (2012).</li><li>Attardo, G. M., Higgs, S., Klingler, K. A., Vanlandingham, D. L., Raikhel, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+interference-mediated+knockdown+of+a+GATA+factor+reveals+a+link+to+anautogeny+in+the+mosquito+Aedes+aegypti.">RNA interference-mediated knockdown of a GATA factor reveals a link to anautogeny in the mosquito Aedes aegypti.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 13374-13379 (2003).</li><li>Singh, A. D., Wong, S., Ryan, C. P., Whyard, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+delivery+of+double-stranded+RNA+in+larvae+of+the+yellow+fever+mosquito,+Aedes+aegypti:+implications+for+pest+mosquito+control.">Oral delivery of double-stranded RNA in larvae of the yellow fever mosquito, Aedes aegypti: implications for pest mosquito control.</a> Journal of insect science. 13, 69 (2013).</li><li>Ward, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aedes+aegypti+transducing+densovirus+pathogenesis+and+expression+in+Aedes+aegypti+and+Anopheles+gambiae+larvae.">Aedes aegypti transducing densovirus pathogenesis and expression in Aedes aegypti and Anopheles gambiae larvae.</a> Insect molecular biology. 10, 397-405 (2001).</li><li>Carlson, J., Suchman, E., Buchatsky, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Densoviruses+for+control+and+genetic+manipulation+of+mosquitoes.">Densoviruses for control and genetic manipulation of mosquitoes.</a> Advances in virus research. 68, 361-392 (2006).</li><li>Barreau, C., Jousset, F. X., Bergoin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenicity+of+the+Aedes+albopictus+parvovirus+(AaPV),+a+denso-like+virus,+for+Aedes+aegypti+mosquitoes.">Pathogenicity of the Aedes albopictus parvovirus (AaPV), a denso-like virus, for Aedes aegypti mosquitoes.</a> Journal of invertebrate pathology. 68, 299-309 (1996).</li><li>Liu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+non-defective+recombinant+densovirus+vectors+for+microRNA+delivery+in+the+invasive+vector+mosquito,+Aedes+albopictus.">Development of non-defective recombinant densovirus vectors for microRNA delivery in the invasive vector mosquito, Aedes albopictus.</a> Scientific reports. 6, 20979 (2016).</li><li>Ortega, M. M., Bouamar, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+on+Designing+MicroRNA+Sponges:+From+Construction+to+Stable+Cell+Line.">Guidelines on Designing MicroRNA Sponges: From Construction to Stable Cell Line.</a> Methods in molecular biology. 1509, 221-233 (2017).</li><li>Froger, A., Hall, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+plasmid+DNA+into+E.+coli+using+the+heat+shock+method.">Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , e253 (2007).</li><li>Afanasiev, B. N., Kozlov, Y. V., Carlson, J. O., Beaty, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Densovirus+of+Aedes+aegypti+as+an+expression+vector+in+mosquito+cells.">Densovirus of Aedes aegypti as an expression vector in mosquito cells.</a> Experimental parasitology. 79, 322-339 (1994).</li><li>Hu, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+the+human-specific+microRNA+miR-941.">Evolution of the human-specific microRNA miR-941.</a> Nature communications. 3, 1145 (2012).</li><li>Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+sequencing+with+chain-terminating+inhibitors.">DNA sequencing with chain-terminating inhibitors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74, 5463-5467 (1977).</li><li>Dalby, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+transfection+with+Lipofectamine+2000+reagent:+primary+neurons,+siRNA,+and+high-throughput+applications.">Advanced transfection with Lipofectamine 2000 reagent: primary neurons, siRNA, and high-throughput applications.</a> Methods (San Diego, Calif). 33, 95-103 (2004).</li><li>Gu, J. B., Dong, Y. Q., Peng, H. J., Chen, X. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+recombinant+AeDNA+containing+the+insect-specific+toxin,+BmK+IT1,+displayed+an+increasing+pathogenicity+on+Aedes+albopictus.">A recombinant AeDNA containing the insect-specific toxin, BmK IT1, displayed an increasing pathogenicity on Aedes albopictus.</a> The American journal of tropical medicine and hygiene. 83, 614-623 (2010).</li><li>Hou, Y., Zhang, H., Miranda, L., Lin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serious+overestimation+in+quantitative+PCR+by+circular+(supercoiled)+plasmid+standard:+microalgal+pcna+as+the+model+gene.">Serious overestimation in quantitative PCR by circular (supercoiled) plasmid standard: microalgal pcna as the model gene.</a> PloS one. 5, 9545 (2010).</li><li>Ding, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+rAAV9+to+Overexpress+or+Knockdown+Genes+in+Mouse+Hearts.">Preparation of rAAV9 to Overexpress or Knockdown Genes in Mouse Hearts.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , (2016).</li></ol>

