Name: utilization of capsules for negative staining of viral samples within biocontainment
Uploaded: 2017-07-19T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Utilization of Capsules for Negative Staining of Viral Samples within Biocontainment at JoVE.com

Vi vill erkänna och tacka Dr John Carra och Rowena Schokman för att tillhandahålla renade Ebola nano-VLP, Dr. Rajini Mudhasani för att tillhandahålla Chikungunya-virus och Dr Charles (Jason) Shoemaker för att tillhandahålla murin leukemi VLP som uttrycker Ebolavirus glykoproteiner. Vi vill också tacka MAJ Carl Soffler för att underlätta Summer Internship Programmet (SIP) och Science and Engineering Apprenticeship Programme (SEAP) och Dr. Catherine Wilhelmsen för labsäkerhetsutbildningen.

1. Experimentberedning i en BSL-2 miljö före arbetet med virusproverna <ol><li> Förbered eller köp Formvar och kolbelagda TEM koppar galler, vanligtvis 200-400 mesh. </li><li> Sätt in de belagda TEM-rutorna i kapslar. <ol><li> Använd en förstorad lins för att göra denna process enkel att utföra. Ett eller två galler kan sättas in i varje kapsel. Förladda kapslar kan köpas för att eliminera detta steg om så önskas. </li></ol></li><li> Överför kapslarna med insatta TEM-belagda galler,...

<ol>
	<li>Gentile, M., Gelderblom, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+microscopy+in+rapid+viral+diagnosis:+an+update.">Electron microscopy in rapid viral diagnosis: an update.</a> New Microbiol. 37 (4), 403-422 (2014).</li><li>Kruger, D. H., Schneck, P., Gelderblom, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Helmut+Ruska+and+the+visualisation+of+viruses.">Helmut Ruska and the visualisation of viruses.</a> Lancet. 355 (9216), 1713-1717 (2000).</li><li>Curry, A., Appleton, H., Dowsett, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+transmission+electron+microscopy+to+the+clinical+study+of+viral+and+bacterial+infections:+present+and+future.">Application of transmission electron microscopy to the clinical study of viral and bacterial infections: present and future.</a> Micron. 37 (2), 91-106 (2006).</li><li>Goldsmith, C. S., Miller, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modern+uses+of+electron+microscopy+for+detection+of+viruses.">Modern uses of electron microscopy for detection of viruses.</a> Clin Microbiol Rev. 22 (4), 552-563 (2009).</li><li>Kiselev, N. A., Sherman, M. B., Tsuprun, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Negative+staining+of+proteins.">Negative staining of proteins.</a> Electron Microsc Rev. 3 (1), 43-72 (1990).</li><li>Brenner, S., Horne, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+negative+staining+method+for+high+resolution+electron+microscopy+of+viruses.">A negative staining method for high resolution electron microscopy of viruses.</a> Biochim Biophys Acta. 34, 103-110 (1959).</li><li>Harris, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Negative+staining+of+thinly+spread+biological+samples.">Negative staining of thinly spread biological samples.</a> Methods Mol Biol. 369, 107-142 (2007).</li><li>Bradley, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructure+of+bacteriophage+and+bacteriocins.">Ultrastructure of bacteriophage and bacteriocins.</a> Bacteriol Rev. 31 (4), 230-314 (1967).</li><li>Suzuki, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+two+negative+staining+methods+on+the+Chinese+atypical+rotavirus.">Effects of two negative staining methods on the Chinese atypical rotavirus.</a> Arch Virol. 94 (3-4), 305-308 (1987).</li><li>Benmeradi, N., Payre, B., Goodman, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Easier+and+Safter+Biological+Staining:+High+Contrast+Uranyless+Staining+of+TEM+Grids+using+mPrep/g+Capsules.">Easier and Safter Biological Staining: High Contrast Uranyless Staining of TEM Grids using mPrep/g Capsules.</a> Microsc Microanal. 21, 721 (2015).</li><li>Goodman, S. L., Wendt, K. D., Kostrna, M. S., Radi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capsule-Based+Processing+and+Handling+of+Electron+Microscopy+Specimens+and+Grids.">Capsule-Based Processing and Handling of Electron Microscopy Specimens and Grids.</a> Microscopy Today. 23 (5), 30-37 (2015).</li><li>Goodman, S. L., Kostrna, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reducing+Reagent+Consumption+and+Improving+Efficiency+of+Specimen+Fixation+and+Embedding,+Grid+Staining+and+Archiving+using+mPrep+Capsule+Processing.">Reducing Reagent Consumption and Improving Efficiency of Specimen Fixation and Embedding, Grid Staining and Archiving using mPrep Capsule Processing.</a> Microsc Microanal. 17, 174-175 (2011).</li><li>Monninger, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+viral+samples+within+biocontainment+for+ultrastructural+analysis:+Utilization+of+an+innovative+processing+capsule+for+negative+staining.">Preparation of viral samples within biocontainment for ultrastructural analysis: Utilization of an innovative processing capsule for negative staining.</a> J Virol Methods. 238, 70-76 (2016).</li><li>Rossi, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+ViroCyt(R)+Virus+Counter+for+rapid+filovirus+quantitation.">Evaluation of ViroCyt(R) Virus Counter for rapid filovirus quantitation.</a> Viruses. 7 (3), 857-872 (2015).</li><li>Carra, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+thermostable,+chromatographically+purified+Ebola+nano-VLP+vaccine.">A thermostable, chromatographically purified Ebola nano-VLP vaccine.</a> J Transl Med. 13, 228 (2015).</li><li>Rein, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+leukemia+viruses:+objects+and+organisms.">Murine leukemia viruses: objects and organisms.</a> Adv Virol. , 403419 (2011).</li><li>Barland, M., Rojkind, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Negative+staining+with+osmium+tetroxide+vapour.">Negative staining with osmium tetroxide vapour.</a> Nature. 212 (5057), 84-85 (1966).</li></ol>

