Name: a simple neuronal mechanical injury methodology to study drosophila motor neuron degeneration
Uploaded: 2017-07-19T15:00:00
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私たちはQuinnipiac UniversityのKellerとMagie Labsのメンバー全員に有益な提案をいただき、ありがとうございます。特に、Keller Lab内でこの損傷アッセイを開発したBarron L. Lincoln IIに感謝したいと思います。 LC Kellerに授与されたQuinnipiac University of Arts and Science Grant-In-Aidにも感謝したいと思います。

1.試薬および装置の準備<ol><li> 1X解離緩衝液を調製する（70のNaCl、5mMのKCl、0.02mMのCaCl 2を、20mMのMgCl 2を 、10mMのNaHCO 3を、115 mMスクロース、5 mMのトレハロース、5mMのHEPES、pHは7.2）。 </li><li> 1×リン酸緩衝生理食塩水（PBS）を調製する。 </li><li> 0.01％Triton X-100を含む1x PBSを使用して1x PBTを調製します。 </li><li>フルーツジュース寒天プレートを準備する。 14...

<ol>
	<li>Bier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophilia,+the+golden+bug,+emerges+as+a+tool+for+human+genetics.">Drosophilia, the golden bug, emerges as a tool for human genetics.</a> Nat. Rev. Genet. 6 (1), 9-23 (2005).</li><li>Ugur, B., Chen, K., Bellen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+tools+and+assays+for+the+study+of+human+diseases.">Drosophila tools and assays for the study of human diseases.</a> Dis Model Mech. 9 (3), 235-244 (2016).</li><li>McGurk, L., Berson, A., Bonini, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+as+an+in+vivo+model+for+human+neurodegenerative+disease.">Drosophila as an in vivo model for human neurodegenerative disease.</a> Genetics. 201 (2), 377-402 (2015).</li><li>Shin, J. E., Cho, Y., Beirowski, B., Milbrandt, J., Cavalli, V., DiAntonio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+leucine+zipper+kinase+is+required+for+retrograde+injury+signaling+and+axonal+regeneration.">Dual leucine zipper kinase is required for retrograde injury signaling and axonal regeneration.</a> Neuron. 74 (6), 1015-1022 (2012).</li><li>Xiong, X., Wang, X., Ewanek, R., Bhat, P., Diantonio, A., Collins, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+turnover+of+the+Wallenda/DLK+kinase+regulates+a+retrograde+response+to+axonal+injury.">Protein turnover of the Wallenda/DLK kinase regulates a retrograde response to axonal injury.</a> J Cell Biol. 191 (1), 211-223 (2010).</li><li>Xiong, X., Collins, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conditioning+lesion+protects+axons+from+degeneration+via+the+Wallenda/DLK+MAP+kinase+signaling+cascade.">A conditioning lesion protects axons from degeneration via the Wallenda/DLK MAP kinase signaling cascade.</a> J Neurosci. 32 (2), 610-615 (2012).</li><li>Mishra, B., Ghannad-Rezaie, M., Li, J., Wang, X., Hao, Y., Ye, B., Chronis, N., Collins, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+microfluidics+chips+for+live+imaging+and+study+of+injury+responses+in+Drosophila+larvae.">Using microfluidics chips for live imaging and study of injury responses in Drosophila larvae.</a> J Vis Exp. (84), e50998 (2014).</li><li>Eaton, B. A., Fetter, R. D., Davis, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynactic+is+necessary+for+synapse+stabilization.">Dynactic is necessary for synapse stabilization.</a> Neuron. 