Name: laboratory protocol for genetic gut content analyses of aquatic macroinvertebrates using group-specific rdna primers
Uploaded: 2017-10-05T12:55:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Laboratory Protocol for Genetic Gut Content Analyses of Aquatic Macroinvertebrates Using Group-specific rDNA Primers at JoVE.com

研究所からシルクはクラッセンは、生態系の解析と評価 (ガイアウッド)、このプロトコルで使用されるグループ特定のプライマー セットの確立で彼女の援助のため RWTH Aachen を感謝いたします。我々 はまたミズダニの実験でピーター ・ マーティンと協力のキール大学からローラ Schynawa をありがとうございます。スムーズに実行し、企業とのカタログ番号の登録の準備のラボの維持の技術研究室助手を感謝いたします。この作品は、ドイツ研究振興協会 (DFG; プロジェクト GE 2219/3-1) によって支えられました。

1 ですフィールドから動物を収集し、遺伝子の腸内容分析のサンプルを準備します。。
各サイトで <ol><li>収集動物消費者単一チューブへの興味の種の個体を整理し、直接液体窒素やドライアイス腸クリアランスと DNA の分解を防ぐためにそれらを凍結します 。
	注意: いくつかの動物はアルコールは、それらを殺す前に繰り返す傾向があるのでアルコールでサンプルを保存しないでくだ?...