Negativ färgning är en värdefull TEM-teknik för att utvärdera och dimensionera virus, proteinkomplex och nanopartiklar. Droppberedning av dessa prover genom manuell flyttning av galler från reagens till negativa fläckar har varit det klassiska protokollet i mer än ett halvt sekel. Det är en enkel process, men kräver expertis som uppnåtts genom träning för framgångsrik avslutning. Utmärkt negativ färgning betraktas fortfarande som en toppmoderna färdighetssats och mycket önskad i många TEM-laboratorier...

Transmissionselektronmikroskopi (TEM) är ett effektivt verktyg för att betrakta morfologin och ultrastrukturen hos biologiska prover som är för små för att ses med ett traditionellt ljusmikroskop 1 , 2 , 3 , 4 . TEMs skjuter elektroner genom ett mycket tunt prov som producerar en högre upplösningsbild, eftersom elektroner har en mycket kortare våglängd än ljus. Regioner av provet som böjer eller blockerar elektroner verkar mörka, medan områden som är elektronlucenta framträder vita. Brist på elektronens täta materia gör att virus är svåra att se under en TEM eftersom de inte kan sprida elektroner. Negativ färgning är den vanligaste metoden för att skapa kontrast och visa virus med en TEM. Den första negativa färgproceduren föreslogs av Brenner och Horne 1959, baserat på ett experiment där Hall (1955) och Huxley (1957) observeradeVid utseendet av biologiska strukturer i omvänd kontrast när nedsänkt i ett elektrontät ämne 5 . Processen med negativ färgning har varit i stort sett oförändrad under det senaste halvan. Negativ färgning innebär kort applicering av en tungmetallsaltlösning på ett prov på ett TEM-nät i ett försök att omge viruset med tätt material utan att infiltrera viruset 6 . Detta skapar en mörk gräns och avslöjar partikelns form 5 . Denna studie använder två reagens för negativ färgning, uranylacetat (UA) och kaliumfosphotungsticsyra (PTA). Båda dessa fläckar brukar användas för att fläcka små biologiska prover negativt, såsom virus, proteinkomplex och nanopartiklar 7 , 8 , 9 . Den konventionella negativa färgningstekniken är den manuella dropp-negativa färgteknikenNique 7 . Denna metod kräver exakt hantering av små, ömtåliga TEM-nät med tång för att applicera små mängder virusprov, fläck och sköljningar. Det typiska beredningsprotokollet innefattar applicering av en dropp av provsuspension på ytan av ett filmbelagt TEM-galler ( Figur 1A ). Efter anslutning av provet till filmytan sköljs gallret för att avlägsna icke vidhäftande virus och färgas med antingen UA eller PTA i några sekunder till en minut beroende på typ av prov. Överskottsvätska är borta från gallret genom att röra ett stycke filterpapper till kanten av gallret. Den manuella droppmetoden kräver att varje galler ska tillverkas individuellt. Om de inte hanteras noggrant, kan de belagda TEM-rutorna enkelt punkteras, böjas eller förorenas. Bearbetning av flera prover kan leda till svårigheter att spåra nätet och säkerställa konsekvent färgning för varje prov. Denna manuell färgprocess är mycket mer dEffektiv vid genomförandet av biosäkerhetsnivå (BSL) -3 och -4 