34 (5), 729-741 (2002).</li><li>Eaton, B. A., Davis, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LIM+Kinase1+controls+synaptic+stability+downstream+of+the+type+II+BMP+receptor.">LIM Kinase1 controls synaptic stability downstream of the type II BMP receptor.</a> Neuron. 47 (5), 695-708 (2005).</li><li>Pielage, J., Fetter, R. D., Davis, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presynaptic+spectrin+is+essential+for+synapse+stabilization.">Presynaptic spectrin is essential for synapse stabilization.</a> Curr Biol. 15 (10), 918-928 (2005).</li><li>Pielage, J., Cheng, L., Fetter, R. D., Carlton, P. M., Sedat, J. W., Davis, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+presynaptic+giant+Ankyrin+stabilizes+the+NMJ+through+regulation+or+presynaptic+microtubules+and+transsynaptic+cell+adhesion.">A presynaptic giant Ankyrin stabilizes the NMJ through regulation or presynaptic microtubules and transsynaptic cell adhesion.</a> Neuron. 58 (2), 195-209 (2008).</li><li>Massaro, C. M., Pielage, J., Davis, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+that+enhance+synapse+stability+despite+persistent+disruption+of+the+spectrin/ankryin/microtubule+cytoskeleton.">Molecular mechanisms that enhance synapse stability despite persistent disruption of the spectrin/ankryin/microtubule cytoskeleton.</a> J Cell Biol. 187 (1), 101-117 (2009).</li><li>Lincoln, B. L., Alabsi, S. H., Frendo, N., Freund, R., Keller, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+neuronal+injury+follows+a+temporal+sequence+of+cellular+events+leading+to+degeneration+at+the+neuromuscular+junction.">Drosophila neuronal injury follows a temporal sequence of cellular events leading to degeneration at the neuromuscular junction.</a> J Exp Neurosci. 9, 1-9 (2015).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+apple+juice-agar+plates.">Drosophila apple juice-agar plates.</a> Cold Spring Harb Protoc. , (2011).</li><li>Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+larval+NMJ+immunohistochemistry.">Drosophila larval NMJ immunohistochemistry.</a> J Vis Exp. (25), (2009).</li><li>Smith, R., Taylor, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+and+imaging+of+active+zones+in+the+Drosophila+neuromuscular+junction.">Dissection and imaging of active zones in the Drosophila neuromuscular junction.</a> J Vis Exp. (50), (2011).</li><li>Jan, L., Jan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibodies+to+horseradish+peroxidase+as+specific+neuronal+markers+in+Drosophila+and+in+grasshopper+embryos.">Antibodies to horseradish peroxidase as specific neuronal markers in Drosophila and in grasshopper embryos.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 79 (8), 2700-2704 (1982).</li><li>Lahey, T., Gorczyca, M., Jia, X., Budnik, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+tumor+suppressor+gene+dlg+is+required+for+normal+synaptic+bouton+structure.">The Drosophila tumor suppressor gene dlg is required for normal synaptic bouton structure.</a> Neuron. 13 (4), 823-835 (1994).</li></ol>

