Name: 3' end sequencing library preparation with a-seq2
Uploaded: 2017-10-10T14:00:00
Duration: 12 min 1 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about 3' End Sequencing Library Preparation with A-seq2 at JoVE.com

המחברים תודה גברת Béatrice Dimitriades על העזרה עם התרבות תאים. עבודה זו נתמכה על ידי קרן המדע הלאומית השוויצרית מענקים #31003A_170216 ו 51NF40_141735 (NCCR RNA &#38; המחלה).

<ol>
	<li>Jan, C. H., Friedman, R. C., Ruby, J. G., Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation,+regulation+and+evolution+of+Caenorhabditis+elegans+3'UTRs.">Formation, regulation and evolution of Caenorhabditis elegans 3'UTRs.</a> Nature. 469 (7328), 97-101 (2011).</li><li>Spies, N., Burge, C. B., Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3'+UTR-isoform+choice+has+limited+influence+on+the+stability+and+translational+efficiency+of+most+mRNAs+in+mouse+fibroblasts.">3' UTR-isoform choice has limited influence on the stability and translational efficiency of most mRNAs in mouse fibroblasts.</a> Genome Res. 23 (12), 2078-2090 (2013).</li><li>Hoque, M., Ji, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+alternative+cleavage+and+polyadenylation+by+3'+region+extraction+and+deep+sequencing.">Analysis of alternative cleavage and polyadenylation by 3' region extraction and deep sequencing.</a> Nat. methods. 10 (2), 133-139 (2013).</li><li>Martin, G., Gruber, A. R., Keller, W., Zavolan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+of+pre-mRNA+3’+end+processing+reveals+a+decisive+role+of+human+cleavage+factor+I+in+the+regulation+of+3'+UTR+length.">Genome-wide analysis of pre-mRNA 3’ end processing reveals a decisive role of human cleavage factor I in the regulation of 3' UTR length.</a> Cell Rep. 1 (6), 753-763 (2012).</li><li>Gruber, A. R., Martin, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+3'+UTR+shortening+has+a+limited+effect+on+protein+abundance+in+proliferating+T+cells.">Global 3' UTR shortening has a limited effect on protein abundance in proliferating T cells.</a> Nat. Commun. 5, 5465 (2014).</li><li>Kivioja, T., V&#228;h&#228;rautio, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Counting+absolute+numbers+of+molecules+using+unique+molecular+identifiers.">Counting absolute numbers of molecules using unique molecular identifiers.</a> Nat. methods. 9 (1), 72-74 (2011).</li><li>Gruber, A. J., Schmidt, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+analysis+of+3'+end+sequencing+data+sets+reveals+novel+polyadenylation+signals+and+the+repressive+role+of+heterogeneous+ribonucleoprotein+C+on+cleavage+and+polyadenylation.">A comprehensive analysis of 3' end sequencing data sets reveals novel polyadenylation signals and the repressive role of heterogeneous ribonucleoprotein C on cleavage and polyadenylation.</a> Genome Res. 26 (8), 1145-1159 (2016).</li><li>Lingner, J., Keller, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3'-end+labeling+of+RNA+with+recombinant+yeast+poly(A)+polymerase.">3'-end labeling of RNA with recombinant yeast poly(A) polymerase.</a> Nucleic Acids Res. 21 (12), 2917-2920 (1993).</li><li>Quail, M. A., Kozarewa, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+large+genome+center's+improvements+to+the+Illumina+sequencing+system.">A large genome center's improvements to the Illumina sequencing system.</a> Nat. methods. 5 (12), 1005-1010 (2008).</li><li>Rahmann, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Snakemake--a+scalable+bioinformatics+workflow+engine.">Snakemake--a scalable bioinformatics workflow engine.</a> Bioinformatics. 28 (19), 2520-2522 (2012).</li><li>. Anaconda Software Distribution Available from: <a target="_blank" href="https://continuum.io">https://continuum.io</a> (2016)</li><li>Dobin, A., Davis, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STAR:+ultrafast+universal+RNA-seq+aligner.">STAR: ultrafast universal RNA-seq aligner.</a> Bioinformatics. 29 (1), 15-21 (2013).</li><li>Martin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutadapt+removes+adapter+sequences+from+high-throughput+sequencing+reads.">Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads.</a> EMBnet.journal. 17 (1), 10-12 (2011).</li><li>Li, H., Handsaker, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Sequence+Alignment/Map+format+and+SAMtools.">The Sequence Alignment/Map format and SAMtools.</a> Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).</li><li>Robinson, J. T., Thorvaldsd&#243;ttir, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrative+genomics+viewer.">Integrative genomics viewer.</a> Nat. Biotechnol. 29 (1), 24-26 (2011).</li><li>Quinlan, A. R., Hall, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BEDTools:+a+flexible+suite+of+utilities+for+comparing+genomic+features.">BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features.</a> Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).</li><li>Ozsolak, F., Platt, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+RNA+sequencing.">Direct RNA sequencing.</a> Nature. 461 (7265), 814-818 (2009).</li><li>Yao, C., Biesinger, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome-wide+analyses+of+CstF64-RNA+interactions+in+global+regulation+of+mRNA+alternative+polyadenylation.">Transcriptome-wide analyses of CstF64-RNA interactions in global regulation of mRNA alternative polyadenylation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109 (46), 18773-18778 (2012).</li><li>Lin, Y., Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in-depth+map+of+polyadenylation+sites+in+cancer.">An in-depth map of polyadenylation sites in cancer.</a> Nucleic Acids Res. 40 (17), 8460-8471 (2012).</li><li>Shepard, P. J., Choi, E. -. A., Lu, J., Flanagan, L. A., Hertel, K. J., Shi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+and+dynamic+landscape+of+RNA+polyadenylation+revealed+by+PAS-Seq.">Complex and dynamic landscape of RNA polyadenylation revealed by PAS-Seq.</a> RNA. 17 (4), 761-772 (2011).</li><li>Fu, Y., Sun, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+genome-wide+profiling+of+tandem+3'+UTRs+among+human+breast+cancer+and+normal+cells+by+high-throughput+sequencing.">Differential genome-wide profiling of tandem 3' UTRs among human breast cancer and normal cells by high-throughput sequencing.</a> Genome Res. 21 (5), 741-747 (2011).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

