Name: laboratory protocol for genetic gut content analyses of aquatic macroinvertebrates using group-specific rdna primers
Uploaded: 2017-10-05T12:55:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Laboratory Protocol for Genetic Gut Content Analyses of Aquatic Macroinvertebrates Using Group-specific rDNA Primers at JoVE.com

Vi takker Silke Classen fra Research Institute for økosystemet analyse og vurdering (gaiac), RWTH Aachen for henne hjelp i etableringen av gruppespesifikke primer brukes i denne protokollen. Vi takker også Peter Martin og Laura Schynawa fra Universitetet i Kiel for samarbeid i vann midd eksperimenter. Vi takker også teknisk lab assistentene for å holde laboratoriet knirkefritt og forberede register og katalognummer. Dette arbeidet ble støttet av tysk Research Foundation (DFG, prosjektet GE 2219/3-1).

1. samle Macroinvertebrates fra feltet og forberede prøvene genetisk Gut innhold analyser.
<ol><li>Samle macroinvertebrates på hvert område, sortere ut individer av forbrukernes interesse i enkelt rør, og direkte fryse dem i flytende nitrogen eller tørris å hindre gut klarering og nedbrytning av DNA. 
	Merk: Unngå å lagre prøver alkohol, fordi noen macroinvertebrates pleier å regurgitate før alkohol dreper dem.</li>
	<li>Bare bruke mage-tarmkanalen av mellomstore og store (ca &#62; 3 mm) macroi...

<ol>
	<li>Carreon-Martinez, L., Heath, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revolution+in+food+web+analysis+and+trophic+ecology:+diet+analysis+by+DNA+and+stable+isotope+analysis.">Revolution in food web analysis and trophic ecology: diet analysis by DNA and stable isotope analysis.</a> Mol Ecol. 9 (1), 25-27 (2010).</li><li>Hardy, C. M., Krull, E. S., Hartley, D. M., Oliver, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carbon+source+accounting+for+fish+using+combined+DNA+and+stable+isotope+analyses+in+a+regulated+lowland+river+weir+pool.">Carbon source accounting for fish using combined DNA and stable isotope analyses in a regulated lowland river weir pool.</a> Mol Ecol. 19 (1), 197-212 (2010).</li><li>Baxter, C. V., Fausch, K. D., Saunders, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tangled+webs:+reciprocal+flows+of+invertebrate+prey+link+streams+and+riparian+zones.">Tangled webs: reciprocal flows of invertebrate prey link streams and riparian zones.</a> Freshwater Biol. 50 (2), 201-220 (2005).</li><li>Baxter, C. V., Fausch, K. D., Murakami, M., Chapman, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fish+invasion+restructures+stream+and+forest+food+webs+by+interrupting+reciprocal+prey+subsidies.">Fish invasion restructures stream and forest food webs by interrupting reciprocal prey subsidies.</a> Ecol. 85 (10), 2656-2663 (2004).</li><li>Traugott, M., Kamenova, S., Ruess, L., Seeber, J., Plantegenest, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Empirically+Characterising+Trophic+Networks:+What+Emerging+DNA-Based+Methods,+Stable+Isotope+and+Fatty+Acid+Analyses+Can+Offer.">Empirically Characterising Trophic Networks: What Emerging DNA-Based Methods, Stable Isotope and Fatty Acid Analyses Can Offer.</a> Adv. Ecol. Res. Vol 49: Ecological Networks in an Agricultural World. 49, 177-224 (2013).</li><li>Diaz Arredondo, M. A., Guzman del Proo, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feeding+habits+of+the+spiny+lobster+(Panulirus+interruptus+Randall,+1840)+in+Bahia+Tortugas,+Baja+California+Sur.">Feeding habits of the spiny lobster (Panulirus interruptus Randall, 1840) in Bahia Tortugas, Baja California Sur.</a> Cienc Mar. 21 (4), 439-462 (1995).</li><li>Letourneur, Y., Galzin, R., Harmelin-Vivien, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+variations+in+the+diet+of+the+damselfish+Stegastes+nigricans+(Lacep&#232;de)+on+a+R&#233;union+fringing+reef.">Temporal variations in the diet of the damselfish Stegastes nigricans (Lacep&#232;de) on a R&#233;union fringing reef.</a> J Exp Mar Biol Ecol. 217 (1), 1-18 (1997).</li><li>Akin, S., Winemiller, K. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seasonal+variation+in+food+web+composition+and+structure+in+a+temperate+tidal+estuary.">Seasonal variation in food web composition and structure in a temperate tidal estuary.</a> Estuar Coast. 29 (4), 552-567 (2006).</li><li>Redd, K. S., Jarman, S. N., Frusher, S. D., Johnson, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+molecular+approach+to+identify+prey+of+the+southern+rock+lobster.">A molecular approach to identify prey of the southern rock lobster.