Name: utilization of capsules for negative staining of viral samples within biocontainment
Uploaded: 2017-07-19T14:00:00
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Gostaríamos de agradecer e agradecer ao Dr. John Carra e Rowena Schokman pelo fornecimento de Nano-VLP Ebola purificados, Dr. Rajini Mudhasani por fornecer o vírus Chikungunya e Dr. Charles (Jason) Shoemaker por fornecer VLP de Leucemia Murina que expressa glicoproteínas de Ebolavirus. Também gostaríamos de agradecer MAJ Carl Soffler por facilitar o Programa de Estágio de Verão (SIP) e o Programa de Aprendizagem de Ciência e Engenharia (SEAP) e a Dra. Catherine Wilhelmsen para o treinamento em segurança de laboratório.

1. Preparação da experiência em um ambiente BSL-2 antes de trabalhar com as amostras de vírus <ol><li> Prepare ou compre Formvar e placas de cobre TEM revestidas de carbono, geralmente 200-400 mesh. </li><li> Insira as grades TEM revestidas em cápsulas. <ol><li> Use uma lente ampliada para tornar este processo fácil de executar. Uma ou duas grades podem ser inseridas em cada cápsula. As cápsulas pré-carregadas podem ser compradas para eliminar este passo, se desejado. </li></ol></li><li> Tran...

<ol>
	<li>Gentile, M., Gelderblom, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+microscopy+in+rapid+viral+diagnosis:+an+update.">Electron microscopy in rapid viral diagnosis: an update.</a> New Microbiol. 37 (4), 403-422 (2014).</li><li>Kruger, D. H., Schneck, P., Gelderblom, H. 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H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+thermostable,+chromatographically+purified+Ebola+nano-VLP+vaccine.">A thermostable, chromatographically purified Ebola nano-VLP vaccine.</a> J Transl Med. 13, 228 (2015).</li><li>Rein, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+leukemia+viruses:+objects+and+organisms.">Murine leukemia viruses: objects and organisms.</a> Adv Virol. , 403419 (2011).</li><li>Barland, M., Rojkind, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Negative+staining+with+osmium+tetroxide+vapour.">Negative staining with osmium tetroxide vapour.</a> Nature. 212 (5057), 84-85 (1966).</li></ol>

A coloração negativa é uma técnica TEM valiosa para avaliação e dimensionamento de vírus, complexos de proteínas e nanopartículas. A preparação de gotículas destes espécimes por movimentação manual de grades de reagente a manchas negativas tem sido o protocolo clássico há mais de meio século. É um processo simples, mas requer experiência adquirida através do treinamento para conclusão bem-sucedida. A excelente coloração negativa ainda é considerada um conjunto de habilidades state-of-the-art e a...