Det er viktig å overvinne to av de viktigste hindringene som begrenser rAaeDV konstruksjon. Først er produksjon av defekte rekombinant virus. Det har blitt rapportert at MDV kan brukes som en vektor uttrykke riktig størrelse utenlandske gener, som scorpion insekt-spesifikke neurotoxins20 og GFP protein; men uansett konstruksjon strategi form når ORFs MDV er satt inn eller erstattet med eksogene gener, virions ikke uavhengig med mindre en hjelper plasmider er cotransfected for å levere manglende uunnværlig virale pr...

Mygg-sykdommer som malaria, denguefeber, zika feber og gul feber, er store internasjonale folkehelseproblemer som fortsatt står for en betydelig andel av de globale infeksjonssykdommer byrde1,2. Konvensjonelle insektmidler, som har vært brukt i respons til vektorer, er en viktig komponent i bærekraftig integrert mygg strategi for forebygging av mygg-sykdommer. Men slike strategier har vist seg for å være relativt ineffektiv eller uønsket på grunn av tilknyttede negative miljøvirkninger samt utviklingen av motstand i mygg bestander3,4. For disse grunner, det er et presserende behov for alternative metoder for mygg kontroll og bruk av transgene metoder for å produsere sterilt mannlige mygg og utgivelsen av patogen-resistente mygg har oppstått som lovende nye kontroll strategier. For å utvikle effektive nye kontroll metoder, som sikker og effektiv tilnærminger i vivo gen levering, av mygg gen funksjon er nødvendig.
Direkte microinjection av plasmider DNA, dobbel strandet RNA (dsRNA) eller lite forstyrrende RNA (siRNA) er mest brukte i vivo -genet leveringsmåte i mygg. Faktisk produksjon av transgene stammer av mygg fortsatt stole på en prosess av embryoet microinjection5,6,7. Microinjection har imidlertid flere begrensninger. Først denne teknikken er teknisk krevende og innebærer kompliserte prosedyrer. Andre forårsaker injeksjon en fysisk fornærmelse til fosteret, larver, pupae og voksen, som direkte påvirker levedyktigheten til organismen mål. For det tredje er det vanskelig å nakkens Larvene for microinjection fordi de fleste bor i et akvatisk habitat og har en karakteristisk sprellende bevegelse. Fjerde, 1st-2nd skikkelsen Larvene er 10 - til 20 ganger mindre enn 4th skikkelsen og eldre larver og neglebåndene av det tidligere er mer delikat. Disse funksjonene gjør det vanskelig å manipulere 1st-2nd skikkelsen Larvene sammenlignet med de i eldre stadier. Kombinert, bidra disse faktorene til en redusert etter injeksjon overlevelse for Larvene (ca 5%) sammenlignet med voksne8. Viral-baserte levering systemer er utviklet for å overvinne den tilknyttede ekstracellulære og intracellulær barrierer. Disse systemene har fordelene med enkel manipulering, høy signaltransduksjon effektivitet, langsiktig og robust nivåer av uttrykk og evnen til å produsere vedvarende effekter i vivo. Derfor brukt