Name: a simple neuronal mechanical injury methodology to study drosophila motor neuron degeneration
Uploaded: 2017-07-19T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Simple Neuronal Mechanical Injury Methodology to Study Drosophila Motor Neuron Degeneration at JoVE.com

Nous tenons à remercier tous les membres des Keller et Magie Labs de l&#39;Université Quinnipiac pour des suggestions utiles. En particulier, nous aimerions remercier Barron L. Lincoln II pour le développement de ce test de blessure au Keller Lab. Nous aimerions également remercier le baccalauréat des arts et de la science Quinnipiac Grant-In-Aid décerné à LC Keller.

1. Préparation des réactifs et de l&#39;équipement <ol><li> Préparer 1x Dissection tampon (70 mM NaCl, 5 mM de KCl, 0,02 mM de CaCl2, 20 mM de MgCl2, 10 mM de NaHCO 3, 115 mM de saccharose, 5 mM de trehalose, 5 mM de HEPES, pH 7,2). </li><li> Préparez 1x solution salée tamponnée au phosphate (PBS). </li><li> Préparez 1x PBT en utilisant 1x PBS avec 0,01% de Triton X-100. </li><li> Préparer des plaques d&#39;agar de jus de fruits. 14 En bref, mélanger 3...

<ol>
	<li>Bier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophilia,+the+golden+bug,+emerges+as+a+tool+for+human+genetics.">Drosophilia, the golden bug, emerges as a tool for human genetics.</a> Nat. Rev. Genet. 6 (1), 9-23 (2005).</li><li>Ugur, B., Chen, K., Bellen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+tools+and+assays+for+the+study+of+human+diseases.">Drosophila tools and assays for the study of human diseases.</a> Dis Model Mech. 9 (3), 235-244 (2016).</li><li>McGurk, L., Berson, A., Bonini, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+as+an+in+vivo+model+for+human+neurodegenerative+disease.">Drosophila as an in vivo model for human neurodegenerative disease.</a> Genetics. 201 (2), 377-402 (2015).</li><li>Shin, J. E., Cho, Y., Beirowski, B., Milbrandt, J., Cavalli, V., DiAntonio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+leucine+zipper+kinase+is+required+for+retrograde+injury+signaling+and+axonal+regeneration.">Dual leucine zipper kinase is required for retrograde injury signaling and axonal regeneration.</a> Neuron. 74 (6), 1015-1022 (2012).</li><li>Xiong, X., Wang, X., Ewanek, R., Bhat, P., Diantonio, A., Collins, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+turnover+of+the+Wallenda/DLK+kinase+regulates+a+retrograde+response+to+axonal+injury.">Protein turnover of the Wallenda/DLK kinase regulates a retrograde response to axonal injury.</a> J Cell Biol. 191 (1), 211-223 (2010).</li><li>Xiong, X., Collins, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conditioning+lesion+protects+axons+from+degeneration+via+the+Wallenda/DLK+MAP+kinase+signaling+cascade.">A conditioning lesion protects axons from degeneration via the Wallenda/DLK MAP kinase signaling cascade.</a> J Neurosci. 32 (2), 610-615 (2012).</li><li>Mishra, B., Ghannad-Rezaie, M., Li, J., Wang, X., Hao, Y., Ye, B., Chronis, N., Collins, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+microfluidics+chips+for+live+imaging+and+study+of+injury+responses+in+Drosophila+larvae.">Using microfluidics chips for live imaging and study of injury responses in Drosophila larvae.</a> J Vis Exp. (84), e50998 (2014).</li><li>Eaton, B. A., Fetter, R. D., Davis, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynactic+is+necessary+for+synapse+stabilization.">Dynactic is necessary for synapse stabilization.</a> Neuron. 34 (5), 729-741 (2002).</li><li>Eaton, B. A., Davis, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LIM+Kinase1+controls+synaptic+stability+downstream+of+the+type+II+BMP+receptor.">LIM Kinase1 controls synaptic stability downstream of the type II BMP receptor.</a> Neuron. 47 (5), 695-708 (2005).</li><li>Pielage, J., Fetter, R. D., Davis, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presynaptic+spectrin+is+essential+for+synapse+stabilization.">Presynaptic spectrin is essential for synapse stabilization.</a> Curr Biol. 15 (10), 918-928 (2005).</li><li>Pielage, J., Cheng, L., Fetter, R. D., Carlton, P. M., Sedat, J. W., Davis, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+presynaptic+giant+Ankyrin+stabilizes+the+NMJ+through+regulation+or+presynaptic+microtubules+and+transsynaptic+cell+adhesion.">A presynaptic giant Ankyrin stabilizes the NMJ through regulation or presynaptic microtubules and transsynaptic cell adhesion.</a> Neuron. 58 (2), 195-209 (2008).</li><li>Massaro, C. M., Pielage, J., Davis, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+that+enhance+synapse+stability+despite+persistent+disruption+of+the+spectrin/ankryin/microtubule+cytoskeleton.">Molecular mechanisms that enhance synapse stability despite persistent disruption of the spectrin/ankryin/microtubule cytoskeleton.</a> J Cell Biol. 187 (1), 101-117 (2009).</li><li>Lincoln, B. L., Alabsi, S. H., Frendo, N., Freund, R., Keller, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+neuronal+injury+follows+a+temporal+sequence+of+cellular+events+leading+to+degeneration+at+the+neuromuscular+junction.">Drosophila neuronal injury follows a temporal sequence of cellular events leading to degeneration at the neuromuscular junction.</a> J Exp Neurosci. 9, 1-9 (2015).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+apple+juice-agar+plates.">Drosophila apple juice-agar plates.</a> Cold Spring Harb Protoc. , (2011).</li><li>Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+larval+NMJ+immunohistochemistry.">Drosophila larval NMJ immunohistochemistry.</a> J Vis Exp. (25), (2009).</li><li>Smith, R., Taylor, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+and+imaging+of+active+zones+in+the+Drosophila+neuromuscular+junction.">Dissection and imaging of active zones in the Drosophila neuromuscular junction.</a> J Vis Exp. (50), (2011).</li><li>Jan, L., Jan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibodies+to+horseradish+peroxidase+as+specific+neuronal+markers+in+Drosophila+and+in+grasshopper+embryos.">Antibodies to horseradish peroxidase as specific neuronal markers in Drosophila and in grasshopper embryos.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 79 (8), 2700-2704 (1982).</li><li>Lahey, T., Gorczyca, M., Jia, X., Budnik, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+tumor+suppressor+gene+dlg+is+required+for+normal+synaptic+bouton+structure.">The Drosophila tumor suppressor gene dlg is required for normal synaptic bouton structure.</a> Neuron. 13 (4), 823-835 (1994).</li></ol>

