Name: 3' end sequencing library preparation with a-seq2
Uploaded: 2017-10-10T14:00:00
Duration: 12 min 1 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about 3' End Sequencing Library Preparation with A-seq2 at JoVE.com

De auteurs bedanken mevrouw Béatrice Dimitriades voor hulp bij de cultuur van de cel. Dit werk werd gesteund door de Zwitserse National Science Foundation subsidies #31003A_170216 en 51NF40_141735 (NCCR RNA &#38; ziekte).

<ol>
	<li>Jan, C. H., Friedman, R. C., Ruby, J. G., Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation,+regulation+and+evolution+of+Caenorhabditis+elegans+3'UTRs.">Formation, regulation and evolution of Caenorhabditis elegans 3'UTRs.</a> Nature. 469 (7328), 97-101 (2011).</li><li>Spies, N., Burge, C. B., Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3'+UTR-isoform+choice+has+limited+influence+on+the+stability+and+translational+efficiency+of+most+mRNAs+in+mouse+fibroblasts.">3' UTR-isoform choice has limited influence on the stability and translational efficiency of most mRNAs in mouse fibroblasts.</a> Genome Res. 23 (12), 2078-2090 (2013).</li><li>Hoque, M., Ji, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+alternative+cleavage+and+polyadenylation+by+3'+region+extraction+and+deep+sequencing.">Analysis of alternative cleavage and polyadenylation by 3' region extraction and deep sequencing.</a> Nat. methods. 10 (2), 133-139 (2013).</li><li>Martin, G., Gruber, A. R., Keller, W., Zavolan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+of+pre-mRNA+3’+end+processing+reveals+a+decisive+role+of+human+cleavage+factor+I+in+the+regulation+of+3'+UTR+length.">Genome-wide analysis of pre-mRNA 3’ end processing reveals a decisive role of human cleavage factor I in the regulation of 3' UTR length.</a> Cell Rep. 1 (6), 753-763 (2012).</li><li>Gruber, A. R., Martin, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+3'+UTR+shortening+has+a+limited+effect+on+protein+abundance+in+proliferating+T+cells.">Global 3' UTR shortening has a limited effect on protein abundance in proliferating T cells.</a> Nat. Commun. 5, 5465 (2014).</li><li>Kivioja, T., V&#228;h&#228;rautio, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Counting+absolute+numbers+of+molecules+using+unique+molecular+identifiers.">Counting absolute numbers of molecules using unique molecular identifiers.</a> Nat. methods. 9 (1), 72-74 (2011).</li><li>Gruber, A. J., Schmidt, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+analysis+of+3'+end+sequencing+data+sets+reveals+novel+polyadenylation+signals+and+the+repressive+role+of+heterogeneous+ribonucleoprotein+C+on+cleavage+and+polyadenylation.">A comprehensive analysis of 3' end sequencing data sets reveals novel polyadenylation signals and the repressive role of heterogeneous ribonucleoprotein C on cleavage and polyadenylation.</a> Genome Res. 26 (8), 1145-1159 (2016).</li><li>Lingner, J., Keller, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3'-end+labeling+of+RNA+with+recombinant+yeast+poly(A)+polymerase.">3'-end labeling of RNA with recombinant yeast poly(A) polymerase.</a> Nucleic Acids Res. 21 (12), 2917-2920 (1993).</li><li>Quail, M. A., Kozarewa, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+large+genome+center's+improvements+to+the+Illumina+sequencing+system.">A large genome center's improvements to the Illumina sequencing system.</a> Nat. methods. 5 (12), 1005-1010 (2008).</li><li>Rahmann, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Snakemake--a+scalable+bioinformatics+workflow+engine.">Snakemake--a scalable bioinformatics workflow engine.</a> Bioinformatics. 28 (19), 2520-2522 (2012).</li><li>. Anaconda Software Distribution Available from: <a target="_blank" href="https://continuum.io">https://continuum.io</a> (2016)</li><li>Dobin, A., Davis, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STAR:+ultrafast+universal+RNA-seq+aligner.">STAR: ultrafast universal RNA-seq aligner.</a> Bioinformatics. 29 (1), 15-21 (2013).</li><li>Martin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutadapt+removes+adapter+sequences+from+high-throughput+sequencing+reads.">Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads.</a> EMBnet.journal. 17 (1), 10-12 (2011).</li><li>Li, H., Handsaker, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Sequence+Alignment/Map+format+and+SAMtools.">The Sequence Alignment/Map format and SAMtools.</a> Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).</li><li>Robinson, J. T., Thorvaldsd&#243;ttir, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrative+genomics+viewer.">Integrative genomics viewer.</a> Nat. Biotechnol. 29 (1), 24-26 (2011).</li><li>Quinlan, A. R., Hall, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BEDTools:+a+flexible+suite+of+utilities+for+comparing+genomic+features.">BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features.</a> Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).</li><li>Ozsolak, F., Platt, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+RNA+sequencing.">Direct RNA sequencing.</a> Nature. 461 (7265), 814-818 (2009).</li><li>Yao, C., Biesinger, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome-wide+analyses+of+CstF64-RNA+interactions+in+global+regulation+of+mRNA+alternative+polyadenylation.">Transcriptome-wide analyses of CstF64-RNA interactions in global regulation of mRNA alternative polyadenylation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109 (46), 18773-18778 (2012).</li><li>Lin, Y., Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in-depth+map+of+polyadenylation+sites+in+cancer.">An in-depth map of polyadenylation sites in cancer.</a> Nucleic Acids Res. 40 (17), 8460-8471 (2012).</li><li>Shepard, P. J., Choi, E. -. A., Lu, J., Flanagan, L. A., Hertel, K. J., Shi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+and+dynamic+landscape+of+RNA+polyadenylation+revealed+by+PAS-Seq.">Complex and dynamic landscape of RNA polyadenylation revealed by PAS-Seq.</a> RNA. 17 (4), 761-772 (2011).