<ol>
	<li>Carreon-Martinez, L., Heath, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revolution+in+food+web+analysis+and+trophic+ecology:+diet+analysis+by+DNA+and+stable+isotope+analysis.">Revolution in food web analysis and trophic ecology: diet analysis by DNA and stable isotope analysis.</a> Mol Ecol. 9 (1), 25-27 (2010).</li><li>Hardy, C. M., Krull, E. S., Hartley, D. M., Oliver, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carbon+source+accounting+for+fish+using+combined+DNA+and+stable+isotope+analyses+in+a+regulated+lowland+river+weir+pool.">Carbon source accounting for fish using combined DNA and stable isotope analyses in a regulated lowland river weir pool.</a> Mol Ecol. 19 (1), 197-212 (2010).</li><li>Baxter, C. V., Fausch, K. D., Saunders, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tangled+webs:+reciprocal+flows+of+invertebrate+prey+link+streams+and+riparian+zones.">Tangled webs: reciprocal flows of invertebrate prey link streams and riparian zones.</a> Freshwater Biol. 50 (2), 201-220 (2005).</li><li>Baxter, C. V., Fausch, K. D., Murakami, M., Chapman, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fish+invasion+restructures+stream+and+forest+food+webs+by+interrupting+reciprocal+prey+subsidies.">Fish invasion restructures stream and forest food webs by interrupting reciprocal prey subsidies.</a> Ecol. 85 (10), 2656-2663 (2004).</li><li>Traugott, M., Kamenova, S., Ruess, L., Seeber, J., Plantegenest, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Empirically+Characterising+Trophic+Networks:+What+Emerging+DNA-Based+Methods,+Stable+Isotope+and+Fatty+Acid+Analyses+Can+Offer.">Empirically Characterising Trophic Networks: What Emerging DNA-Based Methods, Stable Isotope and Fatty Acid Analyses Can Offer.</a> Adv. Ecol. Res. Vol 49: Ecological Networks in an Agricultural World. 49, 177-224 (2013).</li><li>Diaz Arredondo, M. A., Guzman del Proo, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feeding+habits+of+the+spiny+lobster+(Panulirus+interruptus+Randall,+1840)+in+Bahia+Tortugas,+Baja+California+Sur.">Feeding habits of the spiny lobster (Panulirus interruptus Randall, 1840) in Bahia Tortugas, Baja California Sur.</a> Cienc Mar. 21 (4), 439-462 (1995).</li><li>Letourneur, Y., Galzin, R., Harmelin-Vivien, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+variations+in+the+diet+of+the+damselfish+Stegastes+nigricans+(Lacep&#232;de)+on+a+R&#233;union+fringing+reef.">Temporal variations in the diet of the damselfish Stegastes nigricans (Lacep&#232;de) on a R&#233;union fringing reef.</a> J Exp Mar Biol Ecol. 217 (1), 1-18 (1997).</li><li>Akin, S., Winemiller, K. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seasonal+variation+in+food+web+composition+and+structure+in+a+temperate+tidal+estuary.">Seasonal variation in food web composition and structure in a temperate tidal estuary.</a> Estuar Coast. 29 (4), 552-567 (2006).</li><li>Redd, K. S., Jarman, S. N., Frusher, S. D., Johnson, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+molecular+approach+to+identify+prey+of+the+southern+rock+lobster.">A molecular approach to identify prey of the southern rock lobster.</a> Bull Entomol Res. 98 (3), 233-238 (2008).</li><li>Gergs, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dreissena+polymorpha+in+Lake+Constance:+An+example+of+a+keystone+engineer?.">Dreissena polymorpha in Lake Constance: An example of a keystone engineer?.</a> Universit&#228;t Konstanz. , (2009).</li><li>Sheppard, S. K., Harwood, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+molecular+ecology:+tracking+trophic+links+through+predator-prey+food-webs.">Advances in molecular ecology: tracking trophic links through predator-prey food-webs.</a> Funct Ecol. 19 (5), 751-762 (2005).</li><li>Jarman, S. N., Ward, R. D., Elliott, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligonucleotide+primers+for+PCR+amplification+of+coelomate+introns.">Oligonucleotide primers for PCR amplification of coelomate introns.</a> Mar Biotechnol (NY). 4 (4), 347-355 (2002).</li><li>Verma, S. K., Singh, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+universal+primers+establish+identity+of+an+enormous+number+of+animal+species+for+forensic+application.">Novel universal primers establish identity of an enormous number of animal species for forensic application.</a> Mol Ecol Notes. 3 (1), 28-31 (2003).</li><li>Deagle, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+scatology+as+a+tool+to+study+diet:+analysis+of+prey+DNA+in+scats+from+captive+Steller+sea+lions.">Molecular scatology as a tool to study diet: analysis of prey DNA in scats from captive Steller sea lions.</a> Mol Ecol. 14 (6), 1831-1842 (2005).</li><li>Jarman, S. N., Deagle, B. E., Gales, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Group-specific+polymerase+chain+reaction+for+DNA-based+analysis+of+species+diversity+and+identity+in+dietary+samples.">Group-specific polymerase chain reaction for DNA-based analysis of species diversity and identity in dietary samples.</a> Mol Ecol. 13 (5), 1313-1322 (2004).</li><li>Jarman, S. N., Redd, K. S., Gales, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Group-specific+primers+for+amplifying+DNA+sequences+that+identify+Amphipoda,+Cephalopoda,+Echinodermata,+Gastropoda,+Isopoda,+Ostracoda+and+Thoracica.">Group-specific primers for amplifying DNA sequences that identify Amphipoda, Cephalopoda, Echinodermata, Gastropoda, Isopoda, Ostracoda and Thoracica.</a> Mol Ecol Notes. 6 (1), 268-271 (2006).</li><li>Hayashi, K., Yandell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+sensitive+is+PCR-SSCP?.">How sensitive is PCR-SSCP?.</a> Hum Mutat. 2 (5), 338-346 (1993).