Name: laboratory protocol for genetic gut content analyses of aquatic macroinvertebrates using group-specific rdna primers
Uploaded: 2017-10-05T12:55:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Laboratory Protocol for Genetic Gut Content Analyses of Aquatic Macroinvertebrates Using Group-specific rDNA Primers at JoVE.com

우리 감사는 연구소에서 Silke Classen 생태계 분석 및 평가 (gaiac), RWTH 아 헨이이 프로토콜에 사용 되는 그룹-특정 뇌관 세트의 설립에 있는 그녀의 원조에 대 한. 우리는 또한 감사 피터 마틴과 협력에 대 한 Kiel의 대학에서로 라 Schynawa 물 진드기 실험에. 우리는 또한 원활 하 게 실행 하 고 회사와 카탈로그 번호의 등록을 준비 하 고 실험실 유지에 대 한 기술 실험실 조 수를 감사 합니다. 이 작품은 독일 연구 재단 (DFG; 프로젝트 GE 2219/3-1)에 의해 지원 되었다.

1. 필드에서 Macroinvertebrates를 수집 하 고 유전자 직감 콘텐츠 분석에 대 한 샘플 준비.
각 사이트에서 <ol><li>수집 macroinvertebrates 개인 소비자 종의 단일 튜브에 대 한 관심의 밖으로 정렬 하 고 직접 액체 질소 나 드라이 아이스 용기 클리어런스 및 DNA의 저하를 방지 하기 위해 그들을 동결. 
	참고: 알콜, 샘플 저장 일부 macroinvertebrates 알콜 그들을 죽이기 전에 역류 하는 경향이 있기 때문에 피하...

<ol>
	<li>Carreon-Martinez, L., Heath, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revolution+in+food+web+analysis+and+trophic+ecology:+diet+analysis+by+DNA+and+stable+isotope+analysis.">Revolution in food web analysis and trophic ecology: diet analysis by DNA and stable isotope analysis.</a> Mol Ecol. 9 (1), 25-27 (2010).</li><li>Hardy, C. M., Krull, E. S., Hartley, D. M., Oliver, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carbon+source+accounting+for+fish+using+combined+DNA+and+stable+isotope+analyses+in+a+regulated+lowland+river+weir+pool.">Carbon source accounting for fish using combined DNA and stable isotope analyses in a regulated lowland river weir pool.</a> Mol Ecol. 19 (1), 197-212 (2010).</li><li>Baxter, C. V., Fausch, K. D., Saunders, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tangled+webs:+reciprocal+flows+of+invertebrate+prey+link+streams+and+riparian+zones.">Tangled webs: reciprocal flows of invertebrate prey link streams and riparian zones.</a> Freshwater Biol. 50 (2), 201-220 (2005).</li><li>Baxter, C. V., Fausch, K. D., Murakami, M., Chapman, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fish+invasion+restructures+stream+and+forest+food+webs+by+interrupting+reciprocal+prey+subsidies.">Fish invasion restructures stream and forest food webs by interrupting reciprocal prey subsidies.</a> Ecol. 85 (10), 2656-2663 (2004).</li><li>Traugott, M., Kamenova, S., Ruess, L., Seeber, J., Plantegenest, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Empirically+Characterising+Trophic+Networks:+What+Emerging+DNA-Based+Methods,+Stable+Isotope+and+Fatty+Acid+Analyses+Can+Offer.">Empirically Characterising Trophic Networks: What Emerging DNA-Based Methods, Stable Isotope and Fatty Acid Analyses Can Offer.</a> Adv. Ecol. Res. Vol 49: Ecological Networks in an Agricultural World. 49, 177-224 (2013).</li><li>Diaz Arredondo, M. A., Guzman del Proo, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feeding+habits+of+the+spiny+lobster+(Panulirus+interruptus+Randall,+1840)+in+Bahia+Tortugas,+Baja+California+Sur.">Feeding habits of the spiny lobster (Panulirus interruptus Randall, 1840) in Bahia Tortugas, Baja California Sur.</a> Cienc Mar. 21 (4), 439-462 (1995).</li><li>Letourneur, Y., Galzin, R., Harmelin-Vivien, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+variations+in+the+diet+of+the+damselfish+Stegastes+nigricans+(Lacep&#232;de)+on+a+R&#233;union+fringing+reef.">Temporal variations in the diet of the damselfish Stegastes nigricans (Lacep&#232;de) on a R&#233;union fringing reef.</a> J Exp Mar Biol Ecol. 217 (1), 1-18 (1997).</li><li>Akin, S., Winemiller, K. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seasonal+variation+in+food+web+composition+and+structure+in+a+temperate+tidal+estuary.">Seasonal variation in food web composition and structure in a temperate tidal estuary.</a> Estuar Coast. 29 (4), 552-567 (2006).</li><li>Redd, K. S., Jarman, S. N., Frusher, S. D., Johnson, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+molecular+approach+to+identify+prey+of+the+southern+rock+lobster.">A molecular approach to identify prey of the southern rock lobster.</a> Bull Entomol Res. 98 (3), 233-238 (2008).