ריבוי של עזר הגורמים המעורבים בעיבוד pre-mRNA 3' הקצה והליבה משתקף נוף פוליאדנילציה מורכב בהתאמה. בנוסף, פוליאדנילציה הוא גם מגיב לשינויים בתהליכים אחרים כגון שעתוק ו שחבור. 3' סוף המחשוף אתרים ב- pre-mRNAs מזוהים בדרך כלל בהתבסס על זנבות poly(A) האופיינית הנוספים למוצרים המחשוף 5'. רוב שיטות להשתמש oligo(dT) תחל באורכים משתנים המאפשרות המרה ספציפי של פולי (א)-המכיל mRNAs ל cDNAs בתגובה שעתוק במהופך. בעיה נפוצה של גישה זו הוא פנימי לקרקע כדי רצפים א-עשיר וכתוצאה מכך המחשוף מלאכותית אתרים. הוצעו שתי שיטות שמטרתן לעקוף את החפץ הזה בשלב של הכנת הדוגמא. P 3-seq בשיטה 1, מתאמי במיוחד מאתרים בקצוות של זנבות poly(A) עם עזרה של oligo סד ואחריו לעיכול RNase T1 חלקי, שעתוק במהופך עם טרומבוציטופניה, בעקבות התגובות כמו deoxynucleotide היחידה. Heteroduplexes poly(A)-poly(dT) וכתוצאה מכך מתעכלים ואז עם RNase H, והשריד RNA הם מבודדים מאתרים למתאמים, וסודרו. פשוט ואלגנטי שיטה, P 2-seq, המשתמשת פריימר רצף מותאם אישית דילוג רצועת oligo(dT) שנותרו בעקבות רצף תגובות דווח על ידי מחברים אותו 2. בשיטת קשורים, 3' קורא 3, פריימר רב מהמשוער מתוך 5 לנו 45 Ts, מכיל גם של ביוטין הוא annealed ל RNA מפוצלים, ואחריו שוטף מחמירים כדי לבחור עבור מולקולות RNA עם poly(A) זנבות של נוקלאוטידים מעל 50. למרות 3' קריאות באופן דרסטי מפחית את התדירות של לקרקע פנימי, זה לא מונע לחלוטין את זה 3. גם יש כבר הציע פרוטוקולים עבור רצפי RNA ישיר, אבל קריאות וכתוצאה מכך הם קצרים ואם יש שיעור גבוה של שגיאה, גישה זו לא הייתה יותר מפותחת 18,19,20. תיקים עשויים-Seq, הפרוטוקולים חשבים Seq ממוסחר לשלב oligo(dT) מבוסס לקרקע עם צעד לקרקע אקראי עבור ה cDNA השני סטרנד סינתזה 20. השימוש של התגובה שעתוק במהופך בורר תבנית עם רוורס טרנסקריפטאז Moloney מאתר לוקמיה וירוס (MMLV) מוביל אל הדור של cDNAs עם linkers בשלב אחד, ובכך אין הדימרים מתאם יכול להופיע PAS-Seq ופעולות SAPAS 21 , 22.
בשיטת א-seq2 המובאת כאן בולט שלה ניצול נוקלאוטיד cleavable (דו) בתוך פריימר oligo(dT) biotinylated. שינוי זה משלב את התועלת של העשרת oligo(dT) hybridized, polyadenylated מטרות עם ההסרה של רוב הרצף25 oligo (dT) מן השברים מבודד לפני ספריות מוכנות ושמירה על שלושה Ts, אשר מצביעים על נוכחות מוקדמת של הזנב poly(A). לעומת זאת, שיטות לנצל RNase H כדי להסיר poly(A) של מולקולות RNA באקראי להשאיר מספר כמו. מאז ב- A-seq2, רצף נעשית מקצה 3' גדילים תחושה אנטי, המחשוף אתרים הם חזו את להיות ממוקם לאחר מוטיב NNNNTTT בראשית קורא רצף raw. Tetramers אקראי לשמש לא רק כדי לאפשר בסיס התקשרות אלא גם חיסול של PCR הגברה חפצים. גם ניתן לאכלס יותר UMIs. האפשרות לראשוניות פנימי נשאר ב- A-seq2, מופנית שהמפתחות, תחילה על-ידי מחיקת 3' מסתיים עם רצף במורד הזרם מקודד genomically, A-עשיר ולאחר מכן על-ידי מחיקת 3' סוף אשכולות שלא ניתן להסביר על ידי לקרקע פנימי- האות A עשיר poly(A) עצמה. ניתוח האחרונות של אתרי poly(A) להסיק באופן ייחודי על ידי מספר רב של פרוטוקולים מציין באתרים ייחודיים A-seq2 יש את התפלגות נוקלאוטיד הצפוי ואת המיקום בתוך גנים, הדומה אחרים 3' לסיים את רצפי פרוטוקולים.
שלב קריטי ב- A-seq2 הוא הבחירה של polyadenylated RNA הסרת ribosomal RNAs RNAs קטנים שונים. הדבר מתבצע בקלות הרבה ביותר על-ידי ערכת ה-mRNA-בידוד עם oligo (dT)25 beads מגנטי. בעקרון, הכולל RNA מבודדת עם פנול המכיל פתרונות גם נותן באיכות גבוהה RNA יכולה להיות עוד יותר נתונה לבחירה על ידי ערכת ה-mRNA-בידוד או oligo (dT) agarose. צעד זה יכולים להיות מגוונים ב- A-seq2 הוא הטיפול עם אלקליין הידרוליזה שניתן מקוצר או מורחב כדי להשיג RNA מקטעי בגדלים שונים. קריטי הוא גם תוספת של 3' dATP 3' הקצוות של קטעים RNA באמצעות פולימראז poly(A) זה יעיל. בפרוטוקול המתוארים כאן, טיפול זה מוחל על כל חלקי רנ א, כדי להימנע concatemerization במהלך התגובה מצדו. ולבסוף, נציין כי למרות רנ א ליגאז 1 משמש בדרך כלל ליגאז RNA, זה גם ligates ה-DNA נטושים יחיד ביעילות, כפי שעשינו כאן. מאתרים ומפסיקים להשתמש במתאם כדי 5' סוף cDNA מולקולות.
לכן, הוא א-seq2 יעיל וקל ליישם פרוטוקול לצורך זיהוי ה-pre-mRNA 3' סוף עיבוד אתרים. התפתחויות עתידיות יכולות לכלול שמצמצם עוד יותר את המורכבות את הפרוטוקול ואת כמות החומר הנדרש. קבוצת כלי ניתוח נתונים חישובית נוספים הקשורים מאפשרים עיבוד הומוגנית של 3' סיום רצף קריאות שהושג עם מגוון רחב של פרוטוקולים.