</li><li>Glava&#269;, D., Dean, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+the+single-strand+conformation+polymorphism+(SSCP)+technique+for+detection+of+point+mutations.">Optimization of the single-strand conformation polymorphism (SSCP) technique for detection of point mutations.</a> Hum Mutat. 2 (5), 404-414 (1993).</li><li>M&#252;lhardt, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Der Experimentator Molekularbiologie / Genomics. , (2013).</li><li>Lee, S. V., Bahaman, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discriminatory+Power+of+Agarose+Gel+Electrophoresis+in+DNA+Fragments+Analysis.">Discriminatory Power of Agarose Gel Electrophoresis in DNA Fragments Analysis.</a> Gel Electrophoresis - Principles and Basics. , (2012).</li><li>Wang, X. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+electrophoresis+technique+to+separate+microsatellite+alleles.">A new electrophoresis technique to separate microsatellite alleles.</a> Afr J Biotechnol. 8 (11), 2432-2436 (2009).</li><li>Gemmer, I., Gergs, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+first+twelve+microsatellite+loci+for+the+amphipod+Gammarus+roeselii+(Crustacea:+Amphipoda).">Characterization of the first twelve microsatellite loci for the amphipod Gammarus roeselii (Crustacea: Amphipoda).</a> Conserv Genet Resour. 5 (4), 955-957 (2013).</li><li>Olafsson, K., Hjorleifsdottir, S., Pampoulie, C., Hreggvidsson, G. O., Gudjonsson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+set+of+multiplex+assays+(SalPrint15)+for+efficient+analysis+of+15+microsatellite+loci+of+contemporary+samples+of+the+Atlantic+salmon+(Salmo+salar).">Novel set of multiplex assays (SalPrint15) for efficient analysis of 15 microsatellite loci of contemporary samples of the Atlantic salmon (Salmo salar).</a> Mol Ecol Resour. 10 (3), 533-537 (2010).</li><li>Baric, S., Hollrigl, A., Fureder, L., Petutschnig, J., Dalla Via, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=First+analysis+of+genetic+variability+in+Carinthian+populations+of+the+white-clawed+crayfish+Austropotamobius+pallipes.">First analysis of genetic variability in Carinthian populations of the white-clawed crayfish Austropotamobius pallipes.</a> Bull. Fr. Peche Piscicult. (380-381), 977-990 (2006).</li><li>Koester, M., Gergs, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=No+evidence+for+intraguild+predation+of+Dikerogammarus+villosus+(Sowinsky,+1894)+at+an+invasion+front+in+the+Untere+Lorze,+Switzerland.">No evidence for intraguild predation of Dikerogammarus villosus (Sowinsky, 1894) at an invasion front in the Untere Lorze, Switzerland.</a> Aquat Invasions. 9 (4), 489-497 (2014).</li><li>Sonnenberg, R., Nolte, A. W., Tautz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+evaluation+of+LSU+rDNA+D1-D2+sequences+for+their+use+in+species+identification.">An evaluation of LSU rDNA D1-D2 sequences for their use in species identification.</a> Front Zool. 4 (6), 6 (2007).</li><li>Koester, M., Bayer, B., Gergs, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+Dikerogammarus+villosus+(Crustacea,+Gammaridae)+a+'killer+shrimp'+in+the+River+Rhine+system?.">Is Dikerogammarus villosus (Crustacea, Gammaridae) a 'killer shrimp' in the River Rhine system?.</a> Hydrobiologia. 768 (1), 299-313 (2016).</li><li>Koester, M., Cla&#223;en, S., Gergs, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+group-specific+PCR+primers+for+the+identification+of+freshwater+macroinvertebrates.">Establishment of group-specific PCR primers for the identification of freshwater macroinvertebrates.</a> Conserv Genet Resour. 5 (4), 1091-1093 (2013).</li><li>Martin, P., Koester, M., Schynawa, L., Gergs, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=First+detection+of+prey+DNA+in+Hygrobates+fluviatilis+(Hydrachnidia,+Acari):+a+new+approach+for+determining+predator-prey+relationships+in+water+mites.">First detection of prey DNA in Hygrobates fluviatilis (Hydrachnidia, Acari): a new approach for determining predator-prey relationships in water mites.</a> Exp Appl Acarol. 67 (3), 373-380 (2015).</li><li>Deagle, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+Seabird+Diet+through+Genetic+Analysis+of+Faeces:+A+Case+Study+on+Macaroni+Penguins+(Eudyptes+chrysolophus).">Studying Seabird Diet through Genetic Analysis of Faeces: A Case Study on Macaroni Penguins (Eudyptes chrysolophus).</a> PLoS One. 2 (9), e831 (2007).</li><li>Sint, D., Niederklapfer, B., Kaufmann, R., Traugott, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Group-Specific+Multiplex+PCR+Detection+Systems+for+the+Identification+of+Flying+Insect+Prey.">Group-Specific Multiplex PCR Detection Systems for the Identification of Flying Insect Prey.</a> PLoS One. 9 (12), e115501 (2014).</li><li>Zarzoso-Lacoste, D., Corse, E., Vidal, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+PCR+detection+of+prey+in+molecular+diet+studies:+importance+of+group-specific+primer+set+selection+and+extraction+protocol+performances.">Improving PCR detection of prey in molecular diet studies: importance of group-specific primer set selection and extraction protocol performances.</a> Mol Ecol Resour. 13 (1), 117-127 (2013).</li><li>Vestheim, H., Jarman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blocking+primers+to+enhance+PCR+amplification+of+rare+sequences+in+mixed+samples+-+a+case+study+on+prey+DNA+in+Antarctic+krill+stomachs.">Blocking primers to enhance PCR amplification of rare sequences in mixed samples - a case study on prey DNA in Antarctic krill stomachs.</a> Front Zool. 5 (1), 12 (2008).</li><li>Harper, G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+screening+of+invertebrate+predators+for+multiple+prey+DNA+targets.">Rapid screening of invertebrate predators for multiple prey DNA targets.</a> Mol Ecol. 14 (3), 819-827 (2005).</li></ol>