biokonstruktionslaboratorier, på grund av personlig skyddsutrustning (PPE) som krävs för dessa miljöer. PPE är besvärlig och biokontainerns miljö är mycket mer turbulent jämfört med ett vanligt laboratorium. Personal som arbetar i BSL-3 biokonstruktionslaboratorier måste ha 2 par handskar och arbeta i ett biosäkerhetsskåp (BSC). Detta dubbla lager av handskar minskar taktil känslighet och begränsar fina motorrörelser. Luftflödet av BSC som skyddar användaren och hjälper till att förhindra provförorening kan orsaka att prov och fläckar torkar för snabbt vilket på så sätt påverkar fläckkvaliteten. Den starka turbulenta luftflödet i BSC kan också snabbt blåsa bort ett nät som inte är väl säkrad. I BSL-4 biokonstruktionslaboratorier finns ytterligare säkerhetskrav. Personalen är skyldig att bära en positiv tryckdräkt, vilket ytterligare begränsar fysisk rörelse och förmågan att tydligt se och hanteraUlate grids. Teknikern som arbetar i BSL-4 har också minst två par handskar, varvid ytterparet är en tjock handske som kraftigt minskar fingerfärdighet och taktil känsla. Slutligen är de tångar som används för att hantera TEM-galleren skarpa, vilket därmed utgöra en risk för tekniker på grund av deras förmåga att punktera handskar. Med kapslar innehållande galler är inte tångar nödvändiga, vilket ger ett säkert, tångfritt alternativ för att manipulera galler i biokonstruktion. Slutligen tillhandahåller kapslarna också ett effektivt sätt att lagra galler under bearbetning, osmiumdampdekontaminering och under lagring; Därigenom håller nätet organiserat och säkert från skador. I denna rapport introducerar vi en ny metod för negativa färgning av TEM-gridar i biokonstruktionslaboratorier som använder mPrep / g-kapslar, en kapselbaserad anordning för gridhantering och färgning 10 , 11 , 12 . Kapseln accomModifierar två TEM-nät, minimerar direkt hantering och minskar risken för nätskador. Kapseln fästs direkt på en en- eller flerkanalig pipett på samma sätt som en pipettspets, vilket möjliggör applicering av olika vätskor till galler som ingår i. Detta möjliggör simultan förberedelse av flera prov med dubbletter ( figur 1B ). Till negativ fläck med kapslar aspireras virusprovet i kapseln och hålls i 10 minuter för att låta virusen adsorberas på gallerytorna. Risterna med adsorberat virus tvättas därefter med avjoniserat (dl) vatten och färgas med antingen UA eller PTA i några sekunder till 1 min. Denna process använder samma protokollsteg och reagens som manuell droppmetod; Skillnaden är att allt arbete inträffar inuti kapseln utan fysisk hantering av gallret. ( Figurerna 1C , 1D ). Syftet med denna studie var att utvärdera kapslar somEn ny metod för negativ färgning av virusprover i bio-miljöer. Denna studie undersökte också kvaliteten på TEM-bilder som framställts av två olika virusinaktiveringsprocedurer: 1) snabb inaktivering med 1% osmiumtetroxidånga och 2) 24 timmars inaktivering med 2% glutaraldehyd. Båda dessa utfördes med användning av kapslarna. Slutligen utvärderade vi två vanligen använda negativa fläckar, UA och PTA, för användning i kapseln. 13