</a> Bull Entomol Res. 98 (3), 233-238 (2008).</li><li>Gergs, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dreissena+polymorpha+in+Lake+Constance:+An+example+of+a+keystone+engineer?.">Dreissena polymorpha in Lake Constance: An example of a keystone engineer?.</a> Universit&#228;t Konstanz. , (2009).</li><li>Sheppard, S. K., Harwood, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+molecular+ecology:+tracking+trophic+links+through+predator-prey+food-webs.">Advances in molecular ecology: tracking trophic links through predator-prey food-webs.</a> Funct Ecol. 19 (5), 751-762 (2005).</li><li>Jarman, S. N., Ward, R. D., Elliott, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligonucleotide+primers+for+PCR+amplification+of+coelomate+introns.">Oligonucleotide primers for PCR amplification of coelomate introns.</a> Mar Biotechnol (NY). 4 (4), 347-355 (2002).</li><li>Verma, S. K., Singh, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+universal+primers+establish+identity+of+an+enormous+number+of+animal+species+for+forensic+application.">Novel universal primers establish identity of an enormous number of animal species for forensic application.</a> Mol Ecol Notes. 3 (1), 28-31 (2003).</li><li>Deagle, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+scatology+as+a+tool+to+study+diet:+analysis+of+prey+DNA+in+scats+from+captive+Steller+sea+lions.">Molecular scatology as a tool to study diet: analysis of prey DNA in scats from captive Steller sea lions.</a> Mol Ecol. 14 (6), 1831-1842 (2005).</li><li>Jarman, S. N., Deagle, B. E., Gales, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Group-specific+polymerase+chain+reaction+for+DNA-based+analysis+of+species+diversity+and+identity+in+dietary+samples.">Group-specific polymerase chain reaction for DNA-based analysis of species diversity and identity in dietary samples.</a> Mol Ecol. 13 (5), 1313-1322 (2004).</li><li>Jarman, S. N., Redd, K. S., Gales, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Group-specific+primers+for+amplifying+DNA+sequences+that+identify+Amphipoda,+Cephalopoda,+Echinodermata,+Gastropoda,+Isopoda,+Ostracoda+and+Thoracica.">Group-specific primers for amplifying DNA sequences that identify Amphipoda, Cephalopoda, Echinodermata, Gastropoda, Isopoda, Ostracoda and Thoracica.</a> Mol Ecol Notes. 6 (1), 268-271 (2006).</li><li>Hayashi, K., Yandell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+sensitive+is+PCR-SSCP?.">How sensitive is PCR-SSCP?.</a> Hum Mutat. 2 (5), 338-346 (1993).</li><li>Glava&#269;, D., Dean, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+the+single-strand+conformation+polymorphism+(SSCP)+technique+for+detection+of+point+mutations.">Optimization of the single-strand conformation polymorphism (SSCP) technique for detection of point mutations.</a> Hum Mutat. 2 (5), 404-414 (1993).</li><li>M&#252;lhardt, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Der Experimentator Molekularbiologie / Genomics. , (2013).</li><li>Lee, S. V., Bahaman, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discriminatory+Power+of+Agarose+Gel+Electrophoresis+in+DNA+Fragments+Analysis.">Discriminatory Power of Agarose Gel Electrophoresis in DNA Fragments Analysis.</a> Gel Electrophoresis - Principles and Basics. , (2012).</li><li>Wang, X. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+electrophoresis+technique+to+separate+microsatellite+alleles.">A new electrophoresis technique to separate microsatellite alleles.</a> Afr J Biotechnol. 8 (11), 2432-2436 (2009).</li><li>Gemmer, I., Gergs, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+first+twelve+microsatellite+loci+for+the+amphipod+Gammarus+roeselii+(Crustacea:+Amphipoda).">Characterization of the first twelve microsatellite loci for the amphipod Gammarus roeselii (Crustacea: Amphipoda).</a> Conserv Genet Resour. 5 (4), 955-957 (2013).</li><li>Olafsson, K., Hjorleifsdottir, S., Pampoulie, C., Hreggvidsson, G. O., Gudjonsson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+set+of+multiplex+assays+(SalPrint15)+for+efficient+analysis+of+15+microsatellite+loci+of+contemporary+samples+of+the+Atlantic+salmon+(Salmo+salar).">Novel set of multiplex assays (SalPrint15) for efficient analysis of 15 microsatellite loci of contemporary samples of the Atlantic salmon (Salmo salar).</a> Mol Ecol Resour. 10 (3), 533-537 (2010).