</li><li>Fu, Y., Sun, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+genome-wide+profiling+of+tandem+3'+UTRs+among+human+breast+cancer+and+normal+cells+by+high-throughput+sequencing.">Differential genome-wide profiling of tandem 3' UTRs among human breast cancer and normal cells by high-throughput sequencing.</a> Genome Res. 21 (5), 741-747 (2011).</li></ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De veelheid van kern- en ondersteunende factoren die bij pre-mRNA 3' eind verwerking betrokken zijn wordt weerspiegeld in een dienovereenkomstig complexe polyadenylatie landschap. Polyadenylatie is bovendien ook inspelen op veranderingen in andere processen zoals transcriptie, egaliseren en lamineren. 3' eind decollete sites in pre-mRNAs worden normaal gesproken aangeduid op basis van de karakteristieke poly(A) staarten die worden toegevoegd aan de 5'-splitsingsproducten. De meeste methoden gebruiken oligo(dT) inleidingen van variabele lengte waarmee de specifieke omzetting van poly (A)-met mRNAs te cDNAs in een omgekeerde transcriptie reactie. Een gemeenschappelijk probleem van deze aanpak is interne priming aan A-rijke sequenties resulterend in artefactuele decollete sites. Twee methoden die gericht zijn op het omzeilen van dit artefact in de fase van de bereiding van de monsters zijn voorgesteld. In de 3P-seq methode 1, adapters ligatuur zijn specifiek verbonden aan de uiteinden van poly(A) staarten met hulp van een splint oligo gevolgd door gedeeltelijke RNase T1 spijsvertering en omgekeerde transcriptie met TTP in de reactie als de enige deoxynucleotide. De resulterende poly(A)-poly(dT) heteroduplexes zijn dan verteerd met RNase H en zijn de overgebleven fragmenten van RNA sequenced, geïsoleerd en afgebonden aan adapters. Een eenvoudiger en elegante methode, 2P-seq, die gebruikmaakt van een aangepaste volgorde primer overslaan het resterende traject van het oligo(dT) in de sequencing-reactie werd gemeld door de dezelfde auteurs 2. In een verwante methode, 3' leest 3, een ongewoon lange primer van 5 ons en 45 Ts, ook met een Biotine is gegloeid te gefragmenteerde RNA, gevolgd door strenge wast om te selecteren voor de molecules van RNA met de staart van de poly(A) van meer dan 50 nucleotiden. Hoewel 3' leest drastisch de frequentie van interne priming vermindert, doet het niet volledig elimineren het 3. Protocollen voor directe RNA sequencing hebben ook voorgesteld, maar de resulterende leest zijn kort en hebben een hoge foutenpercentage en deze aanpak is niet verder ontwikkelde 18,19,20. De PolyA-Seq en de gecommercialiseerd Quant Seq protocollen combineren oligo(dT) gebaseerd priming met een willekeurige priming stap voor de cDNA tweede onderdeel synthese 20. Het gebruik van de sjabloon switch omgekeerde transcriptie reactie met de reverse-transcriptase Moloney lymfkliertest Leukemie Virus (MMLV) leidt tot de generatie van cDNAs met de linkers in één stap en daardoor geen adapter-Dimeren kunnen worden weergegeven in de PAS-Seq en SAPAS methoden 21 , 22.
De A-seq2-methode gepresenteerd hier opvalt in het gebruik van een cleavable nucleotide (dU) binnen een biotinyleerd oligo(dT) primer. Deze wijziging combineert het nut van het verrijken van oligo(dT) gekruist, polyadenylated doelstellingen met de verwijdering van de meeste van de oligo (dT)25 sequentie van de geïsoleerde fragmenten voordat bibliotheken zijn bereid en het behoud van drie t's, die wijzen op de voorafgaande aanwezigheid van de staart van de poly(A). Daarentegen laat methoden die gebruikmaken van RNase H Schakel poly(A) uit de RNA-moleculen willekeurig als verschillende. Aangezien A-seq2, sequencing van 3' eind van de anti-zin-strengen gebeurt, wordt decollete sites voorspeld dat na het motief van de NNNNTTT aan het begin van ruwe volgorde leest bevinden. De gerandomiseerde tetramers dienen niet alleen om basis bellen maar ook in de eliminatie van PCR versterking artefacten. Langere UMIs kunnen ook worden ondergebracht. De mogelijkheid van interne priming blijft in A-seq2 en rekenkundig is gericht, eerst door teruggooi 3' eindigt met een genomically-gecodeerde, A-rijke downstream volgorde, en vervolgens door het teruggooien van 3' eind clusters die kon worden verklaard door interne priming op de A-rijke poly(A) signaal zelf. Een recente analyse van poly(A) sites uniek afgeleid door een groot aantal protocollen geeft aan dat de sites die uniek voor A-seq2 zijn de verwachte nucleotide distributie en locatie in de genen, vergelijkbaar met andere 3' eind rangschikken protocollen.
Een cruciale stap in de A-seq2 is de selectie van polyadenylated RNA en de verwijdering van ribosomaal RNAs en diverse kleine RNAs. Dit gebeurt meest gemakkelijk door een mRNA-isolatie kit met oligo (dT)25 magnetische kralen. In principe geeft totaal RNA geïsoleerd met fenol met oplossingen ook hoge kwaliteit RNA dat kan verder worden onderworpen aan selectie door de mRNA-isolatie kit of agarose oligo (dT). Een stap die kan worden gevarieerd in A-seq2 is de behandeling met alkalische hydrolyse, die kan worden ingekort of uitgebreid tot het verkrijgen van RNA fragmenten van verschillende grootte. Kritische is ook dat de toevoeging van 3' dATP aan 3' einden van RNA fragmenten door de polymerase van poly(A) efficiënt is. In het protocol beschreven hier, wordt deze behandeling toegepast op alle fragmenten van RNA, om te voorkomen dat concatemerization tijdens de afbinding reactie. Tot slot, wij stellen vast dat hoewel RNA ligase 1 gewoonlijk als een RNA-ligase gebruikt wordt, ligates het ook efficiënt één gestrande DNA, zoals wij hier hebben gedaan om een adapter aan het einde 5' van de moleculen van cDNA afbinden.
A-seq2 is dus een efficiënte en eenvoudig te implementeren protocol voor de identificatie van pre-mRNA 3' eind verwerking van sites. Toekomstige ontwikkelingen eventueel verdere vermindering van de complexiteit van het protocol en de hoeveelheid benodigde materiaal. De bijbehorende set voor computationele gegevensanalyse verder de homogene verwerking van 3' eind sequencing leest verkregen met een breed scala aan protocollen inschakelen.