לכידת ורצף של mRNA 3' הקצוות מאפשר חקר עיבוד mRNA כימות של ביטוי גנים. עקב הזנבות שלהם poly(A), mRNAs האיקריוטים יכול ביעילות להיטהר מן התא סך הכל lysates עם חרוז. מרותק למיטה oligo-deoxythymidine (oligo(dT)) מולקולות, אשר יכול גם פריים cDNA סינתזה. עם זאת, גישה זו יש שני חסרונות. ראשית, המופרת של א' כי הם פנימי תעתיקים יכול גם פריים cDNA סינתזה, וכתוצאה מכך אתרי poly(A) כדין. Poly(A) השני, הומוגניות מותח מהוות אתגרים ספציפיים עבור רצף, מלבד היותו לא אינפורמטיבי לזיהוי תעתיק. גישות שונות הוצעו כדי לעקוף את מגבלות אלו, כגון שעתוק במהופך דרך poly(A) זנבות ואחריו RNase H עיכול (seq P 3- 1), שימוש פריימר רצף מותאם אישית המסתיימת ב- 20 Ts (2, P-seq 2), פולסים עם כיוון מוקדם של שברי RNA עם poly(A) זנבות של נוקלאוטידים מעל 50 עם פריימר45 CU5T ולאחריו RNase H עיכול (3' קריאות 3), ושימוש של פריימר oligo-dT המכיל 3' המתאם סיכת ראש (A-seq 4).
שיטה א'-seq2 פיתחה לאחרונה 5 שואפת לעקוף את רצף דרך poly(A), באותו זמן כדי למזער את הפרופורציה של הדימרים הנוצרים על-ידי עצמית מצדו של מתאמי, במיוחד המתרחשים כאשר ריכוז מולרי של מתאמי עולה ריכוז הוספה. בעיה זו ניתן לסלק כאשר שני מתאמי מאתרים לאותו סוג של polynucleotide מסתיים כמו א-seq2, שבו 3' המתאמים מאתרים לסוף 5' קטעים RNA, המתאמים 5' 5' בסוף cDNAs לאחר שעתוק במהופך. השיטה היא נוחה יותר מאשר שלנו בעבר המוצע A-seq - שבו היה רצף של 5'-כדי-3 ' כיוון ובכך הדורשות דיוק נשלט RNA פיצול-, תוך שמירה על רמת דיוק גבוהה של זיהוי אתר poly(A). סביב 80% הקריאות ברצף בדגימות טיפוסי למפות באופן ייחודי הגנום, להוביל זיהוי של יותר מ-20,000 poly(A) אתר אשכולות, יותר מ-70% אשר חופפים עם המבואר 3' UTRs.
בקצרה, פרוטוקול א-seq2 מתחיל עם ה-mRNA ולהפיק מצדו של מתאמי הפוכה המשלים 3' 5' בקצוות של קטעים RNA. פוליפוני (א)-RNAs המכיל נארזים הפוכה עיבד עם פריימר oligo(dT) ארוך נוקלאוטיד 25 (nt) המכיל של נוקלאוטיד עיגון בקצה 3', על dU במיקום 4 ו של ביוטין 5' בסוף, המאפשר קשירה של cDNA כדי streptavidin מגנטי חרוזים. רוב הראשיים, כולל של ביוטין, יוסר cDNA על-ידי פצילות ב- dU על ידי שילוב אנזים המשתמש, המכילה DNA אורציל glycosylase (UDG), את ה-DNA glycosylase-lyase Endonuclease השמיני. התגובה הזו יוצא מסתיימת ללא פגע מצדו של מתאם 5', ואת השמאלית Ts שלושה לאחר המחשוף להישאר כדי לסמן את המיקום של הזנב poly(A). כי 5' והן 3' מתאמים המחוברים על ידי מצדו הנמען 5' הקצוות, הדימרים מתאם לא נוצרים. ארבעה נוקלאוטיד אקראי-שהרובוט הציג בראשית קורא מאפשר רזולוציה אשכול בכלים רצף המדינה-of-the-art, יכול לשמש גם מזהה ייחודי מולקולרית (UMI) באיתור ובהסרה של PCR הגברה חפצים. הגודל של UMI ניתן להגדיל עוד יותר כפי שנעשה מחקרים אחרים 6. הפרוטוקול יוצר קריאות שמבטלות משלימים mRNA 3' הקצוות, הכל מתחיל עם tetramer אקראי ואחריו 3 Ts. עיבוד של קורא את יש את 3 Ts האבחון שלהם 5' סוף מתחיל התיקון של ה-PCR הגברה חפצים על ידי ניצול של UMIs, הסרה של 3' מתאם רצפים, ולהפוך קומפלמנטציה. קריאות כי ייתכן שיש מקורם oligo(dT) לקרקע באתרים A עשיר פנימי גם מזוהה שהמפתחות, יימחקו. האתרים כדין בדרך כלל חסר אחד 18 מאופיין היטב וממוקם אותות poly(A) שנשמרת שאמור להיות ~ 21 נוקלאוטידים במעלה הזרם של האתר המחשוף לכאורה 7.
הפרוטוקול דורש כ 8 הפעם תרגולים h, לא כולל תרבית תאים, את ligations לילה. המשויך לקרוא ניתוח תוכנה מאפשרת זיהוי אתר של poly(A) ומדויקים. מתוך אתר poly(A) אשכולות שנוצרו בהתבסס על דגימות 4 מודגשת עוד יותר את כתב היד (שני ביולוגי ושכפול של שליטה siRNA ותאים סי HNRNPC-שטופלו) 84% חפיפה עם ג'ין המבואר, ועל אלה, 75% חפיפה עם 3' UTR, 86% עם כל אחד 3' UTR או של אקסון מסוף. מקדם המתאם פירסון של ביטוי של 3' קצוות הדגימות שכפל 0.92, הערכים של מעל 0.9 מתקבלים בדרך כלל עם השיטה. לפיכך, A-seq2 היא שיטה נוחה זה נותן תוצאות מאוד לשחזור.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >Materials</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Agarose, ultra pure</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16500-500</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >2100 Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2940CA</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cordycepin triphosphate (3&#8217; dATP)</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>C9137</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DNA low bind vials, 1.5 ml</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22431021</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>D8637</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dynabeads mRNA-DIRECT Kit</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM61012</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >GR-Green dye</td>
			<td>Excellgen</td>
			<td>EG-1071</td>
			<td >use 1:10,000 dillution</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HiSeq 2500 or NextSeq 500 next generation sequencers</td>
			<td>Illumina</td>
			<td >inquire with supplier</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >KAPA HiFi Hotstart DNA polymerase mix</td>
			<td>KAPA/Roche</td>
			<td>KK2602</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Nuclease free water</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9937</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Poly(A) polymerase, yeast</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>74225Z25KU</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Poly(A) polymerase, E.coli</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0276L</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Polynucleotide kinase</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>EK0032</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >QIAEX II Gel Extraction Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>20021</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >QIAquick PCR Purification Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28104</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >QIAquick Gel Extraction Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28704</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >RNA ligase 1, high concentration</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0437M</td>