</li><li>Baric, S., Hollrigl, A., Fureder, L., Petutschnig, J., Dalla Via, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=First+analysis+of+genetic+variability+in+Carinthian+populations+of+the+white-clawed+crayfish+Austropotamobius+pallipes.">First analysis of genetic variability in Carinthian populations of the white-clawed crayfish Austropotamobius pallipes.</a> Bull. Fr. Peche Piscicult. (380-381), 977-990 (2006).</li><li>Koester, M., Gergs, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=No+evidence+for+intraguild+predation+of+Dikerogammarus+villosus+(Sowinsky,+1894)+at+an+invasion+front+in+the+Untere+Lorze,+Switzerland.">No evidence for intraguild predation of Dikerogammarus villosus (Sowinsky, 1894) at an invasion front in the Untere Lorze, Switzerland.</a> Aquat Invasions. 9 (4), 489-497 (2014).</li><li>Sonnenberg, R., Nolte, A. W., Tautz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+evaluation+of+LSU+rDNA+D1-D2+sequences+for+their+use+in+species+identification.">An evaluation of LSU rDNA D1-D2 sequences for their use in species identification.</a> Front Zool. 4 (6), 6 (2007).</li><li>Koester, M., Bayer, B., Gergs, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+Dikerogammarus+villosus+(Crustacea,+Gammaridae)+a+'killer+shrimp'+in+the+River+Rhine+system?.">Is Dikerogammarus villosus (Crustacea, Gammaridae) a 'killer shrimp' in the River Rhine system?.</a> Hydrobiologia. 768 (1), 299-313 (2016).</li><li>Koester, M., Cla&#223;en, S., Gergs, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+group-specific+PCR+primers+for+the+identification+of+freshwater+macroinvertebrates.">Establishment of group-specific PCR primers for the identification of freshwater macroinvertebrates.</a> Conserv Genet Resour. 5 (4), 1091-1093 (2013).</li><li>Martin, P., Koester, M., Schynawa, L., Gergs, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=First+detection+of+prey+DNA+in+Hygrobates+fluviatilis+(Hydrachnidia,+Acari):+a+new+approach+for+determining+predator-prey+relationships+in+water+mites.">First detection of prey DNA in Hygrobates fluviatilis (Hydrachnidia, Acari): a new approach for determining predator-prey relationships in water mites.</a> Exp Appl Acarol. 67 (3), 373-380 (2015).</li><li>Deagle, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+Seabird+Diet+through+Genetic+Analysis+of+Faeces:+A+Case+Study+on+Macaroni+Penguins+(Eudyptes+chrysolophus).">Studying Seabird Diet through Genetic Analysis of Faeces: A Case Study on Macaroni Penguins (Eudyptes chrysolophus).</a> PLoS One. 2 (9), e831 (2007).</li><li>Sint, D., Niederklapfer, B., Kaufmann, R., Traugott, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Group-Specific+Multiplex+PCR+Detection+Systems+for+the+Identification+of+Flying+Insect+Prey.">Group-Specific Multiplex PCR Detection Systems for the Identification of Flying Insect Prey.</a> PLoS One. 9 (12), e115501 (2014).</li><li>Zarzoso-Lacoste, D., Corse, E., Vidal, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+PCR+detection+of+prey+in+molecular+diet+studies:+importance+of+group-specific+primer+set+selection+and+extraction+protocol+performances.">Improving PCR detection of prey in molecular diet studies: importance of group-specific primer set selection and extraction protocol performances.</a> Mol Ecol Resour. 13 (1), 117-127 (2013).</li><li>Vestheim, H., Jarman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blocking+primers+to+enhance+PCR+amplification+of+rare+sequences+in+mixed+samples+-+a+case+study+on+prey+DNA+in+Antarctic+krill+stomachs.">Blocking primers to enhance PCR amplification of rare sequences in mixed samples - a case study on prey DNA in Antarctic krill stomachs.</a> Front Zool. 5 (1), 12 (2008).</li><li>Harper, G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+screening+of+invertebrate+predators+for+multiple+prey+DNA+targets.">Rapid screening of invertebrate predators for multiple prey DNA targets.</a> Mol Ecol. 14 (3), 819-827 (2005).</li></ol>

Her presenterer vi en enkel og kostnadseffektiv metode for PCR-baserte fastsettelse av predator-byttedyr interaksjoner fra feltet prøver via gruppespesifikke primere for rDNA regioner, som kan kombineres med andre ikke-molekylær analyser av de samme. Det er imidlertid flere avgjørende skritt i protokollen. Først er det viktig å sikre spesifisiteten av primere brukt. Dernest er det avgjørende å unngå forurensning og tap av tarmen innholdet materiale under utarbeidelsen av mage-tarmkanalen og påfølgende utvinning...

