Name: utilization of capsules for negative staining of viral samples within biocontainment
Uploaded: 2017-07-19T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Utilization of Capsules for Negative Staining of Viral Samples within Biocontainment at JoVE.com

Мы хотели бы выразить признательность и благодарность д-ру Джону Карре и Ровене Шокман за предоставление очищенных нано-VLP Эбола, доктора Раджини Мудхасани за предоставление вируса Чикунгунья и д-ра Чарльза (Джейсона) Шумейкера за предоставление VLP из мышиной лейкемии, выражающих гликопротеины Эболавируса. Мы также хотели бы поблагодарить МАЯ Карла Соффлера за содействие Программе летней стажировки (SIP) и Программе обучения в области науки и техники (SEAP) и доктору Кэтрин Вильгельмсен за обучение в области безопасности лабораторий.

1. Подготовка эксперимента в среде BSL-2 до работы с образцами вирусов <ol><li> Подготовьте или купите медные сетки TEM Formvar и углеродного покрытия, обычно 200-400 меш. </li><li> Вставьте покрытые сетки ТЕА в капсулы. <ol><li> Используйте увеличенный объектив, чтобы облегчить выполнение этого пр?...

<ol>
	<li>Gentile, M., Gelderblom, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+microscopy+in+rapid+viral+diagnosis:+an+update.">Electron microscopy in rapid viral diagnosis: an update.</a> New Microbiol. 37 (4), 403-422 (2014).</li><li>Kruger, D. H., Schneck, P., Gelderblom, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Helmut+Ruska+and+the+visualisation+of+viruses.">Helmut Ruska and the visualisation of viruses.</a> Lancet. 355 (9216), 1713-1717 (2000).</li><li>Curry, A., Appleton, H., Dowsett, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+transmission+electron+microscopy+to+the+clinical+study+of+viral+and+bacterial+infections:+present+and+future.">Application of transmission electron microscopy to the clinical study of viral and bacterial infections: present and future.</a> Micron. 37 (2), 91-106 (2006).</li><li>Goldsmith, C. S., Miller, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modern+uses+of+electron+microscopy+for+detection+of+viruses.">Modern uses of electron microscopy for detection of viruses.</a> Clin Microbiol Rev. 22 (4), 552-563 (2009).</li><li>Kiselev, N. A., Sherman, M. B., Tsuprun, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Negative+staining+of+proteins.">Negative staining of proteins.</a> Electron Microsc Rev. 3 (1), 43-72 (1990).</li><li>Brenner, S., Horne, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+negative+staining+method+for+high+resolution+electron+microscopy+of+viruses.">A negative staining method for high resolution electron microscopy of viruses.</a> Biochim Biophys Acta. 34, 103-110 (1959).</li><li>Harris, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Negative+staining+of+thinly+spread+biological+samples.">Negative staining of thinly spread biological samples.</a> Methods Mol Biol. 369, 107-142 (2007).</li><li>Bradley, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructure+of+bacteriophage+and+bacteriocins.">Ultrastructure of bacteriophage and bacteriocins.</a> Bacteriol Rev. 31 (4), 230-314 (1967).</li><li>Suzuki, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+two+negative+staining+methods+on+the+Chinese+atypical+rotavirus.">Effects of two negative staining methods on the Chinese atypical rotavirus.</a> Arch Virol. 94 (3-4), 305-308 (1987).</li><li>Benmeradi, N., Payre, B., Goodman, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Easier+and+Safter+Biological+Staining:+High+Contrast+Uranyless+Staining+of+TEM+Grids+using+mPrep/g+Capsules.">Easier and Safter Biological Staining: High Contrast Uranyless Staining of TEM Grids using mPrep/g Capsules.</a> Microsc Microanal. 21, 721 (2015).</li><li>Goodman, S. L., Wendt, K. D., Kostrna, M. S., Radi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capsule-Based+Processing+and+Handling+of+Electron+Microscopy+Specimens+and+Grids.">Capsule-Based Processing and Handling of Electron Microscopy Specimens and Grids.</a> Microscopy Today. 23 (5), 30-37 (2015).</li><li>Goodman, S. L., Kostrna, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reducing+Reagent+Consumption+and+Improving+Efficiency+of+Specimen+Fixation+and+Embedding,+Grid+Staining+and+Archiving+using+mPrep+Capsule+Processing.">Reducing Reagent Consumption and Improving Efficiency of Specimen Fixation and Embedding, Grid Staining and Archiving using mPrep Capsule Processing.</a> Microsc Microanal. 17, 174-175 (2011).</li><li>Monninger, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+viral+samples+within+biocontainment+for+ultrastructural+analysis:+Utilization+of+an+innovative+processing+capsule+for+negative+staining.">Preparation of viral samples within biocontainment for ultrastructural analysis: Utilization of an innovative processing capsule for negative staining.</a> J Virol Methods. 238, 70-76 (2016).</li><li>Rossi, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+ViroCyt(R)+Virus+Counter+for+rapid+filovirus+quantitation.">Evaluation of ViroCyt(R) Virus Counter for rapid filovirus quantitation.</a> Viruses. 7 (3), 857-872 (2015).</li><li>Carra, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+thermostable,+chromatographically+purified+Ebola+nano-VLP+vaccine.">A thermostable, chromatographically purified Ebola nano-VLP vaccine.</a> J Transl Med. 13, 228 (2015).</li><li>Rein, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+leukemia+viruses:+objects+and+organisms.">Murine leukemia viruses: objects and organisms.</a> Adv Virol. , 403419 (2011).</li><li>Barland, M., Rojkind, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Negative+staining+with+osmium+tetroxide+vapour.">Negative staining with osmium tetroxide vapour.</a> Nature. 212 (5057), 84-85 (1966).</li></ol>