De vangst en de sequencing van mRNA 3' einden maakt de studie van mRNA verwerking en de kwantificering van de genexpressie. Als gevolg van hun poly(A) staarten, kan eukaryote mRNAs gezuiverd worden efficiënt uit de cel Totaal lysates met kraal-geïmmobiliseerd oligo-deoxythymidine (oligo(dT)) moleculen, die kan ook prime cDNA synthese. Deze benadering heeft echter twee nadelen. Eerst, kunnen stukken van de A's die intern de uitgeschreven zijn ook prime cDNA synthese, resulterend in valse poly(A) sites. De rek van de tweede, homogene poly(A) vormen specifieke uitdagingen voor de sequencing, afgezien van niet informatief voor transcript identificatie. Verschillende benaderingen hebben voorgesteld te omzeilen deze beperkingen, zoals omgekeerde transcriptie via poly(A) staarten gevolgd door RNase H spijsvertering (3 P-seq 1), gebruik van een primer van de aangepaste volgorde die eindigt op 20 Ts (2 P-seq 2), preselectie van De fragmenten van RNA met de staart van de poly(A) van meer dan 50 nucleotiden met een CU5T45 primer gevolgd door RNase H spijsvertering (3' leest 3), en het gebruik van een primer oligo-dT, waarin de 3'-adapter in een haarspeld (A-seq 4).
De onlangs ontwikkelde methode A-seq2- 5 wil omzeilen sequencing via poly(A) en op hetzelfde moment te minimaliseren van het aantal Dimeren die worden gegenereerd door de zelf-Afbinding van adapters, met name die zich voordoen wanneer de molaire concentratie van adapters opweegt tegen de concentratie invoegen. Dit probleem kan worden geëlimineerd wanneer beide adapters als ligatuur zijn verbonden aan het zelfde type van polynucleotide eindigt zoals A-seq2, waar de 3'-adapters als ligatuur zijn verbonden aan het einde 5' van de fragmenten van RNA en de adapters 5' aan 5' einden van de cDNAs na omgekeerde transcriptie. De methode meer is handiger dan onze eerder voorgestelde A-seq - in die volgorde in de 5'-tot-3 was ' richting waardoor juist gecontroleerd RNA fragmentatie-, terwijl het handhaven van een hoge nauwkeurigheid van de identificatie poly(A). Ongeveer 80% van de gesequenceerd luidt in typische monsters kaart uniek aan het genoom en leiden tot identificatie van meer dan 20.000 poly(A) site clusters, meer dan 70% van die overlapping met geannoteerde 3' UTRs.
Kortom, begint het A-seq2-protocol met mRNA fragmentatie en Afbinding van omgekeerde-aanvulling 3' adapters aan de 5' einden van de fragmenten van RNA. Poly (A)-met RNAs worden vervolgens reverse transcriptie met een 25 nucleotide (nt) lange oligo(dT) primer waarin een nucleotide anker aan de 3'-eind, een dU op positie 4 en een Biotine eind 5', waardoor binding van cDNA aan magnetische daar kralen. Allermeest naar de primer, met inbegrip van de biotine, wordt verwijderd uit de cDNA door decollete in dU door de gebruiker enzym mix, met Uracil DNA glycosylase (UDG) en het DNA glycosylase-lyase Endonuclease VIII. Deze reactie laat intact uiteinden voor de afbinding van een 5'-adapter, en drie Ts links na splitsing blijven ter gelegenheid van de locatie van de poly(A) staart. Omdat zowel 5' en 3' adapters zijn aangesloten door afbinding aan geadresseerden 5' einden, worden geen adapter-Dimeren gegenereerd. Vier nucleotide willekeurige-mers geïntroduceerd aan het begin van leest cluster resolutie staat op volgorde van de state-of-the-art instrumenten en kan ook dienen als moleculaire eenduidig (UMI) voor het detecteren en verwijderen van PCR versterking artefacten. De grootte van het UMI kan verder worden verhoogd, zoals in andere studies 6gedaan. Het protocol genereert leest dat complementair is aan mRNA 3' einden, allemaal beginnen met een gerandomiseerde tetrameer gevolgd door 3 Ts. verwerking van luidt dat de 3 diagnostische Ts hebben op hun einde begint 5' met de correctie van PCR versterking artefacten door zijn afgewikkeld exploitatie van de UMIs, verwijdering van 3' adapter sequenties, en reverse complementatie. Leest dat hebben afkomstig van oligo(dT) priming op interne A-rijke sites is kunnen zijn ook rekenkundig geïdentificeerd en verwijderd. De valse sites ontbreken doorgaans een van de 18 goed gekarakteriseerd en geconserveerde poly(A) signalen die moeten gelegen ~ 21 nucleotiden stroomopwaarts van de schijnbare decollete site 7.
Het protocol vereist ongeveer 8 h hands-on tijd, niet tellen celkweek en de nachtelijke ligations. De bijbehorende Lees analyse software een zeer nauwkeurige poly(A) site identificatie mogelijk maakt. Vanaf de site van poly(A) clusters gemaakt op basis van 4 monsters verder benadrukt in dit manuscript (twee biologische replicatieonderzoeken van controle siRNA en si-HNRNPC-testgroep cellen) 84% overlapping met een geannoteerde gen, en daarvan 75% overlappen met een 3-' UTR, en 86% met ofwel een 3' UTR of een terminal exon. De Pearson-correlatiecoëfficiënt van expressie van 3' einden in de analysemonsters is 0.92 en waarden van meer dan 0,9 worden meestal verkregen met de methode. A-seq2 is dus een handige methode die zeer reproduceerbare resultaten geeft.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >Materials</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Agarose, ultra pure</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16500-500</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >2100 Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2940CA</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cordycepin triphosphate (3&#8217; dATP)</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>C9137</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DNA low bind vials, 1.5 ml</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22431021</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>D8637</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dynabeads mRNA-DIRECT Kit</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM61012</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >GR-Green dye</td>
			<td>Excellgen</td>
			<td>EG-1071</td>
			<td >use 1:10,000 dillution</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HiSeq 2500 or NextSeq 500 next generation sequencers</td>
			<td>Illumina</td>
			<td >inquire with supplier</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >KAPA HiFi Hotstart DNA polymerase mix</td>
			<td>KAPA/Roche</td>
