Name: 3' end sequencing library preparation with a-seq2
Uploaded: 2017-10-10T14:00:00
Duration: 12 min 1 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about 3' End Sequencing Library Preparation with A-seq2 at JoVE.com

Авторы благодарят миссис Béatrice Димитриадес за помощь с клеточной культуры. Эта работа была поддержана Швейцарский Национальный научный фонд грантов #31003A_170216 и 51NF40_141735 (НКРС РНК &#38; болезнь).

<ol>
	<li>Jan, C. H., Friedman, R. C., Ruby, J. G., Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation,+regulation+and+evolution+of+Caenorhabditis+elegans+3'UTRs.">Formation, regulation and evolution of Caenorhabditis elegans 3'UTRs.</a> Nature. 469 (7328), 97-101 (2011).</li><li>Spies, N., Burge, C. B., Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3'+UTR-isoform+choice+has+limited+influence+on+the+stability+and+translational+efficiency+of+most+mRNAs+in+mouse+fibroblasts.">3' UTR-isoform choice has limited influence on the stability and translational efficiency of most mRNAs in mouse fibroblasts.</a> Genome Res. 23 (12), 2078-2090 (2013).</li><li>Hoque, M., Ji, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+alternative+cleavage+and+polyadenylation+by+3'+region+extraction+and+deep+sequencing.">Analysis of alternative cleavage and polyadenylation by 3' region extraction and deep sequencing.</a> Nat. methods. 10 (2), 133-139 (2013).</li><li>Martin, G., Gruber, A. R., Keller, W., Zavolan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+of+pre-mRNA+3’+end+processing+reveals+a+decisive+role+of+human+cleavage+factor+I+in+the+regulation+of+3'+UTR+length.">Genome-wide analysis of pre-mRNA 3’ end processing reveals a decisive role of human cleavage factor I in the regulation of 3' UTR length.</a> Cell Rep. 1 (6), 753-763 (2012).</li><li>Gruber, A. R., Martin, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+3'+UTR+shortening+has+a+limited+effect+on+protein+abundance+in+proliferating+T+cells.">Global 3' UTR shortening has a limited effect on protein abundance in proliferating T cells.</a> Nat. Commun. 5, 5465 (2014).</li><li>Kivioja, T., V&#228;h&#228;rautio, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Counting+absolute+numbers+of+molecules+using+unique+molecular+identifiers.">Counting absolute numbers of molecules using unique molecular identifiers.</a> Nat. methods. 9 (1), 72-74 (2011).</li><li>Gruber, A. J., Schmidt, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+analysis+of+3'+end+sequencing+data+sets+reveals+novel+polyadenylation+signals+and+the+repressive+role+of+heterogeneous+ribonucleoprotein+C+on+cleavage+and+polyadenylation.">A comprehensive analysis of 3' end sequencing data sets reveals novel polyadenylation signals and the repressive role of heterogeneous ribonucleoprotein C on cleavage and polyadenylation.</a> Genome Res. 26 (8), 1145-1159 (2016).</li><li>Lingner, J., Keller, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3'-end+labeling+of+RNA+with+recombinant+yeast+poly(A)+polymerase.">3'-end labeling of RNA with recombinant yeast poly(A) polymerase.</a> Nucleic Acids Res. 21 (12), 2917-2920 (1993).