			<td >includes PEG-8000</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >RNeasy MinElute RNA Cleanup kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74204</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >RNase H</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0279</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >RNasin Plus, ribonuclease inhibitor</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2618</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Superscript IV reverse transcriptase</td>
			<td>Thermo Fisher Scientiific</td>
			<td>18090050</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Turbo DNase</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM2238</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >USER enzyme mix</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M5505</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dyna-Mag-2 magnetic rack</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12321D</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Thermomixer C</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5382000015</td>
			<td >Heated mixer with heated lid</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MicroSpin columns</td>
			<td>GE-Healthcare</td>
			<td>27-5325-01</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td >Comments</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Buffers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Alkaline hydrolysis buffer, 1.5 x</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td >Mix 1 part 0.1 M Na2CO3 and 9 parts 0.1 M NaHCO3. Add EDTA to 1 mM. Adjust pH to 9.2. Store aliquots at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >5x poly(A) polymerase buffer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientiific</td>
			<td></td>
			<td >100 mM Tris-HCl, pH 7.0, 3 mM MnCl2, 0.1 mM EDTA, 1 mM DTT, 0.5 mg/ml acetylated BSA, 50% glycerol</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Biotin binding buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td >20 mM Tris&#173;Cl pH 7.5, 2 M NaCl, 0.1% NP&#173;40</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TEN buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td >10 mM Tris&#173;Cl, pH 7.5, 1 mM EDTA, 0.02% NP&#173;40</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td >Sequence</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Oligonucleotides according to Illumina TruSeq Small RNA Sample Prep Kits, for GA-IIx and Hiseq2000/2500 sequencers</td>
			<td>Microsynth</td>
			<td></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >revRA3 (RNA)</td>
			<td>Microsynth</td>
			<td></td>
			<td >5&#8217; amino&#173; CCUUGGCACCCGAGAAUUCCA&#173; 3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >revDA5</td>
			<td>Microsynth</td>
			<td></td>
			<td >5&#8217; amino&#173; GTTCAGAGTTCTACAGTCCGAC GATCNNNN-3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Bio-dU-dT25, RT primer</td>
			<td>Microsynth</td>
			<td></td>
			<td >5&#39; Biotin-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-dU-TTTVN 3&#39; (V = G, A or C)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PCR primer forward, RP1</td>
			<td>Microsynth</td>
			<td></td>
			<td >5&#39; AATGATACGGCGACCACCGAGA TCTACACGTTCAGAGTTCTACAGTC CGA 3&#39;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PCR primer reverse, RPI1, barcode in bold</td>
			<td>Microsynth</td>
			<td></td>
			<td >5&#39; CAAGCAGAAGACGGCATACGAGA TCGTGATGTGACTGGAGTTCCTTG GCACCCGAGAATTCCA 3&#39;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td >Comments</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Oligonucleotides according to Illumina TruSeq HT-Small RNA Sample Prep Kits, for HiSeq2000/2500 and NextSeq500 sequencers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HT-rev3A (DNA/RNA)</td>
			<td>Microsynth</td>
			<td></td>
			<td >5&#39;-amino-GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCT CTTCCrGrAUrC-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HT-rev5A</td>
			<td>Microsynth</td>
			<td></td>
			<td >5&#39; amino-ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCT TCCGATCTNNNN 3&#39;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Bio-dU-dT25, RT primer</td>
			<td>Microsynth</td>
			<td></td>
			<td >5&#39; Biotin-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-dU-TTTVN 3&#39;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PCR primers forward (D501-506)</td>
			<td>Microsynth or Illumina</td>
			<td></td>
			<td >5&#39;-AATGATACGGCGACCACCGAGAT CTACAC[i5]ACACTCTTTCCCTACAC GACGCTCTTCCGATCT -3&#39;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PCR primers reverse (D701-D712)</td>
			<td>Microsynth or Illumina</td>
			<td></td>
			<td >5&#39;-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG A[i7]GTGACTGGAGTTCAGACGTG TGCTCTTCCGATC-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Documentation for Illumina multiplexing:</td>
			<td>Illumina</td>
			<td></td>
			<td >https://support.illumina.com/content/dam/illumina-support/documents/documentation/chemistry_documentation/experiment-design/illumina-adapter-sequences_1000000002694-01.pdf</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