Predator-byttedyr interaksjoner, som utgjør flertallet av trophic interaksjoner og næringskjeden dynamikk, er viktige aspekter å karakterisere flukser av materie og energi gjennom næringskjeder innenfor og mellom økosystemer, som er en av de viktigste målene for økologi 1. fastsettelse av kilden og flyt av karbon og næringsstoffer er fremme forståelsen av økologiske tilkobling mellom økosystemer2. Imidlertid er økosystemer, som elver og deres nedbørfelt, ikke bare koblet av flukser av organisk stoff og næringsstoffer, men også av bevegelser av organismer3. Dermed kan habitat endringer forstyrre flyten av ressurser som kobler disse systemene sterkt endre næringskjeder både økosystemer, ikke bare direkte, men også indirekte ved å endre respektive sammensetningen av predator-byttedyr samfunn. For eksempel vist endringer av næringskjeder seg å være knyttet til bevegelser av enkelt predator arter (f.eks, regnbueørret)4. Slike endringer truer potensielt biologisk mangfold og funksjon av akvatiske økosystemer. Analysere predator-byttedyr interaksjoner i feltet er derfor viktig å fastslå effekten av menneskeskapte miljømessige endringer, for eksempel vann forvaltningspraksis på det opprinnelige biodiversitet av akvatiske økosystemer.
Siden sporing trophic sammenhengene er vanskelig i komplekse systemer, har flere tilnærminger blitt etablert som aktiverer vurdering av fôring interaksjoner i feltet5. Tradisjonelt undersøkelser av fôring interaksjoner i feltet er basert på visuell identifikasjon av byttedyr i dissekert guts og krever en omfattende kunnskap om morfologiske byttedyr mangfold. Visuelle gut innhold analyser har gitt innsikt i ressursbruk av flere grupper av forbrukerne (f.eks sesongvariasjon i kostholdet i hummer6 og fisk7,8 eller fôring valg av Raudåta). Men fysisk prosessen med fordøyelsen gjør visuelle gut innhold analyser vanskelig og vanligvis bommer myk bodied byttedyr-organismer9. Arter fôring av flytende inntak eller noen virvelløse forbrukere som intenst comminute maten før svelging, som amfipoder, er visuell identifikasjon av byttedyr i tarmen innholdet umulig10. På grunn av disse begrensningene er molekylær analyse et lovende alternativ.