ここでは、簡単かつコスト効率の高い PCR に基づく同じ標本の他の非分子分析と組み合わせることができます rDNA 領域のグループ固有プライマーを介してフィールド サンプルから捕食者-被食者相互作用の決定法を提案する.ただし、プロトコルの中でいくつかの重要な手順があります。まず、使用されるプライマーの特異性を保証することは不可欠です。第二に、それは胃腸管の準備、その?...

栄養相互作用と食物網動態の大半を占める捕食者-被食者の相互作用、物質と食物網内および生態学の主要な目標の 1 つである生態系間を通してエネルギーのフラックスを特徴付ける重要な側面1。 ソースの決意と炭素と栄養素の流れは生態系2間の生態的結合の理解を促進します。ただし、有機物および栄養素のフラックスも生物3の動きには、川などの流域の生態系はだけはリンクされません。したがって、これらのシステムをリンクしているリソースの流れを中断する生息地の変化強く変更できます両方生態系の食物網だけでなく直接、また、間接的捕食者-被食者コミュニティのそれぞれの構成を変更することによって。たとえば、単一の捕食者の種 (例えばニジマス)4の動きにリンクする食物網の変化が示されています。このような変更は潜在的生物多様性と水界生態系の機能を脅かします。したがって、フィールドにおける捕食者-被食者の相互作用の分析水生生態系のネイティブの生物多様性、水管理など、人為的な環境変化の影響を判断することが不可欠です。
栄養連携を追跡は複雑なシステムで難しいので、フィールド5の相互作用の評価を有効にするいくつかのアプローチを確立されています。従来、供給分野における相互作用の調査は切り裂かれた根性のままに獲物の視覚的な識別に基づいています、獲物の形態学的多様性に関する広範な知識を必要とします。視覚的腸内容分析は消費者 (例えばの季節変動ダイエット ロブスター6魚7,8または餌の好みのカイアシ類) のいくつかのグループのリソースの使用に洞察力を提供しています。ただし、消化の物理的なプロセスは visual 腸内容分析を困難、通常柔らかい bodied 獲物生物9をミスします。種の液体摂取によって餌または集中的に摂取、ヨコエビ類のような前に餌を comminute いくつかの無脊椎動物の消費者のため消化管内容物の餌種の視覚的な識別は不可能10です。これらの制限のための分子解析は、有望な代替手段を提供します。
分子解析は、消化管内容物の迅速かつ的確な獲物の検出を許可する一般的なツールとなっています。このような技術の範囲は多様な: モノクローナル抗体またはポリメラーゼの連鎖反応 (PCR) に基づく戦略頻繁にされる、彼らの高い特異性と感度11のため。新しいモノクローナル抗体の開発は時間とコストがかかる、抗体が11を既に存在しない場合したがって、他の分子技術の応用はより便利です。デオキシリボ核酸 (DNA) のように普遍的なプライマーを使用して、ほとんどの種で現在の ribosomal リボ核酸 (RNA) 遺伝子の領域の増幅は12,13を設定する一般的な方法です。この手法を使用して、頻繁にしない DNA14の混在のソース内の餌生物の全範囲を特定することが可能です。このような欠点を避けるために効果的な方法は、グループ特定のプライマーを使用する遺伝的腸内容分析の設定です。特定のターゲット グループの DNA 領域だけを増幅し、すべて他種15,16を除外するように設計、グループ特定のプライマーはせず指定したグループの分類学的レベルの餌生物の同定を有効にします。時間とコストのかかる二次分析。ただし、すべての腸の内容分析のようなそのような分析は摂食行動のスナップショットのみを提供します。したがって、自然なトレーサーの時間統合 (例えば、安定同位体) の解析と分子腸内容分析を組み合わせると、有益な1,2と見なされます。
ここでは、PCR に基づく調査核リボソーム DNA (rDNA) 領域のグループ特定のプライマー セットを使用した同じ試料の安定同位体比分析と組み合わせること捕食者-被食者の相互作用の詳細な方法について述べる。Agarose のゲルの電気泳動で単一獲物グループの DNA の検出について述べる。また、プライマーの特異性より高い分類の解像度が必要なときに該当するようなグループ固有プライマーの PCR 産物のさらに下流解析のための機会を紹介します。単一鎖 DNA (ssDNA) フラグメント フォーム第三構造の一次配列17によって決定される、ためこのようなグループに固有のプライマーによって増幅断片の小さな変化は構造変化に します。このような変更は、ポリアクリルアミドゲル17,18, (種レベル) の摂餌生態のより正確な識別を有効にすると一本鎖コンフォメーション sscp 解析によって検出できます。
Agarose のゲルの電気泳動は DNA のフラグメントを視覚化し、おおよその長さ19、解像度を決定する一般的で安価なツールは DNA の量に依存し、染色染料使用20。通常、可視化はまっすぐ進む純粋な DNA のサンプルを使用する場合、獲物の少ない潜在的消費者の消化管内容物の DNA、agarose のゲルの電気泳動の結果の得点が複雑に。まだ、この検出方法は画面の 1 つのフィールドから消費者の標本数が少ないことは不可能またはいくつか獲物のグループが、得点の合併症なりますサンプル数が高いスクリーニング複数獲物イチイは非常に時間の集中的なとこの実行不可能。高感度の検出法は、さらにフラグメント21の正確な長さの定量を可能にするキャピラリー電気泳動によるフラグメントの自動分析です。ラベルとして異なった蛍光染料を使用して、検出および自動フラグメント解析22,23で対等な長さのさまざまな断片を判断をすることが可能があることいくつかのマイクロ サテライトによる研究を示した 24。したがって、また提案する複数の獲物から DNA の並列検出のための詳しいプロトコル ラベル グループ特定のプライマー セットと自動シーケンサーによる自動フラグメント解析による検出 PCR を使用してグループ。さらに、自動化されたフラグメント解析による獲物の DNA の検出がまた摂取した獲物の相対的な定量化を可能にするアプローチであることを示す事例から結果を報告する.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>liquid nitrogen</td>
			<td>Any</td>
			<td>NA</td>
			<td>For transport of field samples of macroinvertebrates to the laboratory.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 ml reaction tubes - Safelock</td>
			<td>Any</td>
			<td>NA</td>
			<td>For collection of consumer specimens in the field and subsequent conservation in liquid nitrogen reaction tubes do not necessarily need to be PCR clean. To avoid exploding of the tubes, the lid of the tubes should be punctured with a needle.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Any</td>
			<td>NA</td>
			<td>Make sure magnification is suitable to prepare the gastro-intestinaltract of the size of consumer of interest.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Any</td>
			<td>NA</td>
			<td>To dissect the gastro-intestinal tract of consumer specimens under the stereomikroscope.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel foceps: Dumont forceps No. 7</td>
			<td>Bioform</td>
			<td>B40d</td>
			<td>This curved stainless steel forceps can sometimes be very helful to hold specimen fixed inbetween the curved part without puncturing the gastro-intestinal tract.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel foceps: Dumont forceps Electronic No. 5</td>
			<td>Bioform</td>
			<td>B40b</td>
			<td>This fine stainless steel forceps is ideally suited for the preparation of the gastro-intestinal tract of consumer specimens.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA-ExitusPlus</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A7409,1000RF</td>
			<td>Decontamination solution for the removal of DNA and RNA contaminations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fuzz-free paper towel</td>
			<td>Any</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab scale</td>
			<td>Any</td>
			<td>NA</td>
			<td>Precision needs to be at least 0.01 g.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microlitre pipettes (0.5-10/10-100/50-200/100-1000 &#956;L)</td>
			<td>Any</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safe-Lock Tubes 2.0 ml</td>
			<td>VWR</td>
			<td>211-2165</td>
			<td>It is crucial that these raction tubes are free of DNA, DNase, RNase and PCR inhibitors (PCR clean)!</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safe-Lock Tubes 1.5 ml</td>