A microscopia eletrônica de transmissão (TEM) é uma ferramenta eficaz para visualizar a morfologia e a ultraestrutura de espécimes biológicos que são muito pequenos para serem vistos com um microscópio de luz tradicional 1 , 2 , 3 , 4 . Os TEMs disparam elétrons através de um espécimen muito fino produzindo uma imagem de maior resolução, pois os elétrons têm um comprimento de onda muito menor do que a luz. As regiões da amostra que dobram ou bloqueiam elétrons aparecem escuras, enquanto as regiões que são elétron lucent aparecem brancas. A falta de matéria densa por elétrons torna os vírus difíceis de visualizar sob um TEM porque eles não podem espalhar elétrons. A coloração negativa é o método mais comum usado para criar contraste e visualizar vírus com TEM. O primeiro procedimento de coloração negativa foi proposto por Brenner e Horne em 1959, com base em um experimento onde Hall (1955) e Huxley (1957) observaramO aparecimento de estruturas biológicas em contraste inverso quando imerso em uma substância densamente elétrica 5 . O processo de coloração negativa foi praticamente inalterado ao longo do último meio século. A coloração negativa envolve a aplicação sucinta de uma solução de sal de metal pesado a uma amostra em uma grade TEM na tentativa de cercar o vírus com material denso sem infiltrar o vírus 6 . Isso cria uma borda escura e revela a forma da partícula 5 . Este estudo utiliza dois reagentes para coloração negativa, acetato de uranilo (UA) e ácido fosfotendssico de potássio (PTA). Ambas as manchas são comumente usadas para manchar negativamente pequenas amostras biológicas, como vírus, complexos de proteínas e nanopartículas 7 , 8 , 9 . A técnica de coloração negativa convencional é a tecnologia manual de coloração negativa de gotículasNique 7 . Este método requer manuseio preciso de grades TEM pequenas e frágeis com fórceps para aplicar pequenas quantidades de amostra de vírus, manchas e enxaguamentos. O protocolo de preparação típico envolve a aplicação de uma gota de suspensão de amostra na superfície de uma grade de TEM revestida por película ( Figura 1A ). Após a anexação da amostra à superfície do filme, a grade é enxaguada para remover vírus não aderentes e corada com UA ou PTA por alguns segundos a um minuto, dependendo do tipo de amostra. O excesso de líquido é perverso para fora da grade, tocando um pedaço de papel de filtro na borda da grade. O método de gota manual exige que cada grade seja feita individualmente. Se não for manuseado com cuidado, as grades de TEM revestidas são facilmente perfuradas, dobradas ou contaminadas. O processamento de múltiplas amostras pode levar a dificuldades no rastreamento das redes e na garantia de coloração consistente para cada amostra. Este procedimento de coloração manual é muito maisÉ difícil quando conduzido nos laboratórios de biocombustível (BSL) -3 e -4 biocontainment, devido ao equipamento de proteção pessoal (PPE) necessário para esses ambientes. O PPE é pesado e o ambiente de biocontainment é muito mais turbulento em comparação com um laboratório regular. O pessoal que trabalha nos laboratórios de biocontainment da BSL-3 é obrigado a usar 2 pares de luvas e trabalhar em um gabinete de biossegurança (BSC). Esta dupla camada de luvas reduz a sensibilidade tátil e restringe os movimentos finos do motor. O fluxo de ar do BSC que protege o usuário e ajuda a prevenir a contaminação da amostra pode fazer com que as amostras e as manchas secam muito rapidamente, afetando assim a qualidade da mancha. O forte fluxo de ar turbulento no BSC também pode destruir rapidamente uma grade que não está bem protegida. Nos laboratórios BSL-4 biocontainment, existem requisitos de segurança adicionais. O pessoal é obrigado a usar um traje de pressão positiva, o que restringe os movimentos físicos e a capacidade de ver e manipular claramenteGrades ulate. O técnico que trabalha no BSL-4 também usa pelo menos 2 pares de luvas, sendo o par externo uma luva grossa que reduz consideravelmente a destreza e a sensação tátil. Finalmente, as pinças usadas para lidar com grades TEM são afiadas, representando um risco para o técnico devido à sua capacidade de perfurar luvas. Com cápsulas contendo grades, fórceps não são necessárias, proporcionando assim uma alternativa segura e sem pinça para manipular grades em biocontainment. Finalmente, as cápsulas também fornecem uma maneira eficaz de armazenar grades durante o processamento, descontaminação de vapor de osmium e durante o armazenamento; Mantendo as redes organizadas e protegidas contra danos. Neste relatório, apresentamos um novo método para grades TEM de coloração negativa em laboratórios de biocontainment que utilizam cápsulas mPrep / g, um dispositivo baseado em cápsulas para manuseio e coloração de grade 10 , 11 , 12 . O acompanhamento da cápsulaModifica duas redes TEM, minimiza o manejo direto e reduz o potencial de danos na grade. A cápsula se liga diretamente a uma pipeta de um ou vários canais da mesma maneira que uma ponta de pipeta, permitindo a aplicação de vários líquidos a grades contidas. Isso permite a preparação simultânea de múltiplas amostras com grades duplicadas ( Figura 1B ). Para a mancha negativa com cápsulas, a amostra de vírus é aspirada na cápsula e mantida durante 10 min para permitir que os vírus se adsorvem nas superfícies da grade. As redes com vírus adsorvido são subsequentemente lavadas com água desionizada (dI) e coradas com UA ou PTA durante alguns segundos a 1 min. Este processo usa os mesmos passos do protocolo e reagentes como o método manual de gotículas; A diferença é que todo o trabalho ocorre dentro da cápsula sem manipulação física das grades. ( Figuras 1C , 1D ). O objetivo deste estudo foi avaliar as cápsulas comoUm novo método para coloração negativa de amostras de vírus em ambientes de biocontainment. Este estudo também examinou a qualidade das imagens TEM produzidas a partir de dois procedimentos de inativação de vírus diferentes: 1) inativação rápida, com 1% de vapor de tetróxido de ósmio e 2) inativação de 24 h com 2% de glutaraldeído. Ambos foram conduzidos usando as cápsulas. Finalmente, avaliamos duas manchas negativas de uso comum, UA e PTA, para uso na cápsula. 13