Отрицательное окрашивание является ценным методом ТЕА для оценки и калибровки вирусов, белковых комплексов и наночастиц. Классификация протоколов на протяжении более полувека была составлена ​​каплеобразным составом этих образцов путем ручного перемещения сеток от реагента до от?...

Трансмиссионная электронная микроскопия (ТЕА) является эффективным инструментом для просмотра морфологии и ультраструктуры биологических образцов, которые слишком малы, чтобы их можно было увидеть с помощью обычного светового микроскопа 1 , 2 , 3 , 4 . TEM снимают электроны через очень тонкий образец, создавая изображение с более высоким разрешением, поскольку электроны имеют гораздо более короткую длину волны, чем свет. Регионы образца, которые изгибают или блокируют электроны, выглядят темными, а области, которые являются электронно-лучистыми, кажутся белыми. Отсутствие электронного плотного вещества затрудняет просмотр вирусов при ТЭМ, поскольку они не могут рассеивать электроны. Отрицательное окрашивание является наиболее распространенным методом, используемым для создания контраста и просмотра вирусов с помощью TEM. Первая отрицательная процедура окрашивания была предложена Бреннером и Хорном в 1959 году на основе эксперимента, в котором Холл (1955) и Хаксли (1957) наблюдалиПривело к появлению биологических структур в обратном контрасте при погружении в электронно-плотное вещество 5 . Процесс отрицательного окрашивания практически не изменился за последние полвека. Отрицательное окрашивание включает кратковременное применение раствора соли тяжелых металлов к образцу на сетке ТЕА в попытке окружить вирус плотным материалом без проникновения вируса 6 . Это создает темную границу и показывает форму частицы 5 . В этом исследовании используются два реагента для отрицательного окрашивания, уранилацетат (UA) и фосфовольфрамовая кислота калия (PTA). Оба эти пятна обычно используются для негативного окрашивания небольших биологических образцов, таких как вирусы, белковые комплексы и наночастицы 7 , 8 , 9 . Традиционная технология отрицательного окрашивания - это технология ручного отрицательного окрашивания капельNique 7 . Этот метод требует точной обработки небольших хрупких сеток ТЕА с помощью щипцов для нанесения небольшого количества образца вируса, пятен и полосканий. Типичный протокол подготовки включает в себя нанесение капельки суспензии образца на поверхность сетки ТЕА, покрытой пленкой ( рис. 1А ). После прикрепления образца к поверхности пленки сетку промывают для удаления неадгезивных вирусов и окрашивают либо UA, либо PTA в течение нескольких секунд до минуты, в зависимости от типа образца. Избыточная жидкость отходит от сетки, прикоснувшись к куску фильтровальной бумаги к краю сетки. Метод ручной капли требует, чтобы каждая сетка была индивидуально изготовлена. Если не обрабатывать тщательно, покрытые сетки ТЕА легко проколоты, согнуты или загрязнены. Обработка нескольких выборок может привести к затруднениям в отслеживании сеток и обеспечении согласованного окрашивания для каждого образца. Эта процедура окрашивания вручную намного больше d(BSL) -3 и -4 лаборатории по биоконцентрации, из-за необходимого средства индивидуальной защиты (СИЗ), необходимого для этих сред. СИЗ громоздка, а