</li><li>Gergs, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dreissena+polymorpha+in+Lake+Constance:+An+example+of+a+keystone+engineer?.">Dreissena polymorpha in Lake Constance: An example of a keystone engineer?.</a> Universit&#228;t Konstanz. , (2009).</li><li>Sheppard, S. K., Harwood, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+molecular+ecology:+tracking+trophic+links+through+predator-prey+food-webs.">Advances in molecular ecology: tracking trophic links through predator-prey food-webs.</a> Funct Ecol. 19 (5), 751-762 (2005).</li><li>Jarman, S. N., Ward, R. D., Elliott, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligonucleotide+primers+for+PCR+amplification+of+coelomate+introns.">Oligonucleotide primers for PCR amplification of coelomate introns.</a> Mar Biotechnol (NY). 4 (4), 347-355 (2002).</li><li>Verma, S. K., Singh, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+universal+primers+establish+identity+of+an+enormous+number+of+animal+species+for+forensic+application.">Novel universal primers establish identity of an enormous number of animal species for forensic application.</a> Mol Ecol Notes. 3 (1), 28-31 (2003).</li><li>Deagle, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+scatology+as+a+tool+to+study+diet:+analysis+of+prey+DNA+in+scats+from+captive+Steller+sea+lions.">Molecular scatology as a tool to study diet: analysis of prey DNA in scats from captive Steller sea lions.</a> Mol Ecol. 14 (6), 1831-1842 (2005).</li><li>Jarman, S. N., Deagle, B. E., Gales, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Group-specific+polymerase+chain+reaction+for+DNA-based+analysis+of+species+diversity+and+identity+in+dietary+samples.">Group-specific polymerase chain reaction for DNA-based analysis of species diversity and identity in dietary samples.</a> Mol Ecol. 13 (5), 1313-1322 (2004).</li><li>Jarman, S. N., Redd, K. S., Gales, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Group-specific+primers+for+amplifying+DNA+sequences+that+identify+Amphipoda,+Cephalopoda,+Echinodermata,+Gastropoda,+Isopoda,+Ostracoda+and+Thoracica.">Group-specific primers for amplifying DNA sequences that identify Amphipoda, Cephalopoda, Echinodermata, Gastropoda, Isopoda, Ostracoda and Thoracica.</a> Mol Ecol Notes. 6 (1), 268-271 (2006).</li><li>Hayashi, K., Yandell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+sensitive+is+PCR-SSCP?.">How sensitive is PCR-SSCP?.</a> Hum Mutat. 2 (5), 338-346 (1993).</li><li>Glava&#269;, D., Dean, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+the+single-strand+conformation+polymorphism+(SSCP)+technique+for+detection+of+point+mutations.">Optimization of the single-strand conformation polymorphism (SSCP) technique for detection of point mutations.</a> Hum Mutat. 2 (5), 404-414 (1993).</li><li>M&#252;lhardt, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Der Experimentator Molekularbiologie / Genomics. , (2013).</li><li>Lee, S. V., Bahaman, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discriminatory+Power+of+Agarose+Gel+Electrophoresis+in+DNA+Fragments+Analysis.">Discriminatory Power of Agarose Gel Electrophoresis in DNA Fragments Analysis.</a> Gel Electrophoresis - Principles and Basics. , (2012).</li><li>Wang, X. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+electrophoresis+technique+to+separate+microsatellite+alleles.">A new electrophoresis technique to separate microsatellite alleles.</a> Afr J Biotechnol. 8 (11), 2432-2436 (2009).</li><li>Gemmer, I., Gergs, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+first+twelve+microsatellite+loci+for+the+amphipod+Gammarus+roeselii+(Crustacea:+Amphipoda).">Characterization of the first twelve microsatellite loci for the amphipod Gammarus roeselii (Crustacea: Amphipoda).</a> Conserv Genet Resour. 5 (4), 955-957 (2013).</li><li>Olafsson, K., Hjorleifsdottir, S., Pampoulie, C., Hreggvidsson, G. O., Gudjonsson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+set+of+multiplex+assays+(SalPrint15)+for+efficient+analysis+of+15+microsatellite+loci+of+contemporary+samples+of+the+Atlantic+salmon+(Salmo+salar).">Novel set of multiplex assays (SalPrint15) for efficient analysis of 15 microsatellite loci of contemporary samples of the Atlantic salmon (Salmo salar).</a> Mol Ecol Resour. 10 (3), 533-537 (2010).