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="590">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Formvar/carbon coated TEM grids</td>
			<td style="width:71px;">SPI</td>
			<td style="width:119px;">3420C-MB</td>
			<td style="width:167px;">200 mesh Cu Pk/100</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">mPrep/g capsules</td>
			<td style="width:71px;">EMS</td>
			<td style="width:119px;">85010-01</td>
			<td>box</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">mPrep/g couplers</td>
			<td style="width:71px;">EMS</td>
			<td style="width:119px;">85010-11</td>
			<td>standard 16/Pk</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">glutaraldehdyde</td>
			<td style="width:71px;">EMS</td>
			<td style="width:119px;">16320</td>
			<td>50% solution, EM grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Osmium Tetroxide</td>
			<td style="width:71px;">EMS</td>
			<td style="width:119px;">19190</td>
			<td>4% aqueous solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Uranyl Acetate</td>
			<td style="width:71px;">EMS</td>
			<td style="width:119px;">22400</td>
			<td>powder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Potassium phosphotungstic acid</td>
			<td style="width:71px;">EMS</td>
			<td style="width:119px;">19500</td>
			<td>powder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">filter paper</td>
			<td style="width:71px;">Whatman</td>
			<td style="width:119px;">1450-090</td>
			<td>size 50</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Tranmission Electron Microscope</td>
			<td style="width:71px;">JEOL</td>
			<td style="width:119px;">JEM-1011</td>
			<td>TEM</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

utilization of capsules for negative staining of viral samples within biocontainment

A microscopia eletrônica de transmissão (TEM) é usada para observar a ultraestrutura de vírus e outros agentes patogênicos microbianos com resolução nanométrica. A maioria dos materiais biológicos não contém elementos densos capazes de espalhar elétrons para criar uma imagem; Portanto, uma mancha negativa, que coloca sais densos de metais pesados ​​em torno da amostra, é necessária. Para visualizar vírus em suspensão sob o TEM, eles devem ser aplicados em grades pequenas revestidas com uma superfície transparente apenas nanômetros de espessura. Devido ao seu pequeno tamanho e fragilidade, essas redes são difíceis de manusear e movimentadas facilmente pelas correntes de ar. A superfície fina é facilmente danificada, deixando a amostra difícil ou impossível de imagem. Os vírus infecciosos devem ser tratados em um gabinete de biossegurança (BSC) e alguns exigem um ambiente de laboratório de biocontainment. A coloração de vírus em níveis de biossegurança (BSL) -3 e -4 é especialmente desafiadora porque esses ambientes são mais turbulentos e técnicos são necessários tUsar equipamento de proteção pessoal (PPE), que diminui a destreza. Neste estudo, avaliamos um novo dispositivo para auxiliar nos vírus de coloração negativos no biocontainment. O dispositivo é uma cápsula que funciona como uma ponta especializada de pipeta. Uma vez que as grelhas são carregadas na cápsula, o usuário simplesmente aspira reagentes na cápsula para entregar o vírus e manchas na grade encapsulada, eliminando assim o uso do usuário de grades. Embora esta técnica tenha sido projetada especificamente para uso em BSL-3 ou -4 biocontainment, ela pode facilitar a preparação da amostra em qualquer ambiente de laboratório, permitindo uma coloração negativa fácil de vírus. Este mesmo método também pode ser aplicado para preparar espécimes TEM corados negativamente de nanopartículas, macromoléculas e espécimes semelhantes.

O método da cápsula produz uma coloração negativa de boa qualidade para imagens TEM: Primeiro, avaliamos a qualidade das imagens geradas usando tanto o método manual da gota e os métodos da cápsula para coloração negativa do ebolavírus do Zaire. Os ebolavírus são membros da família Filoviridae , juntamente com o vírus Marburg. O ebolavírus é tipicamente de 80 a 100 nm de diâmetro e pode ter mais de 1000 ...

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Utilization of Capsules for Negative Staining of Viral Samples within Biocontainment

Este protocolo fornece instruções para amostras de vírus de coloração negativa que podem ser facilmente usadas em laboratórios BSL-2, -3 ou -4. Inclui o uso de uma cápsula de processamento inovadora, que protege a grade de microscopia eletrônica de transmissão e fornece ao usuário um tratamento mais fácil nos ambientes mais turbulentos dentro da biocontainment.

Utilização de Cápsulas para Coloração Negativa de Amostras Viral dentro de Biocontenimento

Transmission electron microscopy (TEM) is used to observe the ultrastructure of viruses and other microbial pathogens with nanometer resolution. Most ...

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