genet leveringssystemer utnytte retroviruses, lentiviruses og adenoviruses har vært mye inmammalian linjer og modell arter. Sindbis viral uttrykk systemet hadde tidligere blitt brukt analysere funksjonen genet i voksen mosquito; Foruten de biosikkerhet bekymringene, men er injeksjon fortsatt nødvendig for virusinfeksjon9. Selv om muntlig levering av soaking larver i dsRNA løsningen er rapportert tidligere som en mulig leveringsmetode, er det uegnet for små RNA funksjonen analyse10. Så, effektiv viral leveringsmåter må fortsatt utvikles for myggen.
Mosquito densoviruses (MDVs) er en del av Densovirinae og Parvoviridae, og alle unntatt én ligger innenfor slekten Brevidensovirus11. MDV virions er ikke innhyllet og består av en enkelt-strandet DNA (ssDNA) genom og en icosahedral kapsid (20 nm i diameter). Viral genomet er ca 4 kb inne størrelse og replikeres i kjerner i verten cellene. MDVs er relativt stabil i miljøet og viser mange smale vert med høy spesifisitet for myggen. Disse virusene har potensial til å spre og vedvarer naturlig mygg bestander og kan invadere nesten alle organer og vev av disse insekter, inkludert midttarmen, Malpighian tubuli, fett kroppen, muskulaturen, nerveceller og spyttkjertler12.
Behold MDV genomer kan være subcloned i plasmider vektorer å produsere plasmider-baserte smittsomme kloner; Når disse Klonene leveres i mygg celler, er viral genomet er Hentet fra plasmider vektoren og smittsomme virus partikler produseres. Fordi MDV har en liten ssDNA genom, smittsomme kloner er enkelt konstruert og viral genomet kan være lett manipulert11,13. Disse egenskapene gjør MDV en verdifull agent for å undersøke mygg biologi. Men fordi nesten alle viral genomet rekkefølgen er viktig for viral spredning, etableringen av rekombinant viruset gjennom erstatning eller innsetting av utenlandske gener forårsaker tap i viral emballasje og/eller replikering evner, som skaper en barriere for utviklingen av MDVs som Gen levering vektorer. Her rapporterer vi bruker en kunstig intronic små-RNA uttrykk strategi for å utvikle en ikke-defekt rAaeDV i vivo RNA leveringssystem som har fordelene med enkel plasmider bygging og vedlikehold av en funksjonell virus som kan produsere stabil og langsiktig uttrykk i vertsceller uten behov for vill-type virus. I tillegg gir denne metoden enkel Albin på larvene.
Protokollene for fremgangsmåten er beskrevet i denne studien: 1) design av rAaeDVs koding en intronic liten-RNA uttrykk kassett, 2) produksjon av rekombinant viruspartikler med C6/36 emballasje cellen linje, 3) kvantitativ analyse for celle-fri rAaeDV genomet kopiere tall og 4) infeksjon i Ae. albopictus larver av direkte innføring av virus i selve vann larver habitat. Samlet vist denne arbeid at bestemte små RNAs eller mål gener kan overexpressed og slått ned i Larvene bruker utviklet MDV leveringssystem.

