Name: a simple neuronal mechanical injury methodology to study drosophila motor neuron degeneration
Uploaded: 2017-07-19T15:00:00
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Vorremmo ringraziare tutti i membri del Keller e dei Magie Labs presso l&#39;Università Quinnipiac per suggerimenti utili. In particolare, vorremmo ringraziare Barron L. Lincoln II per lo sviluppo di questo test di lesioni all&#39;interno del Keller Lab. Vorremmo inoltre ringraziare l&#39;Università di Quinnipiac College of Arts e Science Grant-In-Aid conferito a LC Keller.

1. Preparazione di reagenti e attrezzature <ol><li> Preparare 1x dissezione buffer (70 mM NaCl, 5 mM KCl, 0,02 mM CaCl 2, 20 mM MgCl 2, 10 mM NaHCO 3, 115 mM di saccarosio, trealosio 5 mM, HEPES 5 mM, pH 7.2). </li><li> Preparare una soluzione salina a base di fosfato (PBS). </li><li> Preparare 1x PBT utilizzando 1x PBS con 0.01% Triton X-100. </li><li> Preparare le piastre di agar succo di frutta. 14 In breve, mescolare 30 g di agar in 700 ml di H 2 ...

<ol>
	<li>Bier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophilia,+the+golden+bug,+emerges+as+a+tool+for+human+genetics.">Drosophilia, the golden bug, emerges as a tool for human genetics.</a> Nat. Rev. Genet. 6 (1), 9-23 (2005).</li><li>Ugur, B., Chen, K., Bellen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+tools+and+assays+for+the+study+of+human+diseases.">Drosophila tools and assays for the study of human diseases.</a> Dis Model Mech. 9 (3), 235-244 (2016).</li><li>McGurk, L., Berson, A., Bonini, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+as+an+in+vivo+model+for+human+neurodegenerative+disease.">Drosophila as an in vivo model for human neurodegenerative disease.</a> Genetics. 201 (2), 377-402 (2015).</li><li>Shin, J. E., Cho, Y., Beirowski, B., Milbrandt, J., Cavalli, V., DiAntonio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+leucine+zipper+kinase+is+required+for+retrograde+injury+signaling+and+axonal+regeneration.">Dual leucine zipper kinase is required for retrograde injury signaling and axonal regeneration.</a> Neuron. 74 (6), 1015-1022 (2012).</li><li>Xiong, X., Wang, X., Ewanek, R., Bhat, P., Diantonio, A., Collins, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+turnover+of+the+Wallenda/DLK+kinase+regulates+a+retrograde+response+to+axonal+injury.">Protein turnover of the Wallenda/DLK kinase regulates a retrograde response to axonal injury.</a> J Cell Biol. 191 (1), 211-223 (2010).</li><li>Xiong, X., Collins, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conditioning+lesion+protects+axons+from+degeneration+via+the+Wallenda/DLK+MAP+kinase+signaling+cascade.">A conditioning lesion protects axons from degeneration via the Wallenda/DLK MAP kinase signaling cascade.</a> J Neurosci. 32 (2), 610-615 (2012).</li><li>Mishra, B., Ghannad-Rezaie, M., Li, J., Wang, X., Hao, Y., Ye, B., Chronis, N., Collins, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+microfluidics+chips+for+live+imaging+and+study+of+injury+responses+in+Drosophila+larvae.">Using microfluidics chips for live imaging and study of injury responses in Drosophila larvae.</a> J Vis Exp. (84), e50998 (2014).</li><li>Eaton, B. A., Fetter, R. D., Davis, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynactic+is+necessary+for+synapse+stabilization.">Dynactic is necessary for synapse stabilization.</a> Neuron. 34 (5), 729-741 (2002).</li><li>Eaton, B. A., Davis, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LIM+Kinase1+controls+synaptic+stability+downstream+of+the+type+II+BMP+receptor.">LIM Kinase1 controls synaptic stability downstream of the type II BMP receptor.</a> Neuron. 47 (5), 695-708 (2005).</li><li>Pielage, J., Fetter, R. D., Davis, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presynaptic+spectrin+is+essential+for+synapse+stabilization.">Presynaptic spectrin is essential for synapse stabilization.</a> Curr Biol. 15 (10), 918-928 (2005).</li><li>Pielage, J., Cheng, L., Fetter, R. D., Carlton, P. M., Sedat, J. W., Davis, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+presynaptic+giant+Ankyrin+stabilizes+the+NMJ+through+regulation+or+presynaptic+microtubules+and+transsynaptic+cell+adhesion.">A presynaptic giant Ankyrin stabilizes the NMJ through regulation or presynaptic microtubules and transsynaptic cell adhesion.</a> Neuron. 58 (2), 195-209 (2008).</li><li>Massaro, C. M., Pielage, J., Davis, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+that+enhance+synapse+stability+despite+persistent+disruption+of+the+spectrin/ankryin/microtubule+cytoskeleton.">Molecular mechanisms that enhance synapse stability despite persistent disruption of the spectrin/ankryin/microtubule cytoskeleton.</a> J Cell Biol. 187 (1), 101-117 (2009).</li><li>Lincoln, B. L., Alabsi, S. H., Frendo, N., Freund, R., Keller, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+neuronal+injury+follows+a+temporal+sequence+of+cellular+events+leading+to+degeneration+at+the+neuromuscular+junction.">Drosophila neuronal injury follows a temporal sequence of cellular events leading to degeneration at the neuromuscular junction.</a> J Exp Neurosci. 9, 1-9 (2015).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+apple+juice-agar+plates.">Drosophila apple juice-agar plates.</a> Cold Spring Harb Protoc. , (2011).</li><li>Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+larval+NMJ+immunohistochemistry.">Drosophila larval NMJ immunohistochemistry.</a> J Vis Exp. (25), (2009).</li><li>Smith, R., Taylor, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+and+imaging+of+active+zones+in+the+Drosophila+neuromuscular+junction.">Dissection and imaging of active zones in the Drosophila neuromuscular junction.</a> J Vis Exp. (50), (2011).</li><li>Jan, L., Jan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibodies+to+horseradish+peroxidase+as+specific+neuronal+markers+in+Drosophila+and+in+grasshopper+embryos.">Antibodies to horseradish peroxidase as specific neuronal markers in Drosophila and in grasshopper embryos.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 79 (8), 2700-2704 (1982).</li><li>Lahey, T., Gorczyca, M., Jia, X., Budnik, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+tumor+suppressor+gene+dlg+is+required+for+normal+synaptic+bouton+structure.">The Drosophila tumor suppressor gene dlg is required for normal synaptic bouton structure.</a> Neuron. 13 (4), 823-835 (1994).</li></ol>