</li><li>Quail, M. A., Kozarewa, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+large+genome+center's+improvements+to+the+Illumina+sequencing+system.">A large genome center's improvements to the Illumina sequencing system.</a> Nat. methods. 5 (12), 1005-1010 (2008).</li><li>Rahmann, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Snakemake--a+scalable+bioinformatics+workflow+engine.">Snakemake--a scalable bioinformatics workflow engine.</a> Bioinformatics. 28 (19), 2520-2522 (2012).</li><li>. Anaconda Software Distribution Available from: <a target="_blank" href="https://continuum.io">https://continuum.io</a> (2016)</li><li>Dobin, A., Davis, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STAR:+ultrafast+universal+RNA-seq+aligner.">STAR: ultrafast universal RNA-seq aligner.</a> Bioinformatics. 29 (1), 15-21 (2013).</li><li>Martin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutadapt+removes+adapter+sequences+from+high-throughput+sequencing+reads.">Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads.</a> EMBnet.journal. 17 (1), 10-12 (2011).</li><li>Li, H., Handsaker, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Sequence+Alignment/Map+format+and+SAMtools.">The Sequence Alignment/Map format and SAMtools.</a> Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).</li><li>Robinson, J. T., Thorvaldsd&#243;ttir, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrative+genomics+viewer.">Integrative genomics viewer.</a> Nat. Biotechnol. 29 (1), 24-26 (2011).</li><li>Quinlan, A. R., Hall, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BEDTools:+a+flexible+suite+of+utilities+for+comparing+genomic+features.">BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features.</a> Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).</li><li>Ozsolak, F., Platt, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+RNA+sequencing.">Direct RNA sequencing.</a> Nature. 461 (7265), 814-818 (2009).</li><li>Yao, C., Biesinger, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome-wide+analyses+of+CstF64-RNA+interactions+in+global+regulation+of+mRNA+alternative+polyadenylation.">Transcriptome-wide analyses of CstF64-RNA interactions in global regulation of mRNA alternative polyadenylation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109 (46), 18773-18778 (2012).</li><li>Lin, Y., Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in-depth+map+of+polyadenylation+sites+in+cancer.">An in-depth map of polyadenylation sites in cancer.</a> Nucleic Acids Res. 40 (17), 8460-8471 (2012).</li><li>Shepard, P. J., Choi, E. -. A., Lu, J., Flanagan, L. A., Hertel, K. J., Shi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+and+dynamic+landscape+of+RNA+polyadenylation+revealed+by+PAS-Seq.">Complex and dynamic landscape of RNA polyadenylation revealed by PAS-Seq.</a> RNA. 17 (4), 761-772 (2011).</li><li>Fu, Y., Sun, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+genome-wide+profiling+of+tandem+3'+UTRs+among+human+breast+cancer+and+normal+cells+by+high-throughput+sequencing.">Differential genome-wide profiling of tandem 3' UTRs among human breast cancer and normal cells by high-throughput sequencing.</a> Genome Res. 21 (5), 741-747 (2011).</li></ol>