			<td>KK2602</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Nuclease free water</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9937</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Poly(A) polymerase, yeast</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>74225Z25KU</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Poly(A) polymerase, E.coli</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0276L</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Polynucleotide kinase</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>EK0032</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >QIAEX II Gel Extraction Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>20021</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >QIAquick PCR Purification Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28104</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >QIAquick Gel Extraction Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28704</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >RNA ligase 1, high concentration</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0437M</td>
			<td >includes PEG-8000</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >RNeasy MinElute RNA Cleanup kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74204</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >RNase H</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0279</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >RNasin Plus, ribonuclease inhibitor</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2618</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Superscript IV reverse transcriptase</td>
			<td>Thermo Fisher Scientiific</td>
			<td>18090050</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Turbo DNase</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM2238</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >USER enzyme mix</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M5505</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dyna-Mag-2 magnetic rack</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12321D</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Thermomixer C</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5382000015</td>
			<td >Heated mixer with heated lid</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MicroSpin columns</td>
			<td>GE-Healthcare</td>
			<td>27-5325-01</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td >Comments</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Buffers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Alkaline hydrolysis buffer, 1.5 x</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td >Mix 1 part 0.1 M Na2CO3 and 9 parts 0.1 M NaHCO3. Add EDTA to 1 mM. Adjust pH to 9.2. Store aliquots at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >5x poly(A) polymerase buffer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientiific</td>
			<td></td>
			<td >100 mM Tris-HCl, pH 7.0, 3 mM MnCl2, 0.1 mM EDTA, 1 mM DTT, 0.5 mg/ml acetylated BSA, 50% glycerol</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Biotin binding buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td >20 mM Tris&#173;Cl pH 7.5, 2 M NaCl, 0.1% NP&#173;40</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TEN buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td >10 mM Tris&#173;Cl, pH 7.5, 1 mM EDTA, 0.02% NP&#173;40</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td >Sequence</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Oligonucleotides according to Illumina TruSeq Small RNA Sample Prep Kits, for GA-IIx and Hiseq2000/2500 sequencers</td>
			<td>Microsynth</td>
			<td></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >revRA3 (RNA)</td>
			<td>Microsynth</td>
			<td></td>
			<td >5&#8217; amino&#173; CCUUGGCACCCGAGAAUUCCA&#173; 3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >revDA5</td>
			<td>Microsynth</td>
			<td></td>
			<td >5&#8217; amino&#173; GTTCAGAGTTCTACAGTCCGAC GATCNNNN-3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Bio-dU-dT25, RT primer</td>
			<td>Microsynth</td>
			<td></td>
			<td >5&#39; Biotin-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-dU-TTTVN 3&#39; (V = G, A or C)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PCR primer forward, RP1</td>
			<td>Microsynth</td>
			<td></td>
			<td >5&#39; AATGATACGGCGACCACCGAGA TCTACACGTTCAGAGTTCTACAGTC CGA 3&#39;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PCR primer reverse, RPI1, barcode in bold</td>
			<td>Microsynth</td>
			<td></td>
			<td >5&#39; CAAGCAGAAGACGGCATACGAGA TCGTGATGTGACTGGAGTTCCTTG GCACCCGAGAATTCCA 3&#39;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td >Comments</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Oligonucleotides according to Illumina TruSeq HT-Small RNA Sample Prep Kits, for HiSeq2000/2500 and NextSeq500 sequencers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HT-rev3A (DNA/RNA)</td>
			<td>Microsynth</td>
			<td></td>
			<td >5&#39;-amino-GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCT CTTCCrGrAUrC-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HT-rev5A</td>
			<td>Microsynth</td>
			<td></td>
			<td >5&#39; amino-ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCT TCCGATCTNNNN 3&#39;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Bio-dU-dT25, RT primer</td>
			<td>Microsynth</td>
			<td></td>
			<td >5&#39; Biotin-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-dU-TTTVN 3&#39;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PCR primers forward (D501-506)</td>
			<td>Microsynth or Illumina</td>
			<td></td>
			<td >5&#39;-AATGATACGGCGACCACCGAGAT CTACAC[i5]ACACTCTTTCCCTACAC GACGCTCTTCCGATCT -3&#39;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PCR primers reverse (D701-D712)</td>
			<td>Microsynth or Illumina</td>
			<td></td>
			<td >5&#39;-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG A[i7]GTGACTGGAGTTCAGACGTG TGCTCTTCCGATC-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Documentation for Illumina multiplexing:</td>
			<td>Illumina</td>
			<td></td>
			<td >https://support.illumina.com/content/dam/illumina-support/documents/documentation/chemistry_documentation/experiment-design/illumina-adapter-sequences_1000000002694-01.pdf</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