</li><li>Baric, S., Hollrigl, A., Fureder, L., Petutschnig, J., Dalla Via, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=First+analysis+of+genetic+variability+in+Carinthian+populations+of+the+white-clawed+crayfish+Austropotamobius+pallipes.">First analysis of genetic variability in Carinthian populations of the white-clawed crayfish Austropotamobius pallipes.</a> Bull. Fr. Peche Piscicult. (380-381), 977-990 (2006).</li><li>Koester, M., Gergs, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=No+evidence+for+intraguild+predation+of+Dikerogammarus+villosus+(Sowinsky,+1894)+at+an+invasion+front+in+the+Untere+Lorze,+Switzerland.">No evidence for intraguild predation of Dikerogammarus villosus (Sowinsky, 1894) at an invasion front in the Untere Lorze, Switzerland.</a> Aquat Invasions. 9 (4), 489-497 (2014).</li><li>Sonnenberg, R., Nolte, A. W., Tautz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+evaluation+of+LSU+rDNA+D1-D2+sequences+for+their+use+in+species+identification.">An evaluation of LSU rDNA D1-D2 sequences for their use in species identification.</a> Front Zool. 4 (6), 6 (2007).</li><li>Koester, M., Bayer, B., Gergs, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+Dikerogammarus+villosus+(Crustacea,+Gammaridae)+a+'killer+shrimp'+in+the+River+Rhine+system?.">Is Dikerogammarus villosus (Crustacea, Gammaridae) a 'killer shrimp' in the River Rhine system?.</a> Hydrobiologia. 768 (1), 299-313 (2016).</li><li>Koester, M., Cla&#223;en, S., Gergs, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+group-specific+PCR+primers+for+the+identification+of+freshwater+macroinvertebrates.">Establishment of group-specific PCR primers for the identification of freshwater macroinvertebrates.</a> Conserv Genet Resour. 5 (4), 1091-1093 (2013).</li><li>Martin, P., Koester, M., Schynawa, L., Gergs, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=First+detection+of+prey+DNA+in+Hygrobates+fluviatilis+(Hydrachnidia,+Acari):+a+new+approach+for+determining+predator-prey+relationships+in+water+mites.">First detection of prey DNA in Hygrobates fluviatilis (Hydrachnidia, Acari): a new approach for determining predator-prey relationships in water mites.</a> Exp Appl Acarol. 67 (3), 373-380 (2015).</li><li>Deagle, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+Seabird+Diet+through+Genetic+Analysis+of+Faeces:+A+Case+Study+on+Macaroni+Penguins+(Eudyptes+chrysolophus).">Studying Seabird Diet through Genetic Analysis of Faeces: A Case Study on Macaroni Penguins (Eudyptes chrysolophus).</a> PLoS One. 2 (9), e831 (2007).</li><li>Sint, D., Niederklapfer, B., Kaufmann, R., Traugott, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Group-Specific+Multiplex+PCR+Detection+Systems+for+the+Identification+of+Flying+Insect+Prey.">Group-Specific Multiplex PCR Detection Systems for the Identification of Flying Insect Prey.</a> PLoS One. 9 (12), e115501 (2014).</li><li>Zarzoso-Lacoste, D., Corse, E., Vidal, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+PCR+detection+of+prey+in+molecular+diet+studies:+importance+of+group-specific+primer+set+selection+and+extraction+protocol+performances.">Improving PCR detection of prey in molecular diet studies: importance of group-specific primer set selection and extraction protocol performances.</a> Mol Ecol Resour. 13 (1), 117-127 (2013).</li><li>Vestheim, H., Jarman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blocking+primers+to+enhance+PCR+amplification+of+rare+sequences+in+mixed+samples+-+a+case+study+on+prey+DNA+in+Antarctic+krill+stomachs.">Blocking primers to enhance PCR amplification of rare sequences in mixed samples - a case study on prey DNA in Antarctic krill stomachs.</a> Front Zool. 5 (1), 12 (2008).</li><li>Harper, G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+screening+of+invertebrate+predators+for+multiple+prey+DNA+targets.">Rapid screening of invertebrate predators for multiple prey DNA targets.</a> Mol Ecol. 14 (3), 819-827 (2005).</li></ol>

여기, 우리는 동일한 견본의 다른 비 분자 분석 결합 될 수 있는 rDNA 지역에 대 한 그룹-특정 뇌관 통해 필드 샘플에서 약탈자 먹이 상호 작용의 PCR 기반 결정에 대 한 간단 하 고 비용 효율적인 방법 제시. 그러나, 몇 가지 중요 한 단계는 프로토콜 내에서 있다. 첫째, 사용 하는 뇌관의 특이성을 확보 필수적 이다. 둘째,는 위장의 준비 및 후속 DNA 추출 하는 동안 오염 및 창 자 콘텐츠 자료의 손실을 ...