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="590">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Formvar/carbon coated TEM grids</td>
			<td style="width:71px;">SPI</td>
			<td style="width:119px;">3420C-MB</td>
			<td style="width:167px;">200 mesh Cu Pk/100</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">mPrep/g capsules</td>
			<td style="width:71px;">EMS</td>
			<td style="width:119px;">85010-01</td>
			<td>box</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">mPrep/g couplers</td>
			<td style="width:71px;">EMS</td>
			<td style="width:119px;">85010-11</td>
			<td>standard 16/Pk</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">glutaraldehdyde</td>
			<td style="width:71px;">EMS</td>
			<td style="width:119px;">16320</td>
			<td>50% solution, EM grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Osmium Tetroxide</td>
			<td style="width:71px;">EMS</td>
			<td style="width:119px;">19190</td>
			<td>4% aqueous solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Uranyl Acetate</td>
			<td style="width:71px;">EMS</td>
			<td style="width:119px;">22400</td>
			<td>powder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Potassium phosphotungstic acid</td>
			<td style="width:71px;">EMS</td>
			<td style="width:119px;">19500</td>
			<td>powder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">filter paper</td>
			<td style="width:71px;">Whatman</td>
			<td style="width:119px;">1450-090</td>
			<td>size 50</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Tranmission Electron Microscope</td>
			<td style="width:71px;">JEOL</td>
			<td style="width:119px;">JEM-1011</td>
			<td>TEM</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

utilization of capsules for negative staining of viral samples within biocontainment

Transmissionselektronmikroskopi (TEM) används för att observera ultrastruktur av virus och andra mikrobiella patogener med nanometerupplösning. De flesta biologiska materialen innehåller inte täta element som kan sprida elektroner för att skapa en bild. Därför krävs en negativ fläck, som ställer täta tungmetallsalter runt provet. För att visualisera virus i suspension under TEM måste de appliceras på små galler som är belagda med en genomskinlig yta, endast nanometer tjocka. På grund av sin lilla storlek och sårbarhet är dessa nät svåra att hantera och lätt flyttas av luftströmmar. Den tunna ytan är lätt skadad, vilket gör provet svårt eller omöjligt att bilda. Infektionsvirus måste hanteras i ett biosäkerhetsskåp (BSC) och vissa kräver en biokonduktiv laboratoriemiljö. Staining-virus i biosäkerhetsnivåer (BSL) -3 och -4 är särskilt utmanande eftersom dessa miljöer är mer turbulenta och tekniker krävs tO Använd personlig skyddsutrustning (PPE), vilket minskar fingerfärdigheten. I den här studien utvärderade vi en ny apparat för att hjälpa till med negativa färgningsvirus i biokonstruktion. Enheten är en kapsel som fungerar som en special pipettspets. När gridar laddas in i kapseln, aspirerar användaren helt enkelt reagens i kapseln för att leverera viruset och fläckar till det inkapslade gallret, vilket eliminerar användarhantering av galler. Fastän denna teknik konstruerades speciellt för användning i BSL-3 eller -4 biokonstruktion, kan det underlätta provberedningen i vilken laboratoriemiljö som helst genom att möjliggöra lätt negativ färgning av virus. Samma metod kan också tillämpas för att framställa negativa färgade TEM-prover av nanopartiklar, makromolekyler och liknande prover.

Kapselmetoden ger god kvalitet negativ färgning för TEM-bildbehandling: Först utvärderade vi kvaliteten på bilder som genererades genom att använda både manuell droppmetod och kapselmetoderna för negativ färgning Zaire ebolavirus. Ebolaviruses är medlemmar av Filoviridae- familjen, tillsammans med Marburg-virus. Ebolavirus är typiskt 80 till 100 nm i diameter och kan vara över 1 000 nm i längd. Ebolavirus m?...