La lesione meccanica neuronale descritta precedentemente e qui dimostrata può essere utilizzata per indurre lesioni / stress nei nervi segmentali delle larve Drosophila . 4 , 5 , 6 , 14 Questa tecnica sperimentale è stata impiegata in precedenza per disseccare la sequenza temporale degli eventi che conducono alla neurodegenerazione, nonché ad esaminare i cambiamenti trascrizionali ...

La degenerazione neuronale si verifica durante il normale sviluppo e può essere causata dal processo naturale di invecchiamento, lesioni, stress, o stati di malattia. Drosophila melanogaster , la mosca comune di frutta, fornisce un organismo modello semplice e potente per studiare la neurodegenerazione a causa delle notevoli somiglianze nei meccanismi molecolari che guidano la degenerazione dei neuroni. Queste somiglianze sono evidenziate dal fatto che circa il 70% dei geni umani associati alla malattia presenta un omologo Drosophila . 1 Inoltre, numerosi saggi e strumenti tecnologici per lo studio delle malattie neurodegenerative umane sono stati sviluppati e utilizzati in Drosophila. 2 , 3 All&#39;interno di Drosophila , la giunzione neuromuscolare (NMJ) permette di analizzare sia le proprietà cellulari che elettrofisiologiche e si è dimostrato un importante sistema per studiare la malattia neuromuscolare a causa del n visibileConnessioni euron-muscolari. 2 In questo studio, descriviamo un dosaggio in vivo di lesioni neuronali nelle larve Drosophila che consente la lesione riproducibile dei nervi segmentali. Questo infortunio motoneuron provoca una sequenza temporale di eventi cellulari che hanno determinato la neurodegenerazione al NMJ 24 h dopo lesioni. La capacità di lesioni riproducibili che provocano neurodegenerazione ha diverse applicazioni quali identificazione di geni specifici necessari per il processo degenerativo, dissezione delle risposte trascrizionali alla lesione neuronale e analisi delle cascate di segnalazione protettive. 4 , 5 , 6 Questo metodo è stato utilizzato anche in combinazione con microfluidici per studiare la degenerazione e la rigenerazione neuronali in animali vivi. 7 Utilizziamo un dosaggio quantitativo stabilito per esaminare il degenerato dei neuroni motoriIon a Drosophila NMJ dopo lesioni meccaniche. Questo saggio è basato sul fatto che la perdita di membrana e proteine ​​presinaptiche precede lo smontaggio del reticolo subsintattico (SSR) caratterizzato dalle pieghe della membrana muscolare postsinaptica. 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 Questo test consente la quantificazione di &quot;orme sinaptiche&quot; in cui il neurone pre-sinaptico ha perso la connessione con il muscolo postinaptico adiacente. Il processo degenerativo è stato dimostrato progressivo durante lo sviluppo della larve 12 e non può essere considerato per lo sviluppo alterato della sinapsia o la germinazione. 8 , 9 , 10 , 11 , 12 L&#39;annuncioIl vantaggio di utilizzare lesioni meccaniche sulle mutazioni preesistenti è che permette la dissezione della sequenza temporale di eventi cellulari che conducono alla neurodegenerazione presso la NMJ. 13