약탈자 먹이 상호 작용, 영양 상호 작용 및 음식 웹 역동성의 대부분을 구성 하는 물질과 식품 웹 시간과 생태계 생태학의 주요 목표 중 하나는 사이 걸쳐 에너지의 플럭스 특성 주요 측면은 1. 소스 결정과 탄소와 영양소의 흐름 생태계2사이의 생태 연결의 이해 발전 이다. 그러나, 생태계, 강과 그들의 catchments 같은 생물3의 움직임에 의해 뿐만 아니라 유기 물질과 영양소의 용만 연결 되지 않습니다. 따라서, 그 시스템을 연결 하는 자원의 흐름을 방해 하는 서식 지 변경 변경할 수 있습니다 강력 하 게 두 생태계의 음식 웹 직접 뿐만 아니라 또한 간접적으로 포식 자-먹이 커뮤니티의 각각 구성 변경 하 여. 예를 들어, 음식 웹의 변화 한 포식 종 (예를 들어, 무지개 송어)4의 움직임에 연결 될 표시 되었습니다. 이러한 변화는 잠재적으로 생물 다양성 및 수생 생태계의 기능을 위협 한다. 따라서 필드에 약탈자 먹이 상호 작용 분석 인간 유발 환경 변화, 등 물 관리 관행, 수생 생태계의 네이티브 생물 다양성에 미치는 영향을 결정 필수적 이다.
영양 관계를 추적 하는 것은 어려운 복잡 한 시스템에서 이후 몇 가지 방법은 설립 되었습니다를 사용 하는 필드5에 있는 상호 작용을 먹이의 평가. 전통적으로, 조사 분야에서 상호 작용을 먹이 기의 해 부 용기에 먹이 남아의 시각적 식별에 기반 하 고 형태 론 적 먹이 다양성에 대 한 광범위 한 지식이 필요로. 비주얼 직감 콘텐츠 분석 소비자 (예: 계절 변화 다이어트에 랍스터6 와 물고기7,8 또는 먹이 환경 설정의 copepods의)의 여러 그룹의 리소스 사용에 대 한 통찰력을 제공 했다. 그러나, 소화의 물리적 과정 시각 직감 콘텐츠 분석 어려운 만들고 일반적으로 소프트 바디 먹이 유기 체9를 그리 워 합니다. 액체 섭취에 의해 먹이 종에 대 한 또는 집중적으로 그들의 음식 섭취, amphipods, 같은 전에 comminute 몇몇 무척 추 동물 소비자에 대 한 본질적인 내용에 먹이 종의 시각적 식별 불가능 한10입니다. 이러한 제한으로 인해 분자 분석 유망한 대안을 제공합니다.
분자 분석 이제 본질적인 내용에 신속 하 고 정확한 먹이 탐지를 허용 하는 일반적인 도구 되고있다. 이러한 기술의 범위는 다양 한: 단일 클론 항 체 또는 중 합 효소 연쇄 반응 (PCR)에 근거를 둔 전략은, 때문에 자주 사용 그들의 높은 특이성 및 감도11. 새로운 단일 클론 항 체의 개발은 시간 및 비용 집중, 그러므로, 다른 분자 기술에의 응용 프로그램은 더 유용 항 체11를 이미 존재 하지 않는 경우. 또 다른 일반적인 접근은 보편적인 뇌관을 사용 하 여 대부분의 종에서 존재 ribosomal ribonucleic 산 (RNA) 유전자 처럼 deoxyribonucleic 산 (DNA)의 증폭 세트12,13이다. 이 기술을 사용 하 여, 그것 불가능 자주 DNA14의 혼합된 소스 내에서 먹이 생물의 전체 범위를 식별 합니다. 이러한 단점을 피하기 위해 효과적인 접근 그룹 특정 뇌관을 사용 하 여 유전 직감 콘텐츠 분석에 대 한 설정입니다. 특정 대상 그룹의 DNA 영역만을 증폭 하 고 모든 다른 종15,16제외 하도록 설계 된, 그룹 전용 프라이 머 사용 없이 지정된 된 그룹의 분류학 수준에 먹이 생물의 식별 시간 및 비용 집약적인 보조 분석입니다. 그러나, 모든 콘텐츠 분석 직감, 같은 같은 분석만 먹이 행동의 스냅샷을 제공 합니다. 따라서, 분석 시간 통합 자연 추적기 (예를 들어, 안정 동위 원소)의 분자 용기 콘텐츠 분석을 결합 하는 것은 유익한1,2간주 됩니다.