3' end sequencing library preparation with a-seq2

מחקרים בעשור האחרון נחשפו מגוון מורכב ודינמי, של ה-pre-mRNA המחשוף ותגובות פוליאדנילציה. mRNAs עם זמן 3' ללא תרגום אזורים (UTRs) נוצרות בתאים הבדיל ואילו תאים מתרבים מעדיפים לבטא תעתיקים עם קצר 3' UTRs. אנו מתארים פרוטוקול A-seq, (י) בהגרסה השנייה שלה, אשר פותחה כדי למפות פוליאדנילציה אתרים ברמת הגנום וללמוד ברגולציה של ה-pre-mRNA 3' סיום העיבוד. גם בפרוטוקול הנוכחי זה מנצל polyadenylate (זנב poly(A)) הנוספים במהלך להן של mRNAs יונקים ביותר להעשיר עבור mRNAs מעובד באופן מלא. מתאם ה-DNA עם deoxyuracil על מעמדה הרביעי מאפשר עיבוד מדויק של קצה 3' mRNA קטעים על רצף. לא כולל התרבות תאים, את ligations בין לילה, הפרוטוקול דורש כ 8 h הפעם תרגולים. יחד עם זאת, חבילת תוכנה קלה לשימוש עבור הניתוח של הנתונים רצף נגזר מסופק. A-seq2 ותוכנת ניתוח המשויך לספק פתרון יעיל ואמין המיפוי של 3' ה-pre-mRNA מסתיים במגוון רחב של מחלות, מ-106 או פחות תאים.