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Micro-dissecting scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15000-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #3 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11231-30</td>
			<td>Some people prefer size 3, while others prefer size 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-30</td>
			<td>Some people prefer size 3, while others prefer size 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Air Tank</td>
			<td>Tech Air</td>
			<td>UN 1013</td>
			<td>Various tank sizes can be purchased/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Anesthetizing Apparatus</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>59-114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless-steel pins, size 0.1</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26002-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SylGard 184 Silicone Elastomer, Base and Curing Agent</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>3097358-1004</td>
			<td>To pour dissecting plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bouin&#39;s Solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>HT 10132-1L</td>
			<td>Antibodies should be tested for their efficiency in Bouin&#39;s and PFA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% Paraformaldehyde in PBS</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>FLY-8030-20</td>
			<td>Antibodies should be tested for their efficiency in Bouin&#39;s and PFA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Stereo MIcroscope</td>
			<td>AmScope</td>
			<td>SM-1BZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light Source</td>
			<td>AmScope</td>
			<td>HL150-AY-220V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti- nc82 antibody</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>nc82-s</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-discs large antibody</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>AF3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor anti-horseradish peroxidase</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>123-545-021; 123-585-021; 123-605-021</td>
			<td>One can you Alexa Fluor&#174; 488, 594 or 647</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flystuff Grape Juice Agar Premix</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>47-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>29-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Coverslips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-545-87</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific Nalgene Utility Box</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>03-484C</td>
			<td>Used to create humid chamber for larval recovery</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a simple neuronal mechanical injury methodology to study drosophila motor neuron degeneration

La degenerazione dei neuroni avviene durante il normale sviluppo e in risposta a lesioni, stress e malattie. I segni cellulari della degenerazione neuronale sono notevolmente simili negli esseri umani e negli invertebrati, così come i meccanismi molecolari che guidano questi processi. La mosca di frutta, Drosophila melanogaster , fornisce un organismo di modello genetico potente ma semplice per studiare le complessità cellulari delle malattie neurodegenerative. Infatti, circa il 70% dei geni umani associati alla malattia ha un omologo Drosophila e una pletora di strumenti e dosaggi sono stati descritti usando le mosche per studiare le malattie neurodegenerative umane. Più in particolare la giunzione neuromuscolare (NMJ) di Drosophila si è rivelata un efficace sistema per studiare le malattie neuromuscolari a causa della capacità di analizzare le connessioni strutturali tra il neurone e il muscolo. Qui, riportiamo un test in vivo di lesioni neuronali del motore in Drosophila , cheRiproducibilmente induce la neurodegenerazione a NMJ per 24 h. Utilizzando questa metodologia, abbiamo descritto una sequenza temporale di eventi cellulari che determinano la degenerazione dei motori neuronali. Il metodo del pregiudizio ha diverse applicazioni ed è stato utilizzato anche per identificare geni specifici necessari per la neurodegenerazione e per disseccare le risposte transcrizionali alla lesione neuronale.

Utilizzando la procedura qui presentata, abbiamo dimostrato che lesioni neuronali meccaniche consentono la dissezione temporale di eventi neurodegenerativi. 14 , 18 La sequenza degli eventi è stata precedentemente caratterizzata e inizia con un&#39;interruzione immediata del citoscheletro, seguita da difetti di traffico dell&#39;assone, un accumulo di proteine ​​ubiquitinate e una successiva neurodegenerazione 24 h post-lesi...

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A Simple Neuronal Mechanical Injury Methodology to Study Drosophila Motor Neuron Degeneration

Qui descriviamo un metodo semplice e ampiamente accessibile per danneggiare i nervi segmentali nelle larve Drosophila per visualizzare e quantificare la neurodegenerazione dei neuroni motori alla giunzione neuromuscolare (NMJ) delle larve di terzo istar.

Una semplice metodologia di lesioni meccaniche neuronali da studiare<em&gt; Drosophila</em&gt; Degenerazione dei motori neuronali

The degeneration of neurons occurs during normal development and in response to injury, stress, and disease. The cellular hallmarks of neuronal ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

A Simple Neuronal Mechanical Injury Methodology to Study Drosophila Motor Neuron Degeneration

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