以前に記載され、ここに示されたニューロンの機械的損傷は、 ショウジョウバエの幼虫の分節神経における損傷/ストレスを誘発するために使用され得る。 4、5、6、14この実験的手法は、神経変性を導く事象の時系列を分析するために、ならびに損傷後の運動ニューロンの細胞体における?...

ニューロンの変性は、正常な発達中に起こり、自然な老化過程、傷害、ストレス、または病状によって引き起こされうる。 ショウジョウバエのmelanogasterは、一般的なフルーツフライは、ニューロンの変性を駆動する分子メカニズムの顕著な類似性のため、神経変性を研究するためのシンプルで強力なモデル生物を提供します。これらの類似性は、疾患関連ヒト遺伝子の約70％がショウジョウバエ相同体を有するという事実によって強調される。 1はまた、数多くのアッセイおよび人間の神経変性疾患を研究するための技術のツールは、ショウジョウバエで開発され、利用されています。 ショウジョウバエ内で2、3、神経筋接合部（NMJ）は、両方の細胞および電気生理学的特性の解析を可能にし、可視nに神経筋疾患を研究するための重要なシステムであることが証明されましたユーロン - 筋肉の接続。 図2は、本研究では、分節神経の再現性の傷害を可能にし、ショウジョウバエの幼虫におけるin vivo神経細胞傷害アッセイを説明します。この運動ニューロン損傷は、損傷後24時間のNMJにおいて神経変性を生じる細胞事象の一時的な配列を生じる。神経変性を生じる運動ニューロンを再現可能に傷つける能力は、変性過程に必要とされる特定の遺伝子の同定、ニューロン損傷に対する転写応答の解剖および保護シグナル伝達カスケードの分析などの多様な用途を有する。 図4、 図5、 図6は、この方法は、生きている動物における神経変性および再生を研究するために、マイクロ流体と組み合わせて使用されてきました。 7 我々は、確立された定量アッセイを利用して、運動ニューロン変性イオンが機械的損傷後にショウジョウバエ NMJで検出される。このアッセイは、シナプス前膜およびタンパク質の損失が、シナプス後の筋膜の折畳みによって特徴付けられる潜在網状赤血球（SSR）の分解に先行するという事実に基づいている。 8、9、10、11、12、13このアッセイは、シナプス前ニューロンが隣接シナプス後筋肉への接続を失った「シナプス足跡」の定量化を可能にします。変性工程は、幼虫の発育12を通じて進行性であることが示されており、変更されたシナプスの発達又は発芽によって説明することができません。 8、9、10、11、12広告既存の突然変異よりも機械的損傷を使用することの利点は、それが、NMJでの神経変性に至る細胞事象の時間的順序の解剖を可能にすることである。 13

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Micro-dissecting scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15000-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #3 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11231-30</td>
			<td>Some people prefer size 3, while others prefer size 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-30</td>
			<td>Some people prefer size 3, while others prefer size 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Air Tank</td>
			<td>Tech Air</td>
			<td>UN 1013</td>
			<td>Various tank sizes can be purchased/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Anesthetizing Apparatus</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>59-114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless-steel pins, size 0.1</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26002-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SylGard 184 Silicone Elastomer, Base and Curing Agent</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>3097358-1004</td>
			<td>To pour dissecting plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bouin&#39;s Solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>HT 10132-1L</td>
			<td>Antibodies should be tested for their efficiency in Bouin&#39;s and PFA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% Paraformaldehyde in PBS</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>FLY-8030-20</td>
			<td>Antibodies should be tested for their efficiency in Bouin&#39;s and PFA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Stereo MIcroscope</td>
			<td>AmScope</td>
			<td>SM-1BZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light Source</td>
			<td>AmScope</td>
			<td>HL150-AY-220V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti- nc82 antibody</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>nc82-s</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-discs large antibody</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>AF3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor anti-horseradish peroxidase</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>123-545-021; 123-585-021; 123-605-021</td>
			<td>One can you Alexa Fluor&#174; 488, 594 or 647</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flystuff Grape Juice Agar Premix</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>47-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>29-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Coverslips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-545-87</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific Nalgene Utility Box</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>03-484C</td>
			<td>Used to create humid chamber for larval recovery</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a simple neuronal mechanical injury methodology to study drosophila motor neuron degeneration

ニューロンの変性は、正常な発達中、および傷害、ストレス、および疾患に応答して起こる。ニューロン変性の細胞の特徴は、ヒトおよび無脊椎動物において、これらの過程を駆動する分子メカニズムと同様に著しく類似している。 ショウジョウバエ（Drosophila melanogaster ）は、神経変性疾患の細胞の複雑さを研究するための強力で単純な遺伝モデル生物を提供する。実際には、疾患関連ヒト遺伝子の約70％がショウジョウバエ相同体を有し、ヒト神経変性疾患を研究するためにハエを用いて多数のツールおよびアッセイが記載されている。より具体的には、 ショウジョウバエの神経筋接合部（NMJ）は、神経細胞と筋肉との間の構造的結合を解析する能力のために、神経筋疾患を研究するための有効なシステムであることが証明されている。ここでは、 ショウジョウバエの in vivo運動ニューロン損傷アッセイについて報告する。24時間までにNMJにおいて神経変性を再現可能に誘発する。この方法論を用いて、運動ニューロン変性をもたらす細胞事象の時間的順序を記載した。傷害方法は多様な用途を有し、神経変性に必要な特定の遺伝子を同定し、神経損傷に対する転写応答を解剖するために利用されている。

ここに示した手順を使用して、我々は、機械的な神経損傷が神経変性事象の時間的解剖を可能にすることを実証した。 14、イベントのシーケンスが以前に特徴付けられ、軸索トラフィッキング欠陥続いて細胞骨格の即時中断、ユビキチン化タンパク質の蓄積、およびそれに続く神経変性の24時間後に傷害で始まるされている18。<...