Авторы не имеют ничего сообщать.

Множество основных и вспомогательных факторов, которые участвуют в пре мРНК 3' конца обработки отражается в пейзаже соответственно комплекс сплайсингу. Кроме того сплайсингу также реагировать на изменения в рамках других процессов, например транскрипции и сплайсинга. 3' конца расщепления сайтов в пре мРНК обычно определяются на основании характерных poly(A) хвосты, которые добавляются к продукты расщепления 5'. Большинство методов использования грунтовки oligo(dT) переменной длины, которые позволяют конкретные преобразования поли (А)-содержащих mRNAs cDNAs в реакции обратной транскрипции. Общей проблемой этого подхода является внутренним грунтовки для A-богатые последовательности привело артефакты расщепления сайтов. Были предложены два метода, которые стремятся обойти этот артефакт на стадии подготовки проб. В 3P-seq метод 1адаптеры специально лигируют концы poly(A) хвосты с помощью шины oligo последовали частичный RNase T1 пищеварение и обратной транскрипции с ТТП в реакции как только deoxynucleotide. Полученный heteroduplexes poly(A)-poly(dT) затем усваиваются с H РНКазы и изолированы, лигируют адаптерам и виртуализированных оставшиеся фрагменты РНК. Простой и элегантный способ, 2P-seq, который использует пользовательские последовательности грунт, пропуск, оставшихся oligo(dT) стрейч в последовательности реакции сообщили же авторы 2. В связанный метод, 3' ЧИТАЕТ 3, необычно длинные грунтовка 5 нас и 45 Ts, также содержащие биотин отжигом в разрозненных РНК, следуют строгим смывки для выбора для молекул РНК с хвостами poly(A) более 50 нуклеотидов. Хотя 3' ЧИТАЕТ резко снижает частоту внутреннего грунтовки, он не полностью устраняет ее 3. Также были предложены протоколы для прямой последовательности РНК, но результирующая читает короткие и имеют высокий уровень ошибки и этот подход не был далее развитые 18,,19-20. Поля-Seq и коммерциализированной протоколы Квант Seq сочетают грунтовки на основе oligo(dT) с шагом случайных грунтовки для синтеза cDNA второй стренги 20. Использование шаблона переключателя обратной транскрипции реакции с обратной транскриптазы Молони мышиных вирус лейкемии (MMLV) приводит к генерации cDNAs с линкеры за один шаг и тем самым не адаптер димеры могут появляться в PAS-Seq и SAPAS методы 21 , 22.
A-seq2 метод здесь представлены выделяется в его использования горные нуклеотидов (dU) в пределах биотинилированным oligo(dT) грунт. Эта модификация сочетает в себе программу обогащения oligo(dT) гибридизированных, polyadenylated целей с удалением большей последовательности25 oligo (dT) от изолированных фрагментов до библиотеки готовятся и сохранение трех Ts, который указывают на наличие предварительного poly(A) хвоста. Напротив методы, которые используют H РНКазы удалить poly(A) из молекул РНК случайно оставить несколько как. Поскольку в A-seq2, секвенирование делается из 3' конца стренги анти чувство, расщепление сайты являются предсказал должен располагаться после NNNNTTT мотив в начале чтения необработанных последовательностях. Рандомизированные тетрамера служат не только для того, чтобы позволить базы, но и вызов в ликвидации артефактов амплификации PCR. Длиннее UMIs также могут быть размещены. Возможность внутренней грунтование остается в A-seq2 и адресован вычислительно, сначала путем отбрасывания 3' заканчивается с genomically кодировке, А богатые течению последовательности, а затем путем отбрасывания 3' конца кластеры, которые можно объяснить внутренними грунтовки на Сам сигнал A-богатых poly(A). Недавний анализ сайтов poly(A), однозначно выведено большое количество протоколов указывает сайты, которые являются уникальными для A-seq2 распределение ожидаемых нуклеотидов и расположение внутри генов, похож на другие 3' конца последовательность протоколов.
Важнейшим шагом в A-seq2 является выбор polyadenylated РНК и удаление рибосомной РНК и различных малых РНК. Проще всего это делается путем мРНК изоляции комплект с олиго (dT)25 магнитные бусы. В принципе общая РНК, изолированные с фенолом, содержащие решения также дает высокое качество РНК, которые могут далее подвергаться выбор мРНК изоляции комплект или oligo (dT) агарозы. Шаг, который может изменяться в A-seq2 это лечение с щелочной гидролиз, который может быть сокращен или продлен до получения РНК фрагменты разных размеров. Критической является также дополнение 3' dATP 3' концы фрагменты РНК, poly(A) полимеразы эффективным. В протоколе, описанные здесь это лечение применяется для всех РНК фрагменты, чтобы избежать concatemerization во время реакции перешнуровки. Наконец мы отмечаем, что, хотя РНК лигаза 1 обычно используется как РНК лигаза, он также ligates эффективно одного мель ДНК, как мы сделали здесь, чтобы перевязать адаптер к 5' концу cDNA молекул.
Таким образом A-seq2 является эффективным и легко осуществить протокол для идентификации пре мРНК 3' конца обработки сайтов. Будущие события могут включать дальнейшее сокращение сложности протокола и количество требуемых материалов. Связанный набор инструментов анализа вычислительных данных далее включить однородную обработку 3' конца последовательности читает, полученные с широким спектром протоколов.