여기, 약탈자 먹이 상호 작용 동일한 견본의 안정 동위 원소 분석 결합 될 핵 ribosomal DNA (rDNA) 지역에 대 한 그룹-특정 뇌관 세트를 사용 하 여 PCR 기반 조사에 대 한 자세한 방법을 설명 합니다. Agarose 젤 전기 이동 법을 통해 단일 먹이 그룹의 DNA의 탐지를 설명합니다. 또한, 선물이 해당 같은 그룹-특정 뇌관의 PCR 제품의 추가 다운스트림 분석 기회 뇌관 특이성 보다 높은 분류학 해상도 필요할 때마다. 때문에 단일 좌초 DNA (ssDNA) 양식 3 차 conformations 그들의 기본 시퀀스17에 의해 결정 되는 조각, 조각 같은 그룹-특정 뇌관에 의해 증폭에 작은 변화 구조적 변화에 이어질. 이러한 변화는 단일 가닥 구조 다형성 (SSCP) 분석 polyacrylamide 젤17,18, 먹이 생물 (종 수준)의 더 정확한 id를 사용 하 여 검색할 수 있습니다.
Agarose 젤 전기 이동 법 DNA 파편을 시각화 하 고 그들의 대략적인 길이19, 해상도 결정 하는 일반적이 고 저렴 한 도구는 DNA의 금액에 따라 달라 집니다 및 착 색 염료 사용20동안에. 일반적으로, 시각화는 곧장 앞으로 순수한 DNA 샘플을 작업할 때 하지만 잠재적으로 낮은 양의 먹이 소비자의 본질적인 내용에 DNA agarose 젤 전기 이동 법 결과의 점수 복잡 수 있습니다. 아직도,이 검색 메서드는 가능한 한 낮은 필드에서 소비자 표본 수를 화면 또는 몇 먹이 그룹, 하지만 점수에 합병증 샘플의 높은 숫자의 심사 여러 먹이 taxa 매우 시간이 집중 따라서 불가능. 더 민감한 검출 방법의 조각 조각21의 정확한 길이 결정 있습니다 모 세관 전기 이동 법을 통해 자동화 된 분석 이다. 여러 microsatellite 기반 연구 레이블로 다른 형광 성 염료를 사용 하 여 그것이 감지 하 여 자동된 조각 분석22,23에 의해 다른 파편의 유사한 길이 결정 24. 따라서, 우리 또한 현재 여러 먹이에서 DNA의 병렬 검색에 대 한 자세한 프로토콜 레이블된 그룹-특정 뇌관 세트와 자동화 된 시퀀서와 자동된 조각 분석을 통해 감지 PCR를 사용 하 여 그룹. 또한, 우리는 자동된 조각 분석을 통해 먹이 DNA의 검출 방식은 또한 섭취 한 먹이의 상대 정량화를 가능 하 게 보여주는 사례 연구에서 결과 제시.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>liquid nitrogen</td>
			<td>Any</td>
			<td>NA</td>
			<td>For transport of field samples of macroinvertebrates to the laboratory.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 ml reaction tubes - Safelock</td>
			<td>Any</td>
			<td>NA</td>
			<td>For collection of consumer specimens in the field and subsequent conservation in liquid nitrogen reaction tubes do not necessarily need to be PCR clean. To avoid exploding of the tubes, the lid of the tubes should be punctured with a needle.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Any</td>
			<td>NA</td>
			<td>Make sure magnification is suitable to prepare the gastro-intestinaltract of the size of consumer of interest.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Any</td>
			<td>NA</td>
			<td>To dissect the gastro-intestinal tract of consumer specimens under the stereomikroscope.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel foceps: Dumont forceps No. 7</td>
			<td>Bioform</td>
			<td>B40d</td>
			<td>This curved stainless steel forceps can sometimes be very helful to hold specimen fixed inbetween the curved part without puncturing the gastro-intestinal tract.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel foceps: Dumont forceps Electronic No. 5</td>
			<td>Bioform</td>
			<td>B40b</td>
			<td>This fine stainless steel forceps is ideally suited for the preparation of the gastro-intestinal tract of consumer specimens.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA-ExitusPlus</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A7409,1000RF</td>
			<td>Decontamination solution for the removal of DNA and RNA contaminations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fuzz-free paper towel</td>
			<td>Any</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab scale</td>
			<td>Any</td>
			<td>NA</td>
			<td>Precision needs to be at least 0.01 g.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microlitre pipettes (0.5-10/10-100/50-200/100-1000 &#956;L)</td>
			<td>Any</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safe-Lock Tubes 2.0 ml</td>
			<td>VWR</td>
			<td>211-2165</td>
			<td>It is crucial that these raction tubes are free of DNA, DNase, RNase and PCR inhibitors (PCR clean)!</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safe-Lock Tubes 1.5 ml</td>
			<td>VWR</td>
			<td>211-2164</td>
			<td>It is crucial that these raction tubes are free of DNA, DNase, RNase and PCR inhibitors (PCR clean)!</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride &#8805;99.5%, p.a., ACS, ISO</td>
			<td>carlroth</td>
			<td>3957.3</td>