3' end sequencing library preparation with a-seq2

Studies in de afgelopen tien jaar is gebleken een complex en dynamisch scala aan pre-mRNA decollete en polyadenylatie reacties. mRNAs met lang 3' onvertaald regio's (UTRs) worden gegenereerd in gedifferentieerde cellen overwegende dat delende cellen bij voorkeur express chat-kopieën met korte 3' UTRs. We beschrijven het A-seq-protocol, nu bij de tweede versie, die werd ontwikkeld om de kaart van de polyadenylatie sites genoom-brede en bestuderen van de verordening van pre-mRNA 3' eind verwerking. Ook maakt dit huidige protocol gebruik van de polyadenylate (poly(A)) staart die tijdens de biogenese van meest zoogdieren mRNAs te verrijken voor volledig verwerkte mRNAs worden toegevoegd. Een DNA-adapter met deoxyuracil op de vierde positie kan de precieze verwerking van mRNA 3' eind fragmenten voor het rangschikken. Exclusief de celcultuur en de nachtelijke ligations, het protocol vereist ongeveer 8 h hands-on tijd. Samen met het vindt u een easy-to-use softwarepakket voor de analyse van de afgeleide sequencing-gegevens. A-seq2 en de bijbehorende analysesoftware zorgen voor een efficiënte en betrouwbare oplossing voor de toewijzing van pre-mRNA 3' eindigt in een brede waaier van voorwaarden, van 106 of minder cellen.