Захват и последовательность мРНК 3' концы позволяет изучение обработки мРНК и количественная оценка экспрессии генов. Из-за их poly(A) хвосты эукариотические мРНК могут быть эффективно очищены от всего lysates клетки с шарик прикол oligo-deoxythymidine (oligo(dT)) молекулы, которые также могут воспламенить синтез cDNA. Однако этот подход имеет два недостатка. Во-первых тянется A являются внутренними для стенограммы можно также премьер синтеза cDNA, что приводит к ложным poly(A) сайтов. Во-вторых, однородной poly(A) тянется представляют конкретные проблемы для виртуализации, помимо не информативна для идентификации транскрипт. Были предложены различные подходы обойти эти ограничения, такие как обратная транскрипция через poly(A) хвосты, следуют H РНКазы пищеварения (3 P-seq 1), использование пользовательской последовательность праймера, заканчивающийся в 20 Ts (2 P-seq 2), предыскания из Фрагменты РНК с poly(A) хвосты свыше 50 нуклеотидов с последующим H РНКазы пищеварения (3' ЧИТАЕТ 3), а также использование праймера oligo-dT, содержащий 3' адаптер в шпильку ( 4A-seq) грунт45 У.Е.5Т.
Недавно разработанный метод A-seq2 5 стремится обойти последовательности через poly(A) и в то же время для сведения к минимуму долю димеры, которые генерируются самолигирование адаптеров, особенно происходит когда Молярная концентрация адаптеры перевешивает Вставка концентрации. Эта проблема может быть устранена, когда оба адаптеры лигируют и тот же тип полинуклеотид концы как A-seq2, где 3' адаптеры лигируют к 5' концу фрагменты РНК и адаптеры 5' 5' концы cDNAs после обратной транскрипции. Метод является более удобным, чем наши ранее предложенных A-seq - в котором последовательности был в 5'-к-3 «направление, потребовав точно контролируется РНК фрагментации-, сохраняя при этом высокую точность идентификации сайта poly(A). Около 80% последовательного читает в типичных образцов однозначно сопоставить генома и привести к идентификации более 20 000 poly(A) сайт кластеров, более 70% которых перекрывающихся с аннотированной 3' необычных.
Короче говоря A-seq2 протокол начинается с мРНК фрагментации и перевязка реверс дополнение 3' адаптеры на 5' концы фрагменты РНК. Поли (А)-содержащие РНК затем обратной транскрипции с 25 нуклеотидов (nt) длиной oligo(dT) грунт, который содержит нуклеотидов якорь в конце 3', dU в позиции 4 и биотина 5' в конце, позволяя привязки cDNA магнитные стрептавидина бисером. Большая часть грунтовки, включая биотин, удаляется из cDNA путем расщепления на dU пользователя фермент смесь, содержащие урацила ДНК glycosylase (UDG) и VIII эндонуклеазы glycosylase лиазы ДНК. Эта реакция оставляет нетронутыми концы для перевязки адаптер 5', и три слева Ts после расщепления по-прежнему отмечать местоположение poly(A) хвост. Потому что 5' и 3' адаптеры прикреплены перевязки для получателей 5' концы, генерируются нет димеров адаптер. Четырех нуклеотидов случайных РВК представил в начале чтения позволяет кластера резолюции по последнему слову последовательности документов и может также служить уникальный идентификатор молекулярные (UMI) для обнаружения и удаления артефактов амплификации PCR. Размер UMI можно увеличить, как это сделано в других исследованиях 6. Протокол создает чтений, которые являются вспять дополнение к мРНК 3' заканчивается, все начиная с рандомизированных Тетрамер следуют 3 ц. обработка чтений, которые имеют 3 диагностические Ts на их 5' конца начинается с коррекции артефактов амплификации PCR Использование UMIs, удаление 3' адаптер последовательностей и отменить дополнения. Читает, которые возможно, возникла из oligo(dT) грунтовки на внутренние узлы A-богатые люди также определены вычислительно и отбрасывается. Паразитные сайты, как правило, недостает одной из 18 хорошо изученных и сохраняется poly(A) сигналов, которые должны быть расположен ~ 21 нуклеотидов вверх по течению сайт очевидно расщепления 7.
Протокол требует около 8 h практическое время, не считая культуры клеток и ночи перешнуровок. Связанные прочитать анализ программного обеспечения позволяет идентификации сайта высокоточную poly(A). С сайта poly(A) кластеры созданы на основе 4 образцы, далее подчеркивается в этой рукописи (два биологических реплицирует Си HNRNPC-лечение клеток и управления siRNA) 84% совпадения с аннотированной гена и из них, 75% совпадения с 3' УТР и 86% либо с 3' УТР или терминала экзона. Коэффициент корреляции Пирсона выражения 3' концы в реплицировать образцах-0,92, и значения из более 0,9 обычно получаются с помощью метода. Таким образом A-seq2 — удобный метод, который дает очень воспроизводимые результаты.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >Materials</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Agarose, ultra pure</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16500-500</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >2100 Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2940CA</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cordycepin triphosphate (3&#8217; dATP)</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>C9137</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DNA low bind vials, 1.5 ml</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22431021</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>D8637</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dynabeads mRNA-DIRECT Kit</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM61012</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >GR-Green dye</td>
			<td>Excellgen</td>
			<td>EG-1071</td>
			<td >use 1:10,000 dillution</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HiSeq 2500 or NextSeq 500 next generation sequencers</td>
			<td>Illumina</td>
			<td >inquire with supplier</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >KAPA HiFi Hotstart DNA polymerase mix</td>
			<td>KAPA/Roche</td>