<table width="901">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="width:401px;height:24px;">Centrifuge machine</td>
			<td style="width:215px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">75004260</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:401px;height:21px;">Centrifuge System</td>
			<td style="width:215px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">363118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:401px;height:21px;">GeneJET Gel Extraction Kit</td>
			<td style="width:215px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">K0691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:401px;height:21px;">E.Z.N.A. Plasmid Midi Kit</td>
			<td style="width:215px;">Omega Biotech</td>
			<td style="width:119px;">D6904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:401px;height:21px;">Purified Agar</td>
			<td style="width:215px;">OXOID</td>
			<td style="width:119px;">LP0028A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:401px;height:21px;">FastAP Thermosensitive Alkaline Phosphatase (1 U/&#181;L)</td>
			<td style="width:215px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">EF0651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:401px;height:21px;">FastDigest HpaI</td>
			<td style="width:215px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">FD1034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:401px;height:21px;">FastDigest XbaI</td>
			<td style="width:215px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">FD0684</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:401px;height:21px;">T4 DNA Ligase (5 U/&#181;L)</td>
			<td style="width:215px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">EL0011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:401px;height:21px;">TransStbl3 Chemically Competent Cell</td>
			<td style="width:215px;">Beijing Transgen Biotech</td>
			<td style="width:119px;">CD521-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:401px;height:21px;">Ampicillin&#160;</td>
			<td style="width:215px;">Beijing Tiangen Biotech</td>
			<td style="width:119px;">RT501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:401px;height:21px;">Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium</td>
			<td style="width:215px;">Gibco&#65292; Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">&#160;21875109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:401px;height:21px;">Fetal Bovine Serum&#65288; Australia Origin&#65289;</td>
			<td style="width:215px;">Gibco&#65292; Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">10099141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:401px;height:21px;">penicillin/streptomycin</td>
			<td style="width:215px;">Gibco&#65292; Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">15070063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="width:401px;height:23px;">Lipofectamine 2000 Transfection Reagent</td>
			<td style="width:215px;">&#160;Invitrogen&#65292;Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">11668019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:401px;height:21px;">Proteinase K</td>
			<td style="width:215px;">Promega</td>
			<td>MC5008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:401px;height:21px;">DNase I (RNase-free)</td>
			<td style="width:215px;">&#160;Invitrogen&#65292;Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">AM2222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:401px;height:21px;">SuperReal PreMix Plus (SYBR Green)</td>
			<td style="width:215px;">Beijing Tiangen Biotech</td>
			<td style="width:119px;">FP205</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of a recombinant mosquito densovirus as a gene delivery vector for the functional analysis of genes in mosquito larvae

I vivo microinjection er mest brukte genet overføring teknikken for å analysere genet funksjonene i individuelle mygg. Men denne metoden krever en mer teknisk krevende operasjon og innebærer kompliserte prosedyrer, spesielt når de brukes i Larvene deres liten størrelse, relativt tynt og skjøre cuticle og høy dødelighet, som begrenser anvendelsen. Derimot er viral vektorer for gen levering utviklet for å overvinne ekstracellulære og intracellulær barrierer. Disse systemene har fordelene med enkel manipulering, høy genet signaltransduksjon effektivitet, langsiktig vedlikehold av genuttrykk og evnen til å produsere vedvarende effekter i vivo. Mosquito densoviruses (MDVs) er mygg-spesifikke, liten én-strandet DNA virus som kan effektivt levere utenlandsk nukleinsyrer til mygg celler. imidlertid fører erstatning eller innsetting av utenlandske gener å opprette rekombinant virus vanligvis til tap av emballasje og/eller replikering evner, som er et hinder for utviklingen av disse virusene som levering vektorer.
Her rapporterer vi bruker en kunstig intronic små-RNA uttrykk strategi for å utvikle en ikke-defekt rekombinant Aedes aegypti densovirus (AaeDV) i vivo leveringssystem. Detaljerte fremgangsmåter, emballasje og kvantitativ analyse av rAaeDV vektorer og larver infeksjon er beskrevet.
Denne studien viser, for første gang, muligheten for å utvikle en ikke-defekt rekombinant MDV micro RNA (miRNA) uttrykk system, og dermed gir et kraftig verktøy for funksjonell analyse av gener i mygg og etablere et grunnlag for den anvendelse av viral paratransgenesis for å kontrollere mygg-sykdommer. Vi viste at Aedes albopictus 1st skikkelsen Larvene kan være enkelt og effektivt infisert av introdusere viruset i vannmassen næringsplante avl området og at den utviklet rAaeDVs kan brukes overexpress eller slå ned på uttrykk med et bestemt mål i larvene, gir et verktøy for funksjonsanalyse av mosquito gener.

Strategier for rAaeDV bygging En defekt rAaeDV vektor ble generert for å uttrykke DsRed genet i larvene. Den resulterende plasmider inneholdt en NS1-DsRed fusion protein kassett med VP protein slettet (figur 1A). rAaeDV plasmider som inneholder uttrykket konstruksjoner for miRNA, ble miRNA svamp, shRNA og amiRNA utformet (vist i figur 1B). For eksempel ble en rAaeDV vektor ge...