			<td>For salt extraction buffer (SEB) and 5M NaCl-solution required for extraction of DNA.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(hydroxymethyl)-aminomethane Tris</td>
			<td>carlroth</td>
			<td>4855.2</td>
			<td>For salt extraction buffer (SEB) and TBE buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microlitre pipettes (0.5-10/10-100/50-200/100-1000 &#956;L)</td>
			<td>carlroth</td>
			<td>8043.1</td>
			<td>For salt extraction buffer (SEB) and TBE buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric acid &#8805;99.8 %, p.a., ACS, ISO</td>
			<td>carlroth</td>
			<td>6943.2</td>
			<td>For TBE buffer. Not needed if commercialy available TBE buffer is obtained.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>carlroth</td>
			<td>4360.1</td>
			<td>For extraction of DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K lyophil.</td>
			<td>carlroth</td>
			<td>7528.1</td>
			<td>Prepare a working solution containing 10 mg/ml.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TissueLyser II</td>
			<td>Quiagen</td>
			<td>85300</td>
			<td>Bead mill for homogenization of the samples.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless Steel Beads, 5 mm</td>
			<td>Quiagen</td>
			<td>69989</td>
			<td>For homogenization of samples.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating Thermoshaker</td>
			<td>Any</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex Mixer</td>
			<td>Any</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated centrifuge: himac CT 15 RE</td>
			<td>Hitachi</td>
			<td>NA</td>
			<td>Refrigerated centrifuge used for centrifugation during the extraction of DNA (Protocol 1).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>carlroth</td>
			<td>6752.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 99.8 %, p.a.</td>
			<td>Any</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Molecular biology grade (ddH2O)</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A7398,1000</td>
			<td>nuclease-free (stream sterilized and DEPC treated) water used for re-suspension of DNA and whenever refered to ddH2O within the manuscript</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unmodified Olegonucleotides</td>
			<td>Eurofins MWG Operon</td>
			<td>NA</td>
			<td>Primers unlabeled</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Modified olegonucleotides</td>
			<td>Metabion International AG</td>
			<td>NA</td>
			<td>Primers labelled</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>peqGOLD Taq all inclusive</td>
			<td>VWR Peqlab</td>
			<td>01-1000</td>
			<td>Taq all inclusive for PCR reaction mixtures (reaction buffer Y and S, dNTPs and MgCl2)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primus 96 advanced gradient thermocycler or peqStar96x Universal Gradient</td>
			<td>Peqlab</td>
			<td>NA</td>
			<td>Primer sets were originally established on a Primus 96 advanced gradient thermocycler. As this cycler was quite old, we than checked if our primer sets are efficient and specific under the same conditions using the peqSta96x (which also could simulate the older model). However, tests showed that our primers work well and are still specific (see Koester et al. 2013) without using the simulation of the old machine.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard 96 Well PCR Plates</td>
			<td>VWR Peqlab</td>
			<td>732-2879</td>
			<td>Used for PCR reactions.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Profile Tube Stripes 0.15 ml with Flat Cap Stripes</td>
			<td>VWR Peqlab</td>
			<td>732-3223</td>
			<td>Cap stripes used to close the PCR plates.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Peqlab</td>
			<td>35-1020</td>
			<td>Used for gel electrophoresis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwave</td>
			<td>Any</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical flask</td>
			<td>Any</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Measuring cylinder</td>