La blessure mécanique neuronale décrite précédemment et démontrée ici peut être utilisée pour induire une blessure / stress dans les nerfs segmentaires des larves de Drosophila . 4 , 5 , 6 , 14 Cette technique expérimentale a été utilisée précédemment pour disséquer la séquence temporelle des événements conduisant à une neurodégénérescence, ainsi que pour examine...

La dégénérescence neuronale se produit pendant le développement normal et peut être causée par le processus de vieillissement naturel, les blessures, le stress ou les états pathologiques. Drosophila melanogaster , la mouche commune des fruits, fournit un organisme modèle simple et puissant pour étudier la neurodégénérolat en raison des similitudes remarquables dans les mécanismes moléculaires qui entraînent la dégénérescence des neurones. Ces similitudes sont soulignées par le fait qu&#39;environ 70% des gènes humains associés à la maladie ont un homologue de Drosophila . 1 De plus, de nombreux tests et outils technologiques pour étudier les maladies neurodégénératives humaines ont été développés et utilisés dans la Drosophila . 2 , 3 Dans Drosophila , la jonction neuromusculaire (NMJ) permet d&#39;analyser les propriétés cellulaires et électrophysiologiques et s&#39;est avérée être un système important d&#39;étude de la maladie neuromusculaire due à la N visibleConnexions euron-muscle. 2 Dans cette étude, nous décrivons un test de blessure des neurones in vivo dans les larves de Drosophila qui permet une lésion reproductible des nerfs segmentaires. Cette blessure par motoneurone entraîne une séquence temporelle d&#39;événements cellulaires entraînant une neurodégénérescence à la blessure après 24 h de NMJ. La capacité de reproduire les motoneurons causés par les lésions neurodégénératives a diverses applications telles que l&#39;identification des gènes spécifiques requis pour le processus dégénératif, la dissection des réponses transcriptionnelles aux lésions neuronales et l&#39;analyse des cascades de signalisation de protection. 4 , 5 , 6 Cette méthode a également été utilisée en association avec une microfluidique pour étudier la dégénérescence neuronale et la régénération chez les animaux vivants. 7 Nous utilisons un dosage quantitatif établi pour examiner le dégénérescence des neurones moteursÀ la Drosophila NMJ après une blessure mécanique. Ce dosage est basé sur le fait que la perte de membrane présynaptique et les protéines précèdent le désassemblage du réticulum subsynaptique (SSR) caractérisé par les plis de membrane du muscle postsynaptique. 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 Ce dosage permet de quantifier les &quot;empreintes synaptiques&quot; où le neurone pré-synaptique a perdu la connexion avec le muscle postsynaptique adjacent. Le processus dégénératif s&#39;est avéré être progressif dans tout le développement larvaire 12 et ne peut être pris en compte par une modification du développement synapse ou de la germination. 8 , 9 , 10 , 11 , 12 L&#39;annonceLe recours à une lésion mécanique par rapport à des mutations préexistantes est qu&#39;il permet la dissection de la séquence temporelle d&#39;événements cellulaires conduisant à une neurodégénérescence au NMJ. 13