פוליפוני (א)-המכיל RNA היה מבודד מן התאים בתרבית, מפוצל על ידי הידרוליזה אלקליין, cDNAs נעשו על ידי הפוך תמלול עם תחל oligo(dT). CDNA וכתוצאה מכך היה מתאושש על streptavidin חרוזים, dU היה ביקע ב התגובה כריתה מסוים אורציל, מתאמי היו מאתרים כדי 5' ו 3' קצוות השבר cleaved ושל השרוול היו וסודרו. איור 1 מציג קו מיתאר גרפי של הניסוי.
עבור תאים הלה ו- HEK293, 106 תאים היו מספיקות לזהות אתרי poly(A) עבור הרוב המכריע של חלבונים גנים בסופו של ההליך. עם זאת, עבור סוגי תאים או רקמות שייתכן צורך לבדוק את הרוויה במספר אתרים poly(A) מזוהה כמספר של תאים המשמשים את הניסוי אחרים מגדילה. תוצאות נציג ה-PCR פיילוט צעד, של המקטע דנ א ניתוח המדגם לפני רצף מוצגים באיור2.
איור 3 מראה את השלבים מראש עיבוד של ניתוח חישובית, החל מקובץ fastq המתקבל הרצפים (sequencer) ומסתיימת בדקנו איכות, חיתוך מתאם קריאות לפיהן ניתן למפות את הגנום. איור 4 מציג את השלבים ניתוח המתחילות המיפוי הקריאות הגנום ולסוף המתאים עם הקטלוג של mRNA 3' end עיבוד אתרים המזוהים ב מדגם מסוים. כאשר מספר דוגמאות מנותחות, פעולות נוספות מתבצעות כדי להתאים את הקצה 3' עיבוד אתרים שנמצאו דוגמאות בודדות ולדווח שלהם שפע מדגמים. השלבים הבאים מוצגים באיור5.
לכן, ברגע שיש כבר וסודרו דגימות, הניתוח של הרצף וכתוצאה מכך. לקרוא את הקבצים (בפורמט fastq) דרך צינור עיבוד זמין היא פשוטה. לאחר הוספת מידע אודות הדגימות לקובץ התצורה, ההוצאה להורג של הצינור תגרום שני סוגים עיקריים של קבצי פלט: 1) מיטה-קבצים עם כל 3' סוף אתרי עיבוד מזוהה בדגימות בודדים (למשל " sample1.3pSites.noIP.bed.gz"), ו- 2) מיטה-קובץ עם כל אשכולות באתר poly(A) (clusters.merged.bed) בכל הדוגמאות של המחקר. הפלט כולל גם את נקודות הציון של הגנום עבור כל פעולות הקריאה של כל דגימה בודדת (למשל "sample1. STAR_out/Aligned.sortedByCoord.out.bam") אשר מאוחר יותר ניתן להציג בדפדפן הגנום igv ב16. בדיקה ויזואלית של פרופילי קרא בדרך כלל מספק הצצה ראשונה של ההתפלגות poly(A) אתרים הגנום, השינויים המתרחשים בעת לפליטת ספציפיות שבוצעו במסגרת המחקר. לדוגמה, באיור 6 מוצג התגובה של גנים ספציפיים הדפיקה למטה של החלבון HNRNPC.
סיכומים של הפצות הגנום כולו אלה הינם גם מסופקים (טבלה 1). באופן ספציפי, קבצי פלט בספריה "ספירות/annotation_overlap" מכילים שברים של אתרים חפיפה עם תכונות המבואר ספציפיות (מהקובץ gtf סיפק כקלט; מבואר מסודרים: 3' UTR, אקסון מסוף, אקסון, אינטרון, intergenic). לבסוף, עבור כל דגימה, התוצאות של שלבי עיבוד בודדים גם נשמרים (למשל "sample1.summary.tsv"). זה כולל את המספרים של: קריאות raw כל דגימה, קריאות בעלות המבנה הצפוי בקצה 5', קריאות שנותרו לאחר כיווץ כפילויות PCR מלא, באיכות גבוהה קורא על-פי הקריטריונים שהוגדרו בשלב 9.2, קורא את המפה באופן ייחודי כדי הגנום (לאחר כיווץ אלו שנבעו רצף שגיאות, ראה שלב 9.5), מיפוי מרובה קורא (לאחר כיווץ אלו שנבעו רצף שגיאות, ראה שלב 9.5), raw (לא מקובצים באשכולות) 3' סוף עיבוד אתרים בשני צדדיו דוגמה, raw 3' עיבוד אתרים בלי מועמדים פוטנציאליים לקרקע פנימי, ייחודי 3' סוף אתרי עיבוד של כל הדגימות בלי מועמדים פנימיים לקרקע, קבוצה סופית של poly(A) אתר אשכולות.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56129/56129fig1v2.jpg"> 
איור 1: שלבים עיקריים של פרוטוקול א-seq2. צעדים בודדים נקובים על הצד השמאלי של האיור. הוספה RNA מקטעי מתוארים בקווים זה הופך לאדום עבור cDNA לאחר שעתוק במהופך; מתאמי הם בצבע כחול בהיר או תפוז. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56129/56129fig1v2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56129/56129fig2.jpg"> 