			<td>KK2602</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Nuclease free water</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9937</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Poly(A) polymerase, yeast</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>74225Z25KU</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Poly(A) polymerase, E.coli</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0276L</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Polynucleotide kinase</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>EK0032</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >QIAEX II Gel Extraction Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>20021</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >QIAquick PCR Purification Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28104</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >QIAquick Gel Extraction Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28704</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >RNA ligase 1, high concentration</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0437M</td>
			<td >includes PEG-8000</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >RNeasy MinElute RNA Cleanup kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74204</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >RNase H</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0279</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >RNasin Plus, ribonuclease inhibitor</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2618</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Superscript IV reverse transcriptase</td>
			<td>Thermo Fisher Scientiific</td>
			<td>18090050</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Turbo DNase</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM2238</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >USER enzyme mix</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M5505</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dyna-Mag-2 magnetic rack</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12321D</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Thermomixer C</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5382000015</td>
			<td >Heated mixer with heated lid</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MicroSpin columns</td>
			<td>GE-Healthcare</td>
			<td>27-5325-01</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td >Comments</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Buffers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Alkaline hydrolysis buffer, 1.5 x</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td >Mix 1 part 0.1 M Na2CO3 and 9 parts 0.1 M NaHCO3. Add EDTA to 1 mM. Adjust pH to 9.2. Store aliquots at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >5x poly(A) polymerase buffer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientiific</td>
			<td></td>
			<td >100 mM Tris-HCl, pH 7.0, 3 mM MnCl2, 0.1 mM EDTA, 1 mM DTT, 0.5 mg/ml acetylated BSA, 50% glycerol</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Biotin binding buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td >20 mM Tris&#173;Cl pH 7.5, 2 M NaCl, 0.1% NP&#173;40</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TEN buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td >10 mM Tris&#173;Cl, pH 7.5, 1 mM EDTA, 0.02% NP&#173;40</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td >Sequence</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Oligonucleotides according to Illumina TruSeq Small RNA Sample Prep Kits, for GA-IIx and Hiseq2000/2500 sequencers</td>
			<td>Microsynth</td>
			<td></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >revRA3 (RNA)</td>
			<td>Microsynth</td>
			<td></td>
			<td >5&#8217; amino&#173; CCUUGGCACCCGAGAAUUCCA&#173; 3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >revDA5</td>
			<td>Microsynth</td>
			<td></td>
			<td >5&#8217; amino&#173; GTTCAGAGTTCTACAGTCCGAC GATCNNNN-3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Bio-dU-dT25, RT primer</td>
			<td>Microsynth</td>
			<td></td>
			<td >5&#39; Biotin-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-dU-TTTVN 3&#39; (V = G, A or C)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PCR primer forward, RP1</td>
			<td>Microsynth</td>
			<td></td>
			<td >5&#39; AATGATACGGCGACCACCGAGA TCTACACGTTCAGAGTTCTACAGTC CGA 3&#39;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PCR primer reverse, RPI1, barcode in bold</td>
			<td>Microsynth</td>
			<td></td>
			<td >5&#39; CAAGCAGAAGACGGCATACGAGA TCGTGATGTGACTGGAGTTCCTTG GCACCCGAGAATTCCA 3&#39;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td >Comments</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Oligonucleotides according to Illumina TruSeq HT-Small RNA Sample Prep Kits, for HiSeq2000/2500 and NextSeq500 sequencers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HT-rev3A (DNA/RNA)</td>
			<td>Microsynth</td>
			<td></td>
			<td >5&#39;-amino-GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCT CTTCCrGrAUrC-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HT-rev5A</td>
			<td>Microsynth</td>
			<td></td>
			<td >5&#39; amino-ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCT TCCGATCTNNNN 3&#39;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Bio-dU-dT25, RT primer</td>
			<td>Microsynth</td>
			<td></td>
			<td >5&#39; Biotin-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-dU-TTTVN 3&#39;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PCR primers forward (D501-506)</td>
			<td>Microsynth or Illumina</td>
			<td></td>
			<td >5&#39;-AATGATACGGCGACCACCGAGAT CTACAC[i5]ACACTCTTTCCCTACAC GACGCTCTTCCGATCT -3&#39;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PCR primers reverse (D701-D712)</td>
			<td>Microsynth or Illumina</td>
			<td></td>
			<td >5&#39;-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG A[i7]GTGACTGGAGTTCAGACGTG TGCTCTTCCGATC-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Documentation for Illumina multiplexing:</td>
			<td>Illumina</td>
			<td></td>
			<td >https://support.illumina.com/content/dam/illumina-support/documents/documentation/chemistry_documentation/experiment-design/illumina-adapter-sequences_1000000002694-01.pdf</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