Watch this Scientific Journal Video about Use of a Recombinant Mosquito Densovirus As a Gene Delivery Vector for the Functional Analysis of Genes in Mosquito Larvae at JoVE.com

Use of a Recombinant Mosquito Densovirus As a Gene Delivery Vector for the Functional Analysis of Genes in Mosquito Larvae

Bruk av en rekombinant Mosquito Densovirus som et gen levering vektor for funksjonell analyse av gener i Larvene

Vi rapporterer bruker en kunstig intronic liten RNA uttrykk strategi for å utvikle en ikke-defekt rekombinant Aedes aegypti densovirus (AaeDV) i vivo leveringssystem. En detaljert prosedyre for konstruksjon, emballasje og kvantitativ analyse av rAaeDV vektorer så vel som for larver infeksjon er beskrevet.

In vivo microinjection is the most commonly used gene transfer technique for analyzing the gene functions in individual mosquitoes. However, this method ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Differentiation of a Human Neural Stem Cell Line on Three Dimensional Cultures, Analysis of MicroRNA and Putative Target Genes

Differensiering av Human Neural Stem Cell Line on tredimensjonal kulturer, Analyse av mikroRNA og Antatte målgener

Neural stem cells (NSCs) are capable of self-renewal and differentiation into neurons, astrocytes and oligodendrocytes under specific local ...

Mosaic Zebrafish Transgenesis for Functional Genomic Analysis of Candidate Cooperative Genes in Tumor Pathogenesis

Mosaic Sebrafisk transgenesis for Funksjonell Genomisk Analyse av søker Cooperative Gener i Tumor Patogenese

Comprehensive genomic analysis has uncovered surprisingly large numbers of genetic alterations in various types of cancers.  To robustly and efficiently ...

Capturing Tissue Repair in Zebrafish Larvae with Time-lapse Brightfield Stereomicroscopy

Fange Tissue Repair i Sebrafisk Larver med Time-lapse Lysfelt stereomikros

The zebrafish larval tail fin is ideal for studying tissue regeneration due to the simple architecture of the larval fin-fold, which comprises of two ...

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

Analyse av Sebrafisk Larver Skeletal Muscle Integrity med Evans blå Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae

Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae

Metoder for å undersøke lymfekjertel og Hemocytes i<em&gt; Drosophila</em&gt; Larver

Many parallels exist between the Drosophila and mammalian hematopoietic systems, even though Drosophila lack the lymphoid lineage that characterize ...

Rapid Isolation of BMPR-IB+ Adipose-Derived Stromal Cells for Use in a Calvarial Defect Healing Model

Rapid Isolering av BMPR-IB + adipose-avledet stromale celler for bruk i en Calvarial Defect Healing Model

Invasive cancers, major injuries, and infection can cause bone defects that are too large to be reconstructed with preexisting bone from the patient's own ...

Hypoxic Preconditioning of Marrow-derived Progenitor Cells As a Source for the Generation of Mature Schwann Cells

Hypoksisk forbehandling av margenavledede progenitorceller som kilde for generering av modne Schwann-celler

This manuscript describes a means to enrich for neural progenitors from the marrow stromal cell (MSC) population and thereafter to direct them to the ...

A Method for Characterizing Embryogenesis in Arabidopsis

A Method for Characterizing Embryogenesis in Arabidopsis

En metode for å karakterisere Embryogenesis i Arabidopsis

Given the highly predictable nature of their development, Arabidopsis embryos have been used as a model for studies of morphogenesis in plants. However, ...

A Novel Use of Three-dimensional High-frequency Ultrasonography for Early Pregnancy Characterization in the Mouse

Romanen bruk av tredimensjonal høyfrekvente Ultrasonography for tidlig Graviditet karakterisering musen

High-frequency ultrasonography (HFUS) is a common method to non-invasively monitor the real-time development of the human fetus in utero. The mouse is ...

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

Generasjon av stillaset-fri, tredimensjonale Insulin uttrykke Pancreatoids fra musen bukspyttkjertelen Progenitors In Vitro

The pancreas is a complex organ composed of many different cell types that work together to regulate blood glucose homeostasis and digestion. These cell ...