Molekylær analyser har nå blitt et vanlig verktøy tillater rask og presis byttedyr oppdagelsen i tarmen innholdet. Slike teknikker er mangfoldige: strategier basert på monoklonale antistoffer eller polymerase kjedereaksjoner (PCR) blir ofte brukt, på grunn av deres høy spesifisitet og følsomhet11. Utviklingen av nye monoklonale antistoffer er tid - og kostnadskrevende, derfor bruk av andre molekylære teknikker er mer nyttig når antistoffer ikke allerede finnes11. En annen felles tilnærming er forsterkning av regionene i deoksyribonukleinsyre (DNA), som ribosomal ribonukleinsyre (RNA) gener i de fleste arter, bruker universell primer angir12,13. Når du bruker denne teknikken, er det ofte ikke mulig å identifisere hele spekteret av byttedyr organismer i blandet kilder DNA14. En effektiv tilnærming til å unngå slik en ulempe er å bruke gruppespesifikke primer sett for genetisk gut innhold analyser. Utviklet for å forsterke bare DNA regioner i bestemte målgrupper og utelukke alle andre arter15,16, aktiverer gruppespesifikke primere identifisering av byttedyr organismer på taksonomisk nivået på de angitte gruppene uten tid - og kostnadskrevende sekundære analyser. Men som alle gut innholdsanalyse, gi slike analyser bare et øyeblikksbilde av fôring atferd. Derfor regnes kombinere molekylær gut innhold analyser med analyser av tid-integrere naturlig tracers (f.eks isotoper) gunstig1,2.
Her beskriver vi en detaljert metode for PCR-baserte undersøkelser av predator-byttedyr interaksjoner ved hjelp av gruppespesifikke primer sett for kjernefysisk ribosomal DNA (rDNA) regioner kombineres med stabil isotop analyser av samme prøven. Vi beskriver oppdagelsen av DNA av enkelt bytte grupper via agarose gel geleelektroforese. I tillegg presenterer vi en mulighet for videre nedstrøms analyser av PCR produkter av slike gruppespesifikke primere gjelder når en høyere taksonomisk oppløsning enn primerne spesifisitet er nødvendig. Fordi enkelt strandet DNA (ssDNA) fragmenter skjemaet tertiær konformasjonen som bestemmes av deres primære sekvens17, føre små variasjoner i fragmenter forsterket av slike gruppespesifikke primere til conformational endringer. Slike endringer kan oppdages ved enkelt tråd konformasjon polymorfisme (SSCP) analyser med polyakrylamid gels17,18, muliggjør en mer nøyaktig identifikasjon av byttedyr organismer (ned til arter nivå).
Mens agarose gel geleelektroforese er en vanlig og rimelig verktøy for å visualisere DNA fragmenter og bestemme deres omtrentlig lengde19, oppløsningen avhenger av mengden av DNA, og flekker fargestoff brukt20. Vanligvis visualisering er rett frem når du arbeider med ren DNA-prøver, men potensielt lave mengder byttedyr DNA i tarmen innholdet forbrukere kan komplisere scoring av agarose gel geleelektroforese resultater. Likevel denne oppdagelsen metoden er mulig å skjermen et lavt antall forbruker prøver fra feltet en eller noen byttedyr grupper, men komplikasjon i scoring gjør screening av et høyt antall prøver i flere byttedyr taxa tid svært intensiv og dermed upraktisk. En mer følsomme gjenkjennings-metoden er automatisk analyse av fragmenter via kapillært geleelektroforese, som i tillegg lar fastsettelse av den nøyaktige lengden fragmenter21. Flere mikrosatellittmarkør basert studier har vist at ved å bruke ulike fluorescerende fargestoffer som etiketter, er det mulig å oppdage og finne ulike fragmenter av sammenlignbare lengde ved automatisert fragment analyse22,23, 24. Derfor presentere vi også en detaljert protokoll for parallell oppdagelsen av DNA fra flere byttedyr grupper bruker PCR med merket gruppespesifikke primer sett og gjenkjenning via automatisert fragment analyse med en automatisert sequencer. I tillegg presenterer vi resultatene fra en studie viser at påvisning av byttedyr DNA via automatisert fragment analyse er en tilnærming som en relativ kvantifisering av inntatt byttedyr.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>liquid nitrogen</td>
			<td>Any</td>
			<td>NA</td>
			<td>For transport of field samples of macroinvertebrates to the laboratory.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 ml reaction tubes - Safelock</td>
			<td>Any</td>
			<td>NA</td>
			<td>For collection of consumer specimens in the field and subsequent conservation in liquid nitrogen reaction tubes do not necessarily need to be PCR clean. To avoid exploding of the tubes, the lid of the tubes should be punctured with a needle.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Any</td>
			<td>NA</td>
			<td>Make sure magnification is suitable to prepare the gastro-intestinaltract of the size of consumer of interest.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Any</td>
			<td>NA</td>
			<td>To dissect the gastro-intestinal tract of consumer specimens under the stereomikroscope.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel foceps: Dumont forceps No. 7</td>
			<td>Bioform</td>
			<td>B40d</td>