окружающая среда биоконцентрации гораздо более бурная по сравнению с обычной лабораторией. Персонал, работающий в лабораториях по биологическому обогащению BSL-3, должен носить 2 пары перчаток и работать в шкафу для биобезопасности (BSC). Этот двойной слой перчаток снижает тактильную чувствительность и ограничивает тонкое движение мотора. Воздушный поток BSC, который защищает пользователя и помогает предотвратить загрязнение образца, может привести к тому, что образцы и пятна высохнут слишком быстро, что повлияет на качество пятен. Сильный турбулентный поток воздуха в BSC также может быстро сдуть сетку, которая недостаточно хорошо закреплена. В лабораториях по биологическому обогащению BSL-4 существуют дополнительные требования безопасности. Персонал должен носить костюм с положительным давлением, который дополнительно ограничивает физическое перемещение и способность четко видеть и манипулироватьUlate. Техник, работающий в BSL-4, также носит по крайней мере 2 пары перчаток, а внешняя пара - толстая перчатка, которая значительно снижает ловкость и осязание. Наконец, щипцы, используемые для работы с сетками ТЕА, являются острыми, что создает риск для техников из-за их способности проколоть перчатки. С капсулами, содержащими сетки, щипцы не нужны, тем самым обеспечивая безопасную альтернативу без использования щипцов для манипулирования сетками в биоконцентрации. Наконец, капсулы также обеспечивают эффективный способ хранения сеток во время обработки, дезактивации пара осмия и во время хранения; Тем самым сохраняя сетки организованными и безопасными от повреждений. В этом отчете мы вводим новый метод для отрицательных окрашивающих сеток ТЕА в лабораториях по биологическому обогащению, в которых используются капсулы mPrep / g, капсульное устройство для обработки сетки и окрашивания 10 , 11 , 12 . Капсула вмещаетИзменяет две сетки ТЕА, сводит к минимуму прямую обработку и уменьшает вероятность повреждения сетки. Капсула прикрепляется непосредственно к одной или многоканальной пипетке таким же образом, что и наконечник пипетки, что позволяет применять различные жидкости к сеткам, содержащимся внутри. Это позволяет одновременно подготовить несколько образцов с дублирующими сетками ( рис. 1B ). К отрицательному пятну с капсулами образец вируса аспирируют в капсулу и выдерживают в течение 10 минут, чтобы вирусы адсорбировались на поверхности сетки. Затем сетки с адсорбированным вирусом промывают деионизированной (dI) водой и окрашивают либо UA, либо PTA в течение нескольких секунд до 1 мин. Этот процесс использует те же самые этапы и реагенты протокола, что и метод ручной капли; Разница в том, что вся работа происходит внутри капсулы без физической обработки сеток. ( Фиг.1С , 1D ). Целью этого исследования было оценить капсулы какНовый метод отрицательного окрашивания образцов вирусов в средах биоконцентрации. В этом исследовании также изучалось качество изображений ТЕА, полученных из двух различных процедур инактивации вирусов: 1) быстрая инактивация, 1% пара тетроксида осмия и 2) 24-процентная инактивация с 2% глутаральдегидом. Оба они проводились с использованием капсул. Наконец, мы оценили два часто используемых отрицательных пятна, UA и PTA, для использования в капсуле. 13