			<td>VWR</td>
			<td>211-2164</td>
			<td>It is crucial that these raction tubes are free of DNA, DNase, RNase and PCR inhibitors (PCR clean)!</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride &#8805;99.5%, p.a., ACS, ISO</td>
			<td>carlroth</td>
			<td>3957.3</td>
			<td>For salt extraction buffer (SEB) and 5M NaCl-solution required for extraction of DNA.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(hydroxymethyl)-aminomethane Tris</td>
			<td>carlroth</td>
			<td>4855.2</td>
			<td>For salt extraction buffer (SEB) and TBE buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microlitre pipettes (0.5-10/10-100/50-200/100-1000 &#956;L)</td>
			<td>carlroth</td>
			<td>8043.1</td>
			<td>For salt extraction buffer (SEB) and TBE buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric acid &#8805;99.8 %, p.a., ACS, ISO</td>
			<td>carlroth</td>
			<td>6943.2</td>
			<td>For TBE buffer. Not needed if commercialy available TBE buffer is obtained.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>carlroth</td>
			<td>4360.1</td>
			<td>For extraction of DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K lyophil.</td>
			<td>carlroth</td>
			<td>7528.1</td>
			<td>Prepare a working solution containing 10 mg/ml.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TissueLyser II</td>
			<td>Quiagen</td>
			<td>85300</td>
			<td>Bead mill for homogenization of the samples.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless Steel Beads, 5 mm</td>
			<td>Quiagen</td>
			<td>69989</td>
			<td>For homogenization of samples.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating Thermoshaker</td>
			<td>Any</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex Mixer</td>
			<td>Any</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated centrifuge: himac CT 15 RE</td>
			<td>Hitachi</td>
			<td>NA</td>
			<td>Refrigerated centrifuge used for centrifugation during the extraction of DNA (Protocol 1).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>carlroth</td>
			<td>6752.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 99.8 %, p.a.</td>
			<td>Any</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Molecular biology grade (ddH2O)</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A7398,1000</td>
			<td>nuclease-free (stream sterilized and DEPC treated) water used for re-suspension of DNA and whenever refered to ddH2O within the manuscript</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unmodified Olegonucleotides</td>
			<td>Eurofins MWG Operon</td>
			<td>NA</td>
			<td>Primers unlabeled</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Modified olegonucleotides</td>
			<td>Metabion International AG</td>
			<td>NA</td>
			<td>Primers labelled</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>peqGOLD Taq all inclusive</td>
			<td>VWR Peqlab</td>
			<td>01-1000</td>
			<td>Taq all inclusive for PCR reaction mixtures (reaction buffer Y and S, dNTPs and MgCl2)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primus 96 advanced gradient thermocycler or peqStar96x Universal Gradient</td>
			<td>Peqlab</td>
			<td>NA</td>
			<td>Primer sets were originally established on a Primus 96 advanced gradient thermocycler. As this cycler was quite old, we than checked if our primer sets are efficient and specific under the same conditions using the peqSta96x (which also could simulate the older model). However, tests showed that our primers work well and are still specific (see Koester et al. 2013) without using the simulation of the old machine.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard 96 Well PCR Plates</td>
			<td>VWR Peqlab</td>
			<td>732-2879</td>
			<td>Used for PCR reactions.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Profile Tube Stripes 0.15 ml with Flat Cap Stripes</td>
			<td>VWR Peqlab</td>
			<td>732-3223</td>
			<td>Cap stripes used to close the PCR plates.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Peqlab</td>
			<td>35-1020</td>
			<td>Used for gel electrophoresis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwave</td>
			<td>Any</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical flask</td>
			<td>Any</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Measuring cylinder</td>
			<td>Any</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horizontal electrophoresis unit and respective combs with teeth</td>
			<td>Any</td>
			<td>NA</td>
			<td>For agarose gel electrophoresis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis Power Supply PS3002</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium bromide solution 1 %</td>
			<td>carlroth</td>
			<td>2218.1</td>
			<td>Used to prepare staining bath for agarose gels.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formamide</td>
			<td>carlroth</td>
			<td>6749.1</td>
			<td>Needded for the denaturation buffer for SSCP analyses.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromphenol blue</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A3640.0010</td>