			<td>This curved stainless steel forceps can sometimes be very helful to hold specimen fixed inbetween the curved part without puncturing the gastro-intestinal tract.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel foceps: Dumont forceps Electronic No. 5</td>
			<td>Bioform</td>
			<td>B40b</td>
			<td>This fine stainless steel forceps is ideally suited for the preparation of the gastro-intestinal tract of consumer specimens.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA-ExitusPlus</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A7409,1000RF</td>
			<td>Decontamination solution for the removal of DNA and RNA contaminations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fuzz-free paper towel</td>
			<td>Any</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab scale</td>
			<td>Any</td>
			<td>NA</td>
			<td>Precision needs to be at least 0.01 g.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microlitre pipettes (0.5-10/10-100/50-200/100-1000 &#956;L)</td>
			<td>Any</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safe-Lock Tubes 2.0 ml</td>
			<td>VWR</td>
			<td>211-2165</td>
			<td>It is crucial that these raction tubes are free of DNA, DNase, RNase and PCR inhibitors (PCR clean)!</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safe-Lock Tubes 1.5 ml</td>
			<td>VWR</td>
			<td>211-2164</td>
			<td>It is crucial that these raction tubes are free of DNA, DNase, RNase and PCR inhibitors (PCR clean)!</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride &#8805;99.5%, p.a., ACS, ISO</td>
			<td>carlroth</td>
			<td>3957.3</td>
			<td>For salt extraction buffer (SEB) and 5M NaCl-solution required for extraction of DNA.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(hydroxymethyl)-aminomethane Tris</td>
			<td>carlroth</td>
			<td>4855.2</td>
			<td>For salt extraction buffer (SEB) and TBE buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microlitre pipettes (0.5-10/10-100/50-200/100-1000 &#956;L)</td>
			<td>carlroth</td>
			<td>8043.1</td>
			<td>For salt extraction buffer (SEB) and TBE buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric acid &#8805;99.8 %, p.a., ACS, ISO</td>
			<td>carlroth</td>
			<td>6943.2</td>
			<td>For TBE buffer. Not needed if commercialy available TBE buffer is obtained.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>carlroth</td>
			<td>4360.1</td>
			<td>For extraction of DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K lyophil.</td>
			<td>carlroth</td>
			<td>7528.1</td>
			<td>Prepare a working solution containing 10 mg/ml.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TissueLyser II</td>
			<td>Quiagen</td>
			<td>85300</td>
			<td>Bead mill for homogenization of the samples.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless Steel Beads, 5 mm</td>
			<td>Quiagen</td>
			<td>69989</td>
			<td>For homogenization of samples.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating Thermoshaker</td>
			<td>Any</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex Mixer</td>
			<td>Any</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated centrifuge: himac CT 15 RE</td>
			<td>Hitachi</td>
			<td>NA</td>
			<td>Refrigerated centrifuge used for centrifugation during the extraction of DNA (Protocol 1).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>carlroth</td>
			<td>6752.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 99.8 %, p.a.</td>
			<td>Any</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Molecular biology grade (ddH2O)</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A7398,1000</td>
			<td>nuclease-free (stream sterilized and DEPC treated) water used for re-suspension of DNA and whenever refered to ddH2O within the manuscript</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unmodified Olegonucleotides</td>
			<td>Eurofins MWG Operon</td>
			<td>NA</td>
			<td>Primers unlabeled</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Modified olegonucleotides</td>
			<td>Metabion International AG</td>
			<td>NA</td>
			<td>Primers labelled</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>peqGOLD Taq all inclusive</td>
			<td>VWR Peqlab</td>
			<td>01-1000</td>
			<td>Taq all inclusive for PCR reaction mixtures (reaction buffer Y and S, dNTPs and MgCl2)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primus 96 advanced gradient thermocycler or peqStar96x Universal Gradient</td>
			<td>Peqlab</td>
			<td>NA</td>
			<td>Primer sets were originally established on a Primus 96 advanced gradient thermocycler. As this cycler was quite old, we than checked if our primer sets are efficient and specific under the same conditions using the peqSta96x (which also could simulate the older model). However, tests showed that our primers work well and are still specific (see Koester et al. 2013) without using the simulation of the old machine.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard 96 Well PCR Plates</td>
			<td>