Poly (A)-bevattende RNA werd geïsoleerd uit gekweekte cellen, gefragmenteerd door alkalische hydrolyse en cDNAs werden gemaakt door reverse transcriptie met oligo(dT) inleidingen. De resulterende cDNA werd geïmmobiliseerd op daar kralen, gekloofd dU was in de reactie van de specifieke excisie uracil, adapters werden afgebonden aan 5' en 3' einden van het fragment gekloofd en de inserts waren gesequentieerd. Figuur 1 toont een grafische schets van het experiment.
Voor HeLa en HEK293 cellen waren 106 cellen voldoende om het identificeren van de poly(A) sites voor de overgrote meerderheid van de eiwit-codeert genen aan het einde van de procedure. Echter, voor andere soorten cellen of weefsels die kan het nodig zijn om te testen de verzadiging in het aantal sites van de geïdentificeerde poly(A) als het aantal cellen die worden gebruikt in het experiment zijn verhoogt. Representatieve resultaten van de pilot PCR stap en van het fragment van DNA analyse van het monster vóór sequencing zijn afgebeeld in Figuur 2.
Figuur 3 toont de voorbewerkend stappen van de computationele analyse, vanaf het fastq bestand verkregen van de sequencer en eindigend met de kwaliteit-gecontroleerd, adapter-bijgesneden leest die zijn klaar om te worden toegewezen aan het genoom. Figuur 4 toont de stappen van de analyse die beginnen met de toewijzing van de luidt als volgt aan de overeenkomstige genoom en einde waarbij de catalogus met mRNA 3' eind verwerking van sites die worden geïdentificeerd in een bepaalde monster. Wanneer meerdere monsters worden geanalyseerd, worden extra stappen uitgevoerd overeenkomen met de 3'-eind verwerking van sites die werden gevonden in individuele monsters en rapporteren hun overvloed in verschillende steekproeven. Deze stappen zijn afgebeeld in Figuur 5.
Dus, zodra monsters hebben zijn sequenced, de analyse van de resulterende sequencing lezen van bestanden (in fastq formaat) via de beschikbare processing pipeline is eenvoudig. Na het toevoegen van de informatie over de monsters naar de configuratie vijl, de uitvoering van de pijpleiding zal resulteren in twee hoofdtypen van uitvoerbestanden: 1) BED-bestanden met alle 3' eindigen verwerking sites geïdentificeerd in afzonderlijke monsters (b.v. " sample1.3pSites.noIP.bed.gz"), en 2) een BED-bestand met alle poly(A) site clusters (clusters.merged.bed) over alle monsters van de studie. De uitvoer bevat tevens de genoom coördinaten voor alle leesbewerkingen van elk individuele monster (bijvoorbeeld "sample1. STAR_out/aligned.sortedByCoord.out.BAM") die later kunnen worden bekeken in de browser van een genoom zoals IGV16. Visueel onderzoek van het Lees Profiel(en) geeft in het algemeen een eerste glimp van de verdeling van de poly(A)-locaties in het genoom en de veranderingen die zich voordoen bij de specifieke verstoringen die in de studie werden uitgevoerd. Bijvoorbeeld in Figuur 6 is het antwoord van een specifiek gen op de knock-down van het eiwit HNRNPC weergegeven.
Samenvattingen van deze genoom-brede distributies zijn ook beschikbaar (tabel 1). Specifiek, output-bestanden in de directory "graven/annotation_overlap" bevatten breuken van sites die met de specifieke kenmerken van de geannoteerde overlappen (uit het gtf-bestand opgenomen als invoer; geannoteerde zijn: 3' UTR, terminal exon, exon, intron, intergenic). Tot slot, voor elk monster, resultaten van individuele verwerking stappen worden ook opgeslagen (bijvoorbeeld "sample1.summary.tsv"). Dit omvat de aantallen: rauwe leest in elk monster, luidt dat de verwachte structuur voor de 5'-eind hebben, leest die achterblijven na het instorten van de volledige PCR duplicaten, kwalitatief hoogwaardige leest volgens de criteria die bij stap 9.2, leest die kaart uniek aan het genoom (na instorten die het gevolg is van sequencing fouten, zie stap 9.5), multi toewijzing leest (na instorten die het gevolg is van sequencing fouten, zie stap 9.5), rauwe (niet-geclusterde) 3' eind verwerking van sites in elk monster, raw 3' uiteinde verwerking sites zonder potentiële interne priming kandidaten, unieke 3' eind verwerking sites van alle monsters zonder interne priming kandidaten en laatste set poly(A) site clusters.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56129/56129fig1v2.jpg"> 