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="590">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Formvar/carbon coated TEM grids</td>
			<td style="width:71px;">SPI</td>
			<td style="width:119px;">3420C-MB</td>
			<td style="width:167px;">200 mesh Cu Pk/100</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">mPrep/g capsules</td>
			<td style="width:71px;">EMS</td>
			<td style="width:119px;">85010-01</td>
			<td>box</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">mPrep/g couplers</td>
			<td style="width:71px;">EMS</td>
			<td style="width:119px;">85010-11</td>
			<td>standard 16/Pk</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">glutaraldehdyde</td>
			<td style="width:71px;">EMS</td>
			<td style="width:119px;">16320</td>
			<td>50% solution, EM grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Osmium Tetroxide</td>
			<td style="width:71px;">EMS</td>
			<td style="width:119px;">19190</td>
			<td>4% aqueous solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Uranyl Acetate</td>
			<td style="width:71px;">EMS</td>
			<td style="width:119px;">22400</td>
			<td>powder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Potassium phosphotungstic acid</td>
			<td style="width:71px;">EMS</td>
			<td style="width:119px;">19500</td>
			<td>powder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">filter paper</td>
			<td style="width:71px;">Whatman</td>
			<td style="width:119px;">1450-090</td>
			<td>size 50</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Tranmission Electron Microscope</td>
			<td style="width:71px;">JEOL</td>
			<td style="width:119px;">JEM-1011</td>
			<td>TEM</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

utilization of capsules for negative staining of viral samples within biocontainment

Передаточная электронная микроскопия (TEM) используется для наблюдения ультраструктуры вирусов и других микробных патогенов с нанометровым разрешением. Большинство биологических материалов не содержат плотных элементов, способных рассеивать электроны для создания изображения; Поэтому требуется отрицательное пятно, которое помещает плотные соли тяжелых металлов вокруг образца. Чтобы визуализировать вирусы в суспензии под ТЕМ, их следует наносить на небольшие сетки, покрытые прозрачной поверхностью толщиной всего нанометров. Из-за их небольшого размера и хрупкости эти решетки трудно обрабатывать и легко перемещать воздушными потоками. Тонкая поверхность легко повреждается, оставляя образец трудным или невозможным для изображения. Инфекционные вирусы должны быть обработаны в шкафу для биобезопасности (BSC), а некоторые требуют лабораторной среды для биоконцентрации. Окрашивание вирусов на уровнях биобезопасности (BSL) -3 и -4 особенно сложно, поскольку эти среды более бурные и требуются технические специалисты tO носить средства индивидуальной защиты (СИЗ), что снижает ловкость. В этом исследовании мы оценили новое устройство, помогающее отрицательным окрашивающим вирусам в биоконцентрации. Устройство представляет собой капсулу, которая работает как специализированный наконечник пипетки. Когда сетки загружаются в капсулу, пользователь просто отсасывает реагенты в капсулу, чтобы доставлять вирус и пятна в инкапсулированную сетку, тем самым устраняя обработку пользователем сеток. Хотя этот метод был разработан специально для использования в биологическом обогащении BSL-3 или -4, он может облегчить подготовку проб в любой лабораторной среде, обеспечивая легкое отрицательное окрашивание вируса. Этот же метод может быть также применен для получения отрицательно окрашенных образцов ТЕМ наночастиц, макромолекул и аналогичных образцов.

Метод капсул дает отрицательное окрашивание хорошего качества для изображений ТЕА: Во-первых, мы оценили качество изображений, сгенерированных с использованием как ручного метода капель, так и методов капсул для отрицательного окраши...