Watch this Scientific Journal Video about Utilization of Capsules for Negative Staining of Viral Samples within Biocontainment at JoVE.com

Utilization of Capsules for Negative Staining of Viral Samples within Biocontainment

Detta protokoll ger instruktioner för negativa färgprov som enkelt kan användas i BSL-2, -3 eller -4-laboratorier. Det innefattar användningen av en innovativ processkapsel som skyddar transmissionselektronmikroskopi gallret och ger användaren enklare hantering i de mer turbulenta miljöerna inom biokonstruktion.

Användning av kapslar för negativ färgning av virala prov inom biokonstruktion

Transmission electron microscopy (TEM) is used to observe the ultrastructure of viruses and other microbial pathogens with nanometer resolution. Most ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Development of a Negative Selectable Marker for Entamoeba histolytica

Development of a Negative Selectable Marker for Entamoeba histolytica

Utveckling av en negativ markör för Entamoeba histolytica</em

Entamoeba histolytica is the causative agent of amebiasis and infects up to 10% of the world's population. The molecular techniques that have enabled the ...

Using a Pan-Viral Microarray Assay (Virochip) to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

Using a Pan-Viral Microarray Assay Virochip to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

Med hjälp av en Pan-Viral microarray analys (Virochip) till skärm kliniska prover för virala patogener

The diagnosis of viral causes of many infectious diseases is difficult due to the inherent sequence diversity of viruses as well as the ongoing emergence ...

Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

Flödescytometrisk analys av immunceller Inom Murine artärer

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam ...

Isolation of Fidelity Variants of RNA Viruses and Characterization of Virus Mutation Frequency

Isolering av Fidelity Varianter av RNA-virus och karakterisering av virus mutationsfrekvensen

RNA viruses use RNA dependent RNA polymerases to replicate their genomes. The intrinsically high error rate of these enzymes is a large contributor to the ...

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

Att upprätta en flytande täckt kultur av polariserad Human luftvägsepitelceller Calu-3 celler för att studera svar värdcellen för luftvägspatogener<em&gt; In vitro</em

The  apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate  directional responses to pathogen exposure in  vivo. Thus, ideal in vitro ...

Rapid Identification of Gram Negative Bacteria from Blood Culture Broth Using MALDI-TOF Mass Spectrometry

Snabb identifiering av gramnegativa bakterier från Blood Culture Broth Använda MALDI-TOF masspektrometri

An important role of the clinical microbiology laboratory is to provide rapid identification of bacteria causing bloodstream infection. Traditional ...

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

Utvecklingen av lyofiliserad Loop-medie Isothermal amplifieringsreagenserna för detektion av<em&gt; Coxiella burnetii</em

Coxiella burnetii, the agent causing Q fever, is an obligate intracellular bacterium. PCR based diagnostic assays have been developed for detecting C. ...

Swab Sampling Method for the Detection of Human Norovirus on Surfaces

Pinnurvalsmetoden för påvisande av humana Norovirus på ytor

Human noroviruses are a leading cause of epidemic and sporadic gastroenteritis worldwide. Because most infections are either spread directly via the ...

Purification of Viral DNA for the Identification of Associated Viral and Cellular Proteins

Rening av virus-DNA för identifiering av associerade Viral och cellulära proteiner

The goal of this protocol is to isolate herpes simplex virus type 1 (HSV-1) DNA from infected cells for the identification of associated viral and ...

Evaluation of Zika Virus-specific T-cell Responses in Immunoprivileged Organs of Infected Ifnar1-/- Mice

Evaluation of Zika Virus-specific T-cell Responses in Immunoprivileged Organs of Infected Ifnar1-/- Mice

Utvärdering av Zika Virus-specifika T-cell svar i Immunoprivileged organ av infekterade Ifnar1- / - möss

The Zika virus (ZIKV) can induce inflammation in immunoprivileged organs (e.g., the brain and testis), leading to the Guillain-Barr&#233; syndrome and ...