			<td>Any</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horizontal electrophoresis unit and respective combs with teeth</td>
			<td>Any</td>
			<td>NA</td>
			<td>For agarose gel electrophoresis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis Power Supply PS3002</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium bromide solution 1 %</td>
			<td>carlroth</td>
			<td>2218.1</td>
			<td>Used to prepare staining bath for agarose gels.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formamide</td>
			<td>carlroth</td>
			<td>6749.1</td>
			<td>Needded for the denaturation buffer for SSCP analyses.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromphenol blue</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A3640.0010</td>
			<td>Needed for the loading dye for agarose gel electrophoresis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>carlroth</td>
			<td>4621.1</td>
			<td>Needed for the loading dye for agarose gel electrophoresis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 bp-DNA-Ladder extended</td>
			<td>carlroth</td>
			<td>T835.1</td>
			<td>As size standard for agarose gel electrophoresis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV-Documentation system</td>
			<td>Any</td>
			<td>NA</td>
			<td>To visualize gel electrophoresis results.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotiphorese NF-Acrylamide/Bis-solution 40 % (29:1)</td>
			<td>carlroth</td>
			<td>A121.1</td>
			<td>For the preparation of polyacrylamid gels.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium peroxydisulphate</td>
			<td>carlroth</td>
			<td>9592.2</td>
			<td>For the preparation of polyacrylamid gels.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>foldback clips (32 mm)</td>
			<td>Any</td>
			<td>NA</td>
			<td>For the preparation of polyacrylamid gels.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>square-shaped plastic box (21 &#215; 6.5 &#215; 5 cm)</td>
			<td>Any</td>
			<td>NA</td>
			<td>For the preparation of polyacrylamid gels.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td>
			<td>carlroth</td>
			<td>23.67.1</td>
			<td>For the preparation of polyacrylamid gels.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beaker</td>
			<td>Any</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RC 10 Digital chiller</td>
			<td>VWR</td>
			<td>462-0138</td>
			<td>For SSCP analyses using polyacrylamide gel electrophoresis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical electrophoresis unit P10DS (OWL Separation Systems)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>700-2361</td>
			<td>For SSCP analyses using polyacrylamide gel electrophoresis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Notched glass plate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>730-0261</td>
			<td>For SSCP analyses using polyacrylamide gel electrophoresis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blank glass plate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>730-0260</td>
			<td>For SSCP analyses using polyacrylamide gel electrophoresis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spacers</td>
			<td>VWR</td>
			<td>730-0262</td>
			<td>For SSCP analyses using polyacrylamide gel electrophoresis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Comb with 25 teeth</td>
			<td>VWR</td>
			<td>730-0294</td>
			<td>For SSCP analyses using polyacrylamide gel electrophoresis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking platform</td>
			<td>Any</td>
			<td>NA</td>
			<td>For constant shaking of the staining bath.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GelStar Nucleic Acid Stain (Lonza Rockland, Inc.)</td>
			<td>Biozym</td>
			<td>850535 (50535)</td>
			<td>For staining of polyacrylamide gels.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenomeLab DNA Size Standard Kit 400bp</td>