			<td>Needed for the loading dye for agarose gel electrophoresis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>carlroth</td>
			<td>4621.1</td>
			<td>Needed for the loading dye for agarose gel electrophoresis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 bp-DNA-Ladder extended</td>
			<td>carlroth</td>
			<td>T835.1</td>
			<td>As size standard for agarose gel electrophoresis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV-Documentation system</td>
			<td>Any</td>
			<td>NA</td>
			<td>To visualize gel electrophoresis results.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotiphorese NF-Acrylamide/Bis-solution 40 % (29:1)</td>
			<td>carlroth</td>
			<td>A121.1</td>
			<td>For the preparation of polyacrylamid gels.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium peroxydisulphate</td>
			<td>carlroth</td>
			<td>9592.2</td>
			<td>For the preparation of polyacrylamid gels.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>foldback clips (32 mm)</td>
			<td>Any</td>
			<td>NA</td>
			<td>For the preparation of polyacrylamid gels.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>square-shaped plastic box (21 &#215; 6.5 &#215; 5 cm)</td>
			<td>Any</td>
			<td>NA</td>
			<td>For the preparation of polyacrylamid gels.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td>
			<td>carlroth</td>
			<td>23.67.1</td>
			<td>For the preparation of polyacrylamid gels.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beaker</td>
			<td>Any</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RC 10 Digital chiller</td>
			<td>VWR</td>
			<td>462-0138</td>
			<td>For SSCP analyses using polyacrylamide gel electrophoresis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical electrophoresis unit P10DS (OWL Separation Systems)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>700-2361</td>
			<td>For SSCP analyses using polyacrylamide gel electrophoresis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Notched glass plate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>730-0261</td>
			<td>For SSCP analyses using polyacrylamide gel electrophoresis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blank glass plate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>730-0260</td>
			<td>For SSCP analyses using polyacrylamide gel electrophoresis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spacers</td>
			<td>VWR</td>
			<td>730-0262</td>
			<td>For SSCP analyses using polyacrylamide gel electrophoresis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Comb with 25 teeth</td>
			<td>VWR</td>
			<td>730-0294</td>
			<td>For SSCP analyses using polyacrylamide gel electrophoresis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking platform</td>
			<td>Any</td>
			<td>NA</td>
			<td>For constant shaking of the staining bath.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GelStar Nucleic Acid Stain (Lonza Rockland, Inc.)</td>
			<td>Biozym</td>
			<td>850535 (50535)</td>
			<td>For staining of polyacrylamide gels.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenomeLab DNA Size Standard Kit 400bp</td>
			<td>AB Sciex</td>
			<td>608098</td>
			<td>For automated fragment analyses. Size stanard for Batch B.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenomeLab DNA Size Standard Kit 600bp</td>
			<td>AB Sciex</td>
			<td>608095</td>
			<td>For automated fragment analyses. Size stanard for Batch A.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample Loading Solution (SLS)</td>
			<td>AB Sciex</td>
			<td>608082</td>
			<td>For automated fragment analyses.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sequenzing plate - 96 Well Polypropylene PCR Microplate</td>
			<td>Costar</td>
			<td>6551</td>
			<td>For automated fragment analyses.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate centrifuge, PerfectSpin P</td>
			<td>VWR Peqlab</td>
			<td>NA</td>
			<td>mini plate centrifuge used to spin down PCR products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer plate - 96 Well EIA/RIA Clear Flat Bottom Polystyrene Not Treated Microplate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>9017</td>
			<td>For automated fragment analyses.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenomeLab Seperation buffer</td>
			<td>AB Sciex</td>
			<td>608012</td>
			<td>For automated fragment analyses.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Separation Gel - LPAI</td>
			<td>AB Sciex</td>
			<td>608010</td>
			<td>For automated fragment analyses.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sequenzer - CEQ8000 Genetic Analysis System</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>NA</td>
			<td>For automated fragment analyses.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneMarker V1.95</td>
			<td>Softgenetics</td>
			<td>NA</td>
			<td>To analyze results of automated fragment analyses.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