Figuur 1: voornaamste stappen van het protocol van de A-seq2. Afzonderlijke stappen worden aangegeven aan de linkerkant van de figuur. Invoegen RNA fragmenten worden afgeschilderd als groene lijnen die rood voor cDNA na omgekeerde transcriptie; adapters zijn gekleurd in licht blauw of oranje. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56129/56129fig1v2large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56129/56129fig2.jpg"> 
Figuur 2: Pilot PCR en eindproduct profiel. (een) Aliquots van de PCR reactie werden verzameld bij verschillende cycli en gescheiden op 2% agarose gel. Getallen aan de linkerkant geven grootte in de nucleotiden van de respectieve bands in de DNA-ladder. In dit experiment werden 12 cycli (*) gekozen voor de grootschalige PCR reactie. (b) voorbeeld van een monster na grootte selectie uitgevoerd op een fragment grootte analyzer onthullen een gemiddelde grootte van ongeveer 280 nucleotiden. Nummers aan de linkerzijde [FU] geven relatieve signaalsterkte. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56129/56129fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56129/56129fig3.jpg"> 
Figuur 3: overzicht van de voorbehandeling van sequencing leest. De fastq bestanden met leest die worden gegenereerd door de sequencing instrument-geassocieerde software worden verwerkt om te identificeren van kwalitatief hoogwaardige leest dat wordt toegewezen aan het overeenkomstige genoom. De figuur toont de input/output-specificatie van de afzonderlijke stappen in de pijplijn, met koppelingen naar de afzonderlijke stappen van het protocol wordt beschreven in sectie "Data processing". <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56129/56129fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56129/56129fig4.jpg"> 
Figuur 4: overzicht van sequentie Lees verwerking, vanaf de stap van de toewijzing aan het genoom aan de generatie van individuele 3' eind verwerking sites. De figuur toont de input/output-specificatie van de afzonderlijke stappen in de pijplijn, met links naar de ide stappen van de ndividual van het protocol wordt beschreven in sectie "Data processing". De belangrijkste output-bestand dat wordt geleverd aan de gebruiker is gemarkeerd in vet. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56129/56129fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56129/56129fig5.jpg"> 
Figuur 5: overzicht van de stappen die worden genomen voor het genereren van clusters van mede gereglementeerde 3' eind sites sequencing. De figuur toont de input/output-specificatie van de afzonderlijke stappen in de pijplijn, met koppelingen naar de afzonderlijke stappen van het protocol wordt beschreven in sectie "Data processing". De belangrijkste output bestand is gemarkeerd in vet. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56129/56129fig5large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56129/56129fig6.jpg"> 
Figuur 6: voorbeeld van de resultaten van het profiel van 3' eind verwerking leest langs de terminal exon van het NUP214 gen, getoond in de IGV 16 genome browser. A-seq2 leest waren bereid uit twee monsters van HEK 293 cellen, behandeld met een controle-siRNA of met een HNRNPC siRNA. Het luidt dat gedocumenteerd poly(A) sites die werden geannoteerd door middel van de analyse-pijpleidingen werden opgeslagen in BAM-indeling die werd gebruikt als invoer voor de IGV genome browser. De 3' einden van de Lees pieken toewijzen aan mRNA 3' einden die zijn geannoteerd in Ensembl. De profielen geven een intensiever gebruik van de lange 3' UTR isovorm op HNRNPC knock-down. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56129/56129fig6large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>si-Control repliceren 1</td>
			<td>si-Control repliceren 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>id: 29765</td>
			<td>id: 32682</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>aantal ruwe leest</td>
			<td>44210258</td>
			<td>68570640</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>aantal geldige leest na trimmen en filteren</td>
			<td>14024538</td>
			<td>21211793</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>aantal unieke mapping leest</td>
			<td>6953674</td>
			<td>13946436</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>aantal leest toewijzen aan meerdere loci</td>
			<td>2040646</td>
			<td>2925839</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>aantal individuele 3' eindigen verwerking sites</td>
			<td>1107493</td>
			<td>1710353</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabel 1: voorbeeld van de uitvoer van de analyse-pijpleiding. Samenvattingen van leest die zijn verkregen bij afzonderlijke stappen.