3' end sequencing library preparation with a-seq2

Исследования в течение последнего десятилетия показали, сложной и динамичной разнообразие пре мРНК расщепления и сплайсингу реакций. мРНК с длиной 3' untranslated регионами (необычных) генерируются в дифференцированных клеток, тогда как пролиферирующих клеток преференциально Экспресс стенограммы с короткой 3' необычных. Мы описываем A-seq протокол, теперь в его второй версии, которая была разработана карта сплайсингу сайты генома общесистемной и изучить правила пре мРНК 3' конца обработки. Также этот текущий протокол использует polyadenylate (poly(A)) хвосты, которые добавляются во время биогенеза наиболее mammalian mRNAs обогатить для полностью обработанный мРНК. ДНК адаптер с deoxyuracil на его четвертой позиции позволяет точное обработка мРНК 3' конца фрагментов для виртуализации. Не включая культуры клеток и ночи перешнуровок протокол требует около 8 h практическое время. Наряду с этим предоставляется пакет простое в использовании программное обеспечение для анализа данных производного последовательности. A-seq2 и связанные анализ программного обеспечения обеспечивают эффективное и надежное решение для сопоставления пре мРНК 3' заканчивается в широком диапазоне условий, от 106 или меньше клеток.

Поли (А)-содержащие РНК был изолирован от культивируемых клеток, раздробленной, щелочной гидролиз и cDNAs были сделаны по вспять транскрипции с oligo(dT) грунтовки. Результате cDNA была иммобилизованных на стрептавидина бусы, dU был расщепляется в реакции конкретных иссечение урацил, адаптеры были лигируют до 5' и 3' концы рассеченного фрагмент и вставки были упорядочены. Рисунок 1 изображает графического плана эксперимента.
Для клеток HeLa и HEK293 106 клеток были достаточными для выявления poly(A) сайты для подавляющего большинства белков кодирование генов в конце процедуры. Однако для других типов клеток или тканей, которое может быть необходимо протестировать насыщенность в количество выявленных poly(A) сайтов как количество ячеек, которые используются в эксперименте увеличивается. Представитель результаты экспериментального ПЦР шаг и фрагмента ДНК анализ образца перед последовательности показаны на рисунке 2.
Рисунок 3 показывает шаги предварительной обработки вычислений анализа, начиная от fastq файла, полученные от программы sequencer и заканчивая проверил качество, подстриженные адаптер чтений, которые готовы быть сопоставлены с геном. Рисунок 4 показывает шаги анализа, которые начинаются с сопоставлением читает соответствующий генома и конец с каталогом мРНК 3' конца обработки сайты, которые определены в конкретной выборки. Когда анализируются несколько образцов, дополнительные шаги осуществляются матч 3' конца обработки сайтов, которые были найдены в отдельных пробах и сообщать их обилие различных образцов. Эти шаги показаны на рисунке 5.
Таким образом после того как образцы были упорядочены, анализ результирующей последовательности, читать файлы (в формате fastq) через конвейер обработки имеющихся проста. После добавления информации о образцы в файл конфигурации, выполнение конвейера приведет двух основных типов выходных файлов: 1) кровать файлов с все 3' конца обработки объектов, определенных в отдельных пробах (например » «««sample1.3pSites.noIP.Bed.gz») и 2) кровати файл с всеми кластерами сайта poly(A) (clusters.merged.bed) во всех пробах исследования. Выход также включает в себя генома координаты для всех операций чтения из каждого индивидуального образца (например «sample1. STAR_out/ALIGNED.sortedByCoord.out.BAM»), позже может рассматриваться в браузере генома как IGV16. Визуальный осмотр чтения компаний обычно обеспечивает первое представление о распределении poly(A) сайтов в геноме и изменения, которые происходят после конкретных возмущений, которые были проведены в исследовании. Например на рисунке 6 показан ответ конкретных генов нокдаун HNRNPC белка.
Резюме этих распределений генома общесистемной также предоставляются (Таблица 1). Частности, выходные файлы в папке «счетчики/annotation_overlap» содержат фракций сайтов, которые совпадают с особенностями аннотированный (gtf файла в качестве входного; Аннотированная являются: 3' УТР, терминал экзона, экзона, Интрон, intergenic). Наконец для каждого образца, результаты обработки отдельных шагов также сохраняются (например «sample1.summary.tsv»). Это включает в себя количество: сырье читает в каждого образца, читает, которые имеют ожидаемой структурой ' конец 5, читает, которые остаются после рушится полный ПЦР дубликаты, высокое качество читает согласно критериям, определенным в шаге 9.2, читает что однозначно сопоставляются генома (после свертывания тех, которые в результате секвенирования ошибки, см. шаг 9.5), мульти сопоставления считывает (после свертывания тех, которые в результате секвенирования ошибки, см. шаг 9.5), сырье (не кластеризованный) 3' конца обработки сайтов в каждой пробы, сырые 3' конец обработки сайты без потенциальных внутренних грунтование кандидатов уникальный 3' конца обработки сайтов от всех образцов без внутреннего грунтование кандидатов и окончательный набор poly(A) сайте кластеры.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56129/56129fig1v2.jpg"> 