איור 2: טייס ה-PCR ופרופיל המוצר הסופי- () Aliquots מן התגובה PCR היו שנאספו מחזורים שונים ומופרדות על 2% agarose ג'לים. המספרים שמאלה מציינים גודל נוקלאוטידים הלהקות בהתאמה בסולם הדנ א. בניסוי זה נבחרו 12 מחזורים (*) עבור התגובה PCR בקנה מידה גדול. (b) דוגמה של מדגם לאחר בחירת גודל לרוץ על מנתח גודל המקטע חושפני עם גודל ממוצע של נוקלאוטידים בסביבות 280. המספרים שמאלה [פו] מציינים עוצמת האות יחסית. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56129/56129fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56129/56129fig3.jpg"> 
איור 3: חלוקה של עיבוד קדם רצף קריאות. הקבצים fastq עם קריאות הנוצרים על-ידי התוכנה כלי-הקשורים רצף מעובדים לזהות קריאות באיכות גבוהה זה ניתן למפות את הגנום המתאימים. האיור מציג את המפרט קלט/פלט של צעדים בודדים בצנרת, עם קישורים אל המדרגות בודדים של הפרוטוקול המתואר בסעיף "עיבוד נתונים". <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56129/56129fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56129/56129fig4.jpg"> 
איור 4: חלוקה של רצף לקרוא עיבוד, מן השלב של מיפוי הגנום לדור של הפרט 3' סוף אתרי עיבוד. האיור מציג את המפרט קלט/פלט של צעדים בודדים בצנרת, עם קישורים iצעדים והקבוצתית של הפרוטוקול המתואר בסעיף "עיבוד נתונים". קובץ הפלט הראשי הנשלחת למשתמש מסומן באותיות מודגשות. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56129/56129fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56129/56129fig5.jpg"> 
איור 5: קווי המתאר של הפעולות הננקטות כדי להפיק אשכולות של שיתוף מוסדר 3' סיום רצף אתרים- האיור מציג את המפרט קלט/פלט של צעדים בודדים בצנרת, עם קישורים אל המדרגות בודדים של הפרוטוקול המתואר בסעיף "עיבוד נתונים". קובץ הפלט הראשי מסומן באותיות מודגשות. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56129/56129fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56129/56129fig6.jpg"> 
איור 6: תוצאות דוגמה לפרופיל של 3' לסיים את עיבוד קריאות לאורך אקסון מסוף של הגן NUP214, שמוצג בדפדפן הגנום 16 igv ב. A-seq2 קריאות הוכנו מדגימות שני תאים HEK 293, מטופלים עם שליטה-siRNA או עם siRNA HNRNPC. קריאות שתועדו אתרי poly(A) היו מוערת על-ידי הצבר ניתוח נשמרו בתבנית באם ששימש כקלט לדפדפן הגנום igv. הקצוות 3' של הפסגות לקרוא מפה 3' ה-mRNA מסתיים כי הם מבואר ב- Ensembl. הפרופילים מצביעים על שימוש מוגבר ארוך 3' UTR isoform על HNRNPC דפיקה למטה. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56129/56129fig6large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>סי-בקרת שכפול 1</td>
			<td>סי-בקרת שכפול 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>קוד: 29765</td>
			<td>קוד: 32682</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>מספר הקריאות raw</td>
			<td>44210258</td>
			<td>68570640</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>מספר הקריאות בתוקף לאחר קיצוץ וסינון</td>
			<td>14024538</td>
			<td>21211793</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>מספר ייחודי מיפוי קריאות</td>
			<td>6953674</td>
			<td>13946436</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>מספר הקריאות מיפוי מנחלת מרובים</td>
			<td>2040646</td>
			<td>2925839</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>מספר בודדים 3' סוף אתרי עיבוד</td>
			<td>1107493</td>
			<td>1710353</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
טבלה 1: דוגמה פלט של הצינור ניתוח. סיכומים של קורא את התקבלו ב צעדים בודדים.