Watch this Scientific Journal Video about Utilization of Capsules for Negative Staining of Viral Samples within Biocontainment at JoVE.com

Utilization of Capsules for Negative Staining of Viral Samples within Biocontainment

В этом протоколе содержится инструкция для образцов отрицательного окрашивания вирусов, которые могут быть легко использованы в лабораториях BSL-2, -3 или -4. Он включает в себя использование инновационной капсулы для обработки, которая защищает сетку электронной микроскопии трансмиссии и обеспечивает удобство работы пользователя в более бурных средах в рамках биоконцентрации.

Использование капсул для отрицательного окрашивания вирусных образцов в области биологического обогащения

Transmission electron microscopy (TEM) is used to observe the ultrastructure of viruses and other microbial pathogens with nanometer resolution. Most ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Development of a Negative Selectable Marker for Entamoeba histolytica

Development of a Negative Selectable Marker for Entamoeba histolytica

Развитие Отрицательные Маркер для выбора Entamoeba histolytica</em

Entamoeba histolytica is the causative agent of amebiasis and infects up to 10% of the world's population. The molecular techniques that have enabled the ...

Using a Pan-Viral Microarray Assay (Virochip) to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

Using a Pan-Viral Microarray Assay Virochip to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

Использование Пан-Вирусные Microarray анализ (Virochip), чтобы экран клинических образцов для вирусных патогенов

The diagnosis of viral causes of many infectious diseases is difficult due to the inherent sequence diversity of viruses as well as the ongoing emergence ...

Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

Проточной цитометрии анализа иммунных клеток мышей В аорты

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam ...

Isolation of Fidelity Variants of RNA Viruses and Characterization of Virus Mutation Frequency

Выделение вариантов Fidelity РНК-содержащих вирусов и характеристика вирусов Частота мутаций

RNA viruses use RNA dependent RNA polymerases to replicate their genomes. The intrinsically high error rate of these enzymes is a large contributor to the ...

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

Создание жидкого покрытые культуры поляризованный человека эпителия дыхательных путей Calu-3 ячейки по изучению клетки-хозяина в ответ на возбудителей инфекций дыхательных путей<em&gt; В пробирке</em

The  apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate  directional responses to pathogen exposure in  vivo. Thus, ideal in vitro ...

Rapid Identification of Gram Negative Bacteria from Blood Culture Broth Using MALDI-TOF Mass Spectrometry

Быстрое выявление грамотрицательных бактерий из крови культуральной жидкости Использование MALDI-TOF масс-спектрометрии

An important role of the clinical microbiology laboratory is to provide rapid identification of bacteria causing bloodstream infection. Traditional ...

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

Развитие Лиофилизированный Loop опосредованных изотермических реагенты для амплификации для обнаружения<em&gt; Coxiella burnetii</em

Coxiella burnetii, the agent causing Q fever, is an obligate intracellular bacterium. PCR based diagnostic assays have been developed for detecting C. ...

Swab Sampling Method for the Detection of Human Norovirus on Surfaces

Метод тампон Отбор проб для обнаружения человека норовирус на поверхностях

Human noroviruses are a leading cause of epidemic and sporadic gastroenteritis worldwide. Because most infections are either spread directly via the ...

Purification of Viral DNA for the Identification of Associated Viral and Cellular Proteins

Очистка вирусной ДНК для идентификации связанных вирусных и клеточных белков

The goal of this protocol is to isolate herpes simplex virus type 1 (HSV-1) DNA from infected cells for the identification of associated viral and ...

Evaluation of Zika Virus-specific T-cell Responses in Immunoprivileged Organs of Infected Ifnar1-/- Mice

Evaluation of Zika Virus-specific T-cell Responses in Immunoprivileged Organs of Infected Ifnar1-/- Mice

Оценка ответов Зика вирус специфических Т-клеток в Immunoprivileged органах зараженных Ifnar1- / - мышей

The Zika virus (ZIKV) can induce inflammation in immunoprivileged organs (e.g., the brain and testis), leading to the Guillain-Barr&#233; syndrome and ...