Рисунок 1: основные шаги A-seq2 протокола. На левой стороне фигуры указаны отдельные шаги. Вставить фрагменты РНК изображаются как зеленые линии, которые поворачивают красный для cDNA после обратная транскрипция; Адаптеры окрашены в светло-синий или оранжевый. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56129/56129fig1v2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56129/56129fig2.jpg"> 
Рисунок 2: пилот ПЦР и конечного продукта профиля. () аликвоты от реакции PCR были собраны в разных циклов и отделить на гелях агарозы 2%. Цифры слева указать размер в нуклеотиды соответствующих групп в ДНК лестнице. В этом эксперименте для больших масштабах реакции PCR были выбраны 12 циклов (*). (b) Пример образца после выбора размера на анализатор размер фрагмента, раскрывая средний размер около 280 нуклеотидов. Цифры слева [Фу] указывают интенсивность относительной сигнала. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56129/56129fig2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56129/56129fig3.jpg"> 
Рисунок 3: Структура предварительной обработки последовательности чтения. Fastq файлы с чтений, которые генерируются программного обеспечения инструмент связанные последовательности обрабатываются для выявления читает высокого качества, которые будут сопоставлены соответствующим генома. На рисунке показана спецификация ввода/вывода отдельных шагов в конвейере, со ссылками на отдельные этапы протокола, описанных в разделе «Обработка данных». <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56129/56129fig3large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56129/56129fig4.jpg"> 
Рисунок 4: изложение последовательности читать обработки, от шага картирования генома к поколению отдельных 3' конца обработки сайтов. На рисунке показана спецификация ввода/вывода отдельных шагов в конвейере, со ссылками на iндивидуальное шаги протокола, описанных в разделе «Обработка данных». Основной выходной файл, который доставляется пользователю помечается жирным шрифтом. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56129/56129fig4large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56129/56129fig5.jpg"> 
Рисунок 5: изложение шагов, которые предпринимаются для создания кластеров совместно регулируемых 3' конца последовательности сайтов. На рисунке показана спецификация ввода/вывода отдельных шагов в конвейере, со ссылками на отдельные этапы протокола, описанных в разделе «Обработка данных». Основной выходной файл помечается жирным шрифтом. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56129/56129fig5large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56129/56129fig6.jpg"> 
Рисунок 6: результаты примера профиля 3' конца обработки читает вдоль терминала экзона гена NUP214, показана в браузере генома IGV 16 . A-seq2 чтений были подготовлены две пробы ГЭС 293 клеток, лечение управления siRNA либо с интерферирующей HNRNPC. Читает, задокументированные poly(A) сайтов, которые были аннотированный анализа трубопровода были сохранены в формате BAM, который был использован в качестве входных данных для IGV генома браузер. 3' концы вершины чтения карта мРНК 3' концы, аннотированные в Ensembl. Профили показывают увеличение использования длиной 3' УТР изоформы после HNRNPC НОК Даун. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56129/56129fig6large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Си управления реплицировать 1</td>
			<td>Си управления реплицировать 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>ID: 29765</td>
			<td>ID: 32682</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>количество сырых чтений</td>
			<td>44210258</td>
			<td>68570640</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>количество допустимых читает после обрезки и фильтрация</td>
			<td>14024538</td>
			<td>21211793</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>количество однозначно сопоставления считывает</td>
			<td>6953674</td>
			<td>13946436</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>количество операций чтения, сопоставление нескольких локусов</td>
			<td>2040646</td>
			<td>2925839</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>количество индивидуальных 3' конца обработки сайты</td>
			<td>1107493</td>
			<td>1710353</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Таблица 1: пример вывода анализа трубопровода. Резюме чтения, которые были получены на отдельные этапы.

Watch this Scientific Journal Video about 3' End Sequencing Library Preparation with A-seq2 at JoVE.com

3' End Sequencing Library Preparation with A-seq2

Этот протокол описывает метод для сопоставления пре мРНК 3' конца обработки сайтов.

3' конца последовательности подготовки библиотека с A-seq2

Studies in the last decade have revealed a complex and dynamic variety of pre-mRNA cleavage and polyadenylation reactions. mRNAs with long 3&#39; ...