Watch this Scientific Journal Video about 3' End Sequencing Library Preparation with A-seq2 at JoVE.com

3' End Sequencing Library Preparation with A-seq2

Dit protocol beschrijft een methode voor de toewijzing pre-mRNA 3' eind verwerking van sites.

3' eind Sequencing bibliotheek voorbereiding met A-seq2

Studies in the last decade have revealed a complex and dynamic variety of pre-mRNA cleavage and polyadenylation reactions. mRNAs with long 3&#39; ...

Research

JoVE Journal

Biology

Chromatin Interaction Analysis with Paired-End Tag Sequencing (ChIA-PET) for Mapping Chromatin Interactions and Understanding Transcription Regulation

Chromatin Interaction Analysis with Paired-End Tag Sequencing ChIA-PET for Mapping Chromatin Interactions and Understanding Transcription Regulation

Chromatine Interactie Analyse met gepaarde-End Tag Sequencing (Chia-PET) voor het in kaart brengen van chromatine Interacties en begrijpen Transcriptie Verordening

Genomes are organized into three-dimensional structures, adopting higher-order conformations inside the micron-sized nuclear spaces 7, 2, 12. Such ...

Analysis of RNA Processing Reactions Using Cell Free Systems: 3' End Cleavage of Pre-mRNA Substrates in vitro

Analysis of RNA Processing Reactions Using Cell Free Systems: 3' End Cleavage of Pre-mRNA Substrates in vitro

Analyse van RNA processing Reacties Met behulp van Cell Free Systems: 3 &#39;End Splitsing van pre-mRNA Substrates<em&gt; In vitro</em

The 3&#8217; end of mammalian mRNAs is not formed by abrupt termination of transcription by RNA polymerase II (RNPII). Instead, RNPII synthesizes ...

Interactome-Seq: A Protocol for Domainome Library Construction, Validation and Selection by Phage Display and Next Generation Sequencing

Interactome-Seq: Een Protocol voor Domainome bibliotheek bouw, de validatie en de selectie door Phage Display en volgende generatie sequentiebepaling

Folding reporters are proteins with easily identifiable phenotypes, such as antibiotic resistance, whose folding and function is compromised when fused to ...

Assessment of Global DNA Double-Strand End Resection using BrdU-DNA Labeling coupled with Cell Cycle Discrimination Imaging

Beoordeling van wereldwijde DNA double-strand eindresectie met behulp van BrdU-DNA-labeling in combinatie met cell cycle discrimination imaging

The study of the DNA damage response (DDR) is a complex and essential field, which has only become more important due to the use of DDR-targeting drugs ...

Application of Passive Head Motion to Generate Defined Accelerations at the Heads of Rodents

Toepassing van passieve hoofdbeweging om gedefinieerde versnellingen te genereren bij de hoofden van knaagdieren

Exercise is widely recognized as effective for various diseases and physical disorders, including those related to brain dysfunction. However, molecular ...

An Improved Chemotaxis Assay for the Rapid Identification of Rhizobacterial Chemoattractants in Root Exudates

Een verbeterde chemotaxistest voor de snelle identificatie van rhizobacteriële chemoattractanten in wortelexsudaten

Chemotaxis identification is very important for the research and application of rhizosphere growth-promoting bacteria. We established a straightforward ...

Single-Cell Suspension Preparation from Nile Tilapia Intestine for Single-Cell Sequencing

Single-Cell Suspension Voorbereiding van Nile Tilapia Intestine voor Single-Cell Sequencing

Nile tilapia is one of the most commonly cultured freshwater fish species worldwide and is a widely used research model for aquaculture fish studies. The ...

Creating Robust Bisulfite-mRNA Libraries for Transcriptome-Wide Mapping

Enrichment of mRNA and Bisulfite-mRNA Library Preparation for Next-Generation Sequencing

Decoding RNA Methylation's Role in Pancreatic Cancer - A Single-Base Resolution Study (Video) | JoVE

Verrijking van mRNA en bisulfiet-mRNA-bibliotheekvoorbereiding voor sequencing van de volgende generatie

RNA post-transcriptional modifications in various types of RNA transcripts are associated with diverse RNA regulation in eukaryotic cells. Aberrant RNA ...

Addressing Metabolomics Data Analysis Using Advanced Bioinformatics Tools

CorrelationCalculator and Filigree: Tools for Data-Driven Network Analysis of Metabolomics Data

Emerging Technologies and Advanced Tools for Decoding Metabolomics Data Analysis (Video) | JoVE

CorrelationCalculator en Filigree: tools voor datagestuurde netwerkanalyse van metabolomics-gegevens

A significant challenge in the analysis of omics data is extracting actionable biological knowledge. Metabolomics is no exception. The general problem of ...