			<td>AB Sciex</td>
			<td>608098</td>
			<td>For automated fragment analyses. Size stanard for Batch B.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenomeLab DNA Size Standard Kit 600bp</td>
			<td>AB Sciex</td>
			<td>608095</td>
			<td>For automated fragment analyses. Size stanard for Batch A.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample Loading Solution (SLS)</td>
			<td>AB Sciex</td>
			<td>608082</td>
			<td>For automated fragment analyses.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sequenzing plate - 96 Well Polypropylene PCR Microplate</td>
			<td>Costar</td>
			<td>6551</td>
			<td>For automated fragment analyses.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate centrifuge, PerfectSpin P</td>
			<td>VWR Peqlab</td>
			<td>NA</td>
			<td>mini plate centrifuge used to spin down PCR products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer plate - 96 Well EIA/RIA Clear Flat Bottom Polystyrene Not Treated Microplate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>9017</td>
			<td>For automated fragment analyses.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenomeLab Seperation buffer</td>
			<td>AB Sciex</td>
			<td>608012</td>
			<td>For automated fragment analyses.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Separation Gel - LPAI</td>
			<td>AB Sciex</td>
			<td>608010</td>
			<td>For automated fragment analyses.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sequenzer - CEQ8000 Genetic Analysis System</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>NA</td>
			<td>For automated fragment analyses.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneMarker V1.95</td>
			<td>Softgenetics</td>
			<td>NA</td>
			<td>To analyze results of automated fragment analyses.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

laboratory protocol for genetic gut content analyses of aquatic macroinvertebrates using group-specific rdna primers

음식 웹 분석 생태계의 더 나은 이해를 위해 근본적 이다. 예를 들어 식품 웹 상호 작용 비 원주민 종족의 침공으로 인 한 심한 변화를 받을 수 있습니다. 그러나, 필드 약탈자 먹이 상호 작용의 정확한 식별 대부분의 경우에서 어렵습니다. 이러한 분석은 종종 본질적인 내용에 대 한 시각적 평가 또는 안정 동위 원소 비율 (δ15N 그리고 δ13C)의 분석 기반으로 합니다. 이러한 방법이 필요 포괄적인 지식에 대해, 각각, morphologic 다양성 또는 개별 먹이 생물, 먹이 생물의 정확한 식별에서 장애물을 선도에서 동위 원소 서명. 단식, 섭취 및 먹이 생물의 소화 어려울 특정 종의 식별 하기 때문에 비주얼 직감 콘텐츠 분석 특히 부드러운 바디 먹이 생물을 과소 평가. 따라서, 중 합 효소 연쇄 반응 (PCR) 기반 전략, 예를 들어 그룹-특정 뇌관의 사용 설정, 식품 웹 상호 작용의 수사를 위한 강력한 도구를 제공 합니다. 여기, 우리가 핵 ribosomal deoxyribonucleic acid (rDNA)에 대 한 그룹-특정 뇌관 세트를 사용 하 여 필드에서 macroinvertebrate 소비자의 본질적인 내용을 조사 하기 위해 상세한 프로토콜을 설명 합니다. DNA 수 (작은 taxa)의 경우 전체 표본에서 추출 하거나 표본 수집 분야에서의 본질적인 내용. 존재와 DNA의 기능 효율성 테스트 개인에서 직접 확인 될 필요가 보편적인 뇌관을 사용 하 여 DNA의 각 소 단위를 대상으로 설정. 우리는 또한 소비 먹이 후속 단일 가닥 구조 다형성 (SSCP) 분석 polyacrylamide 젤을 사용 하 여 수정 되지 않은 그룹 특정 한 뇌관으로 PCR 통해 종 수준 추가 결합 결정 될 수 있다 보여줍니다. 또한, 우리는 레이블로 다른 형광 성 염료를 사용 하 여 자동된 조각 분석을 통해 여러 창 콘텐츠 샘플에서 다른 먹이 그룹의 DNA 파편에 대 한 병렬 심사 수 보여줍니다.

우리는 성공적으로 다른 연구에서 다이어트 분석이 프로토콜에 설명 된 단계를 사용 합니다. 이 섹션에서 우리는 프로토콜의 다른 섹션의 적용을 설명 하는 예제를 제시.
예를 들어, 저자28 및 SSCP 분석에 의해 PCR 제품의 추가 다운스트림 분석의 잠재력에 의해 설립 하는 그룹-특정 뇌관 세트의 효과 설명 하는...

Watch this Scientific Journal Video about Laboratory Protocol for Genetic Gut Content Analyses of Aquatic Macroinvertebrates Using Group-specific rDNA Primers at JoVE.com

Laboratory Protocol for Genetic Gut Content Analyses of Aquatic Macroinvertebrates Using Group-specific rDNA Primers

Macroinvertebrates의 가장 일반적인 직감 콘텐츠 분석은 시각. 먹이 생물의 형태학 상 다양성에 대 한 강렬한 지식을 요구, 그들은 부드러운 바디 먹이 놓치지 고, 때문에 먹이의 강한 분쇄, amphipods를 포함 한 어떤 유기 체에 대 한 거의 불가능 하다. 우리는 macroinvertebrate에 대 한 자세한, 소설 유전 접근 먹이 amphipods의 식단에 식별을 제공 합니다.

Macroinvertebrates 사용 하 여 그룹별 수생 rDNA 뇌관의 유전 직감 콘텐츠 분석을 위한 실험실 프로토콜

Analyzing food webs is essential for a better understanding of ecosystems. For example, food web interactions can undergo severe changes caused by the ...

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