Research

JoVE Journal

Biology

Chromatin Interaction Analysis with Paired-End Tag Sequencing (ChIA-PET) for Mapping Chromatin Interactions and Understanding Transcription Regulation

Chromatin Interaction Analysis with Paired-End Tag Sequencing ChIA-PET for Mapping Chromatin Interactions and Understanding Transcription Regulation

Хроматина анализ взаимодействия с парными-End тегов секвенирования (Chia-ПЭТ) для карт хроматина Взаимодействие и понимание регуляции транскрипции

Genomes are organized into three-dimensional structures, adopting higher-order conformations inside the micron-sized nuclear spaces 7, 2, 12. Such ...

Analysis of RNA Processing Reactions Using Cell Free Systems: 3' End Cleavage of Pre-mRNA Substrates in vitro

Analysis of RNA Processing Reactions Using Cell Free Systems: 3' End Cleavage of Pre-mRNA Substrates in vitro

Анализ РНК обработки реакций с помощью мобильного Бесплатные системы: 3 &#39;Конец расщепление пре-мРНК подложках<em&gt; В пробирке</em

The 3&#8217; end of mammalian mRNAs is not formed by abrupt termination of transcription by RNA polymerase II (RNPII). Instead, RNPII synthesizes ...

Interactome-Seq: A Protocol for Domainome Library Construction, Validation and Selection by Phage Display and Next Generation Sequencing

Interactome-Seq: Протокол для строительства Domainome Библиотека, проверки и отбора Фаговые отображения и следующего поколения последовательности

Folding reporters are proteins with easily identifiable phenotypes, such as antibiotic resistance, whose folding and function is compromised when fused to ...

Assessment of Global DNA Double-Strand End Resection using BrdU-DNA Labeling coupled with Cell Cycle Discrimination Imaging

Оценка глобальной двухцепочечной конечной резекции ДНК с использованием маркировки BrdU-ДНК в сочетании с визуализацией дискриминации клеточного цикла

The study of the DNA damage response (DDR) is a complex and essential field, which has only become more important due to the use of DDR-targeting drugs ...

Application of Passive Head Motion to Generate Defined Accelerations at the Heads of Rodents

Применение пассивного движения головы для генерации определенных ускорений на головах грызунов

Exercise is widely recognized as effective for various diseases and physical disorders, including those related to brain dysfunction. However, molecular ...

An Improved Chemotaxis Assay for the Rapid Identification of Rhizobacterial Chemoattractants in Root Exudates

Улучшенный анализ хемотаксиса для быстрой идентификации ризобактериальных хемоаттрактантантов в корневых экссудатах

Chemotaxis identification is very important for the research and application of rhizosphere growth-promoting bacteria. We established a straightforward ...

Single-Cell Suspension Preparation from Nile Tilapia Intestine for Single-Cell Sequencing

Препарат одноклеточной суспензии из кишечника нильской тилапии для секвенирования одноклеточных клеток

Nile tilapia is one of the most commonly cultured freshwater fish species worldwide and is a widely used research model for aquaculture fish studies. The ...

Creating Robust Bisulfite-mRNA Libraries for Transcriptome-Wide Mapping

Enrichment of mRNA and Bisulfite-mRNA Library Preparation for Next-Generation Sequencing

Decoding RNA Methylation's Role in Pancreatic Cancer - A Single-Base Resolution Study (Video) | JoVE

Обогащение мРНК и бисульфит-мРНК Подготовка библиотек для секвенирования нового поколения

RNA post-transcriptional modifications in various types of RNA transcripts are associated with diverse RNA regulation in eukaryotic cells. Aberrant RNA ...

Addressing Metabolomics Data Analysis Using Advanced Bioinformatics Tools

CorrelationCalculator and Filigree: Tools for Data-Driven Network Analysis of Metabolomics Data

Emerging Technologies and Advanced Tools for Decoding Metabolomics Data Analysis (Video) | JoVE

CorrelationCalculator и филигрань: инструменты для сетевого анализа метаболомных данных на основе данных

A significant challenge in the analysis of omics data is extracting actionable biological knowledge. Metabolomics is no exception. The general problem of ...

Determining the End-Systolic and End-Diastolic Pressure-Volume Relationships in a Murine Heart Failure Model and Transesophageal Pacing

Определение конечно-систолического и конечно-диастолического соотношения давления и объема в мышиной модели сердечной недостаточности и чреспищеводной кардиостимуляции