laboratory protocol for genetic gut content analyses of aquatic macroinvertebrates using group-specific rdna primers

食物網の分析は、生態系の理解を深めるために不可欠です。たとえば、食物網の相互作用は、非在来種の侵入によって引き起こされる深刻な変更を受けることができます。ただし、フィールドの捕食者-被食者相互作用の正確な同定は多くの場合困難であります。これらの分析は、腸内容の視覚的評価や安定同位体比 (δ15N そして δ13C) の分析にしばしば基づいています。形態学上の多様性や捕食生物の正確な同定の障害につながる、個々 の餌生物から同位体署名このようなメソッドは、それぞれ、包括的な知識を必要です。浸軟、経口摂取と餌生物の消化によって特定の種の同定困難ため visual 腸内容分析は特に柔らかい bodied 餌生物を過小評価します。したがって、ポリメラーゼ連鎖反応 (PCR) による戦略、たとえばグループ特定のプライマー セットを使用、食物網の相互作用の調査のための強力なツールを提供します。ここでは、核リボソーム デオキシリボ核酸 (rDNA) のグループ特定のプライマー セットを使用してフィールドから消費者を昆虫の消化管内容物を調査するための詳しいプロトコルについて述べる。DNA がすることができます (小分類) の場合全体の標本から抽出またはフィールドの標本の消化管内容物から。存在と DNA のテンプレートの機能の効率テスト個人から直接確認する必要がある普遍的なプライマーを用いた DNA のそれぞれのサブユニットをターゲットに設定します。また、ポリアクリルアミドのゲルを使用して後続の一本鎖コンフォメーション sscp 解析と変更されていないグループ固有のプライマーと PCR によって種レベルまでさらに組み合わせて消費獲物を定めることができることを示します。さらに、ラベルとして異なった蛍光染料の使用できる並列スクリーニング自動化されたフラグメント解析による複数の腸コンテンツ サンプルから別の獲物グループの DNA のフラグメントを示す.