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A Simple Neuronal Mechanical Injury Methodology to Study Drosophila Motor Neuron Degeneration

ここでは、3齢幼虫の神経筋接合部（NMJ）における運動ニューロンの神経変性を視覚化および定量化するために、 ショウジョウバエ幼虫における分節神経を傷つける簡単かつ広くアクセス可能な方法について説明する。

研究のための単純な神経細胞学的損傷法<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;運動ニューロン変性

The degeneration of neurons occurs during normal development and in response to injury, stress, and disease. The cellular hallmarks of neuronal ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

A Simple Neuronal Mechanical Injury Methodology to Study Drosophila Motor Neuron Degeneration

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

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のレーザーキャプチャーマイクロダイセクションショウジョウバエ末梢ニューロン

The dendritic arborization (da) neurons of the Drosophila peripheral nervous system (PNS) provide an excellent model system in which to investigate the ...

Production of RNA for Transcriptomic Analysis from Mouse Spinal Cord Motor Neuron Cell Bodies by Laser Capture Microdissection

レーザー捕捉マイクロ解離によるマウス脊髄運動ニューロン細胞体からの転写解析のためのRNAの生成

Preparation of high-quality RNA from cells of interest is critical to precise and meaningful analysis of transcriptional differences among cell types or ...

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マウス後脳<em&gt;生体外</em&gt;文化顔面Branchiomotorニューロンの移行を研究する

Embryonic neurons are born in the ventricular zone of the brain, but subsequently migrate to new destinations to reach appropriate targets. Deciphering ...

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

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アン<em&gt;エクスビボ</em&gt;レーザー誘起脊髄損傷モデルがリアルタイムで軸索変性のメカニズムを評価するために

Injured CNS axons fail to regenerate and often retract away from the injury site. Axons spared from the initial injury may later undergo secondary axonal ...

The Neuromuscular Junction: Measuring Synapse Size, Fragmentation and Changes in Synaptic Protein Density Using Confocal Fluorescence Microscopy

神経筋接合部：測定シナプスサイズ、断片化および共焦点蛍光顕微鏡を用いてシナプスタンパク質の密度の変化

The neuromuscular junction (NMJ) is the large, cholinergic relay synapse through which mammalian motor neurons control voluntary muscle contraction. ...

A Method to Inflict Closed Head Traumatic Brain Injury in Drosophila

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で閉鎖性頭部外傷性脳損傷を負わせる方法<em&gt;ショウジョウバエ</em

Traumatic brain injury (TBI) affects millions of people each year, causing impairment of physical, cognitive, and behavioral functions and death. Studies ...

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なぜ定量事項：での表現型のキャラクタリゼーション<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;幼虫の神経筋接合部

Most studies on morphogenesis rely on qualitative descriptions of how anatomical traits are affected by the disruption of specific genes and genetic ...

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使用して報酬を求める行動の変化を測定するための簡単な方法<em&gt;キイロショウジョウバエ</em

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Assay to Measure Nucleocytoplasmic Transport in Real Time within Motor Neuron-like NSC-34 Cells

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Nucleocytoplasmic transport refers to the import and export of large molecules from the cell nucleus. Recently, a number of studies have shown a ...

Modeling Neuronal Death and Degeneration in Mouse Primary Cerebellar Granule Neurons

神経細胞死とマウス プライマリ小脳顆粒ニューロンの変性をモデリング

Cerebellar granule neurons (CGNs) are a commonly used neuronal model, forming an abundant homogeneous population in the cerebellum. In light of their ...