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Micro-dissecting scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15000-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #3 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11231-30</td>
			<td>Some people prefer size 3, while others prefer size 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-30</td>
			<td>Some people prefer size 3, while others prefer size 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Air Tank</td>
			<td>Tech Air</td>
			<td>UN 1013</td>
			<td>Various tank sizes can be purchased/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Anesthetizing Apparatus</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>59-114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless-steel pins, size 0.1</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26002-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SylGard 184 Silicone Elastomer, Base and Curing Agent</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>3097358-1004</td>
			<td>To pour dissecting plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bouin&#39;s Solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>HT 10132-1L</td>
			<td>Antibodies should be tested for their efficiency in Bouin&#39;s and PFA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% Paraformaldehyde in PBS</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>FLY-8030-20</td>
			<td>Antibodies should be tested for their efficiency in Bouin&#39;s and PFA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Stereo MIcroscope</td>
			<td>AmScope</td>
			<td>SM-1BZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light Source</td>
			<td>AmScope</td>
			<td>HL150-AY-220V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti- nc82 antibody</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>nc82-s</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-discs large antibody</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>AF3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor anti-horseradish peroxidase</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>123-545-021; 123-585-021; 123-605-021</td>
			<td>One can you Alexa Fluor&#174; 488, 594 or 647</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flystuff Grape Juice Agar Premix</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>47-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>29-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Coverslips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-545-87</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific Nalgene Utility Box</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>03-484C</td>
			<td>Used to create humid chamber for larval recovery</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a simple neuronal mechanical injury methodology to study drosophila motor neuron degeneration

La dégénérescence des neurones se produit pendant le développement normal et en réponse aux blessures, au stress et à la maladie. Les caractéristiques cellulaires de la dégénérescence neuronale sont remarquablement similaires chez les humains et les invertébrés, de même que les mécanismes moléculaires qui conduisent ces processus. La mouche des fruits, Drosophila melanogaster , fournit un organisme modèle génétique puissant mais simple pour étudier la complexité cellulaire des maladies neurodégénératives. En fait, environ 70% des gènes humains associés à la maladie ont un homologue de Drosophila et une multitude d&#39;outils et de dosages ont été décrits en utilisant des mouches pour étudier des maladies neurodégénératives chez l&#39;homme. Plus précisément, la jonction neuromusculaire (NMJ) dans Drosophila s&#39;est révélée être un système efficace pour étudier les maladies neuromusculaires en raison de la capacité d&#39;analyser les liaisons structurelles entre le neurone et le muscle. Ici, nous rapportons un test de blessure des neurones moteurs in vivo dans Drosophila , quiProvoque de manière reproductible la neurodégénérescence au NMJ de 24 h. En utilisant cette méthodologie, nous avons décrit une séquence temporelle d&#39;événements cellulaires entraînant une dégénérescence des neurones moteurs. La méthode de la blessure a des applications diverses et a également été utilisée pour identifier les gènes spécifiques requis pour la neurodégénérescence et pour disséquer les réponses transcriptionnelles aux lésions neuronales.

En utilisant la procédure présentée ici, nous avons démontré que la lésion neuronale mécanique permet une dissection temporelle des événements neurodégénératifs. 14 , 18 La séquence des événements a été précédemment caractérisée et commence par une perturbation immédiate du cytosquelette, suivie de défauts de traite axonale, d&#39;une accumulation de protéines ubiquitinées et d&#39;une neuro-dégénéresc...

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A Simple Neuronal Mechanical Injury Methodology to Study Drosophila Motor Neuron Degeneration

Nous décrivons ici une méthode simple et largement accessible pour nuire aux nerfs segmentaires dans les larves de Drosophila pour visualiser et quantifier la neurodégénérescence des neurones moteurs à la jonction neuromusculaire (NMJ) des larves du troisième stade.

Une méthodologie de lésions mécaniques neuronales simples à étudier<em&gt; Drosophila</em&gt; Dégénérescence du neuron moteur

The degeneration of neurons occurs during normal development and in response to injury, stress, and disease. The cellular hallmarks of neuronal ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

A Simple Neuronal Mechanical Injury Methodology to Study Drosophila Motor Neuron Degeneration

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