正常に、このプロトコルの異なる研究内食事分析で説明されている手順を使用しました。このセクションでは、プロトコルのさまざまなセクションの適用を記述する例を示す.
例として、著者28と SSCP 解析による PCR 産物のさらに下流解析の可能性によって確立されたグループ特定のプライマー セットの?...

Watch this Scientific Journal Video about Laboratory Protocol for Genetic Gut Content Analyses of Aquatic Macroinvertebrates Using Group-specific rDNA Primers at JoVE.com

Laboratory Protocol for Genetic Gut Content Analyses of Aquatic Macroinvertebrates Using Group-specific rDNA Primers

動物の最も一般的な腸内容の分析は、視覚的な。餌生物の形態の多様性についての強烈な知識を必要とする、彼ら柔らかい bodied 獲物を逃すし、獲物の強力な粉砕により、ヨコエビ類を含むいくつかの生物はほぼ不可能。昆虫の詳細な斬新な遺伝的アプローチ獲物ヨコエビの国会で身分証明書を提供します。

水生動物使用グループ固有の rDNA プライマーの遺伝的腸内容分析の研究プロトコル

Analyzing food webs is essential for a better understanding of ecosystems. For example, food web interactions can undergo severe changes caused by the ...

Research

JoVE Journal

Biology

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture)

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo New Culture

初期のニワトリ胚をex vivo（新文化）の文化のための方法

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

初期のニワトリ胚のin situハイブリダイゼーションダブルホールマウント

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

神経毒性の高いコンテンツ分析のための神経とアストロサイト共培養アッセイ

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

Genetic Studies of Human DNA Repair Proteins Using Yeast as a Model System 

人間のDNA修復タンパク質の遺伝的研究は、モデルシステムとして酵母を使用

Understanding the roles of human DNA repair proteins in genetic pathways is a formidable challenge to many researchers.  Genetic studies in mammalian ...

DNA Extraction from Paraffin Embedded Material for Genetic and Epigenetic Analyses

遺伝学的およびエピジェネティクス解析のためのパラフィン包埋材料からのDNA抽出

Disease development and progression are characterized by frequent genetic and epigenetic aberrations including chromosomal rearrangements, copy number ...

Evisceration of Mouse Vitreous and Retina for Proteomic Analyses

プロテオーム解析のためのマウスの硝子体と網膜の内臓摘出

While the mouse retina has emerged as an important genetic model for inherited retinal disease, the mouse vitreous remains to be explored. The vitreous is ...

Generation of Human Cardiomyocytes: A Differentiation Protocol from Feeder-free Human Induced Pluripotent Stem Cells

ヒト心筋細胞の生成：フィーダーフリーヒト人工多能性幹細胞からの分化プロトコル

In order to investigate the events driving heart development and to determine the molecular mechanisms leading to myocardial diseases in humans, it is ...

DNA Electroporation, Isolation and Imaging of Myofibers

DNAエレクトロポレーション、筋線維の単離およびイメージング

Mature muscle has a unique structure that is amenable to live cell imaging. Herein, we describe the experimental protocol for expressing fluorescently ...

Cellular Redox Profiling Using High-content Microscopy

ハイコンテンツ顕微鏡を用いた細胞レドックスプロファイリング

Reactive oxygen species (ROS) regulate essential cellular processes including gene expression, migration, differentiation and proliferation. However, ...