Watch this Scientific Journal Video about 3' End Sequencing Library Preparation with A-seq2 at JoVE.com

3' End Sequencing Library Preparation with A-seq2

פרוטוקול זה מתאר שיטת ה-pre-mRNA מיפוי 3' עיבוד אתרי קצה.

3' סיום רצף ספריית הכנה עם א-seq2

Studies in the last decade have revealed a complex and dynamic variety of pre-mRNA cleavage and polyadenylation reactions. mRNAs with long 3&#39; ...

Research

JoVE Journal

Biology

Chromatin Interaction Analysis with Paired-End Tag Sequencing (ChIA-PET) for Mapping Chromatin Interactions and Understanding Transcription Regulation

Chromatin Interaction Analysis with Paired-End Tag Sequencing ChIA-PET for Mapping Chromatin Interactions and Understanding Transcription Regulation

הכרומטין ניתוח אינטראקציה עם מנבא סוף תג הרצף (Chia-PET) עבור מיפוי אינטראקציות הכרומטין הבנת תקנה תמלול

Genomes are organized into three-dimensional structures, adopting higher-order conformations inside the micron-sized nuclear spaces 7, 2, 12. Such ...

Analysis of RNA Processing Reactions Using Cell Free Systems: 3' End Cleavage of Pre-mRNA Substrates in vitro

Analysis of RNA Processing Reactions Using Cell Free Systems: 3' End Cleavage of Pre-mRNA Substrates in vitro

ניתוח של תגובות RNA עיבוד באמצעות מערכות חינם ניידים: 3 &#39;סוף המחשוף של Pre-mRNA מצעים<em&gt; במבחנה</em

The 3&#8217; end of mammalian mRNAs is not formed by abrupt termination of transcription by RNA polymerase II (RNPII). Instead, RNPII synthesizes ...

Interactome-Seq: A Protocol for Domainome Library Construction, Validation and Selection by Phage Display and Next Generation Sequencing

Interactome-Seq: פרוטוקול עבור ספריית Domainome ובניה, אימות בחירה Phage התצוגה ורצף הדור הבא

Folding reporters are proteins with easily identifiable phenotypes, such as antibiotic resistance, whose folding and function is compromised when fused to ...

Assessment of Global DNA Double-Strand End Resection using BrdU-DNA Labeling coupled with Cell Cycle Discrimination Imaging

הערכה של כריתת קצה כפולת גדילים של DNA גלובלי באמצעות תיוג BrdU-DNA בשילוב עם הדמיית אפליה במחזור התא

The study of the DNA damage response (DDR) is a complex and essential field, which has only become more important due to the use of DDR-targeting drugs ...

Application of Passive Head Motion to Generate Defined Accelerations at the Heads of Rodents

יישום של תנועת ראש פסיבית ליצירת תאוצות מוגדרות בראשי מכרסמים

Exercise is widely recognized as effective for various diseases and physical disorders, including those related to brain dysfunction. However, molecular ...

An Improved Chemotaxis Assay for the Rapid Identification of Rhizobacterial Chemoattractants in Root Exudates

בדיקת כימוטקסיס משופרת לזיהוי מהיר של כימותרפים ריזובקטריאליים באקסודות שורש

Chemotaxis identification is very important for the research and application of rhizosphere growth-promoting bacteria. We established a straightforward ...

Single-Cell Suspension Preparation from Nile Tilapia Intestine for Single-Cell Sequencing

הכנת תרחיף חד-תאי ממעי אמנון הנילוס לריצוף חד-תאי

Nile tilapia is one of the most commonly cultured freshwater fish species worldwide and is a widely used research model for aquaculture fish studies. The ...

Creating Robust Bisulfite-mRNA Libraries for Transcriptome-Wide Mapping

Enrichment of mRNA and Bisulfite-mRNA Library Preparation for Next-Generation Sequencing

Decoding RNA Methylation's Role in Pancreatic Cancer - A Single-Base Resolution Study (Video) | JoVE

העשרת ספריית mRNA וביסולפיט-mRNA הכנה לריצוף הדור הבא

RNA post-transcriptional modifications in various types of RNA transcripts are associated with diverse RNA regulation in eukaryotic cells. Aberrant RNA ...

Addressing Metabolomics Data Analysis Using Advanced Bioinformatics Tools

CorrelationCalculator and Filigree: Tools for Data-Driven Network Analysis of Metabolomics Data

Emerging Technologies and Advanced Tools for Decoding Metabolomics Data Analysis (Video) | JoVE

CorrelationCalculator and Filigree: כלים לניתוח רשת מונחה נתונים של נתוני מטבולומיקה

A significant challenge in the analysis of omics data is extracting actionable biological knowledge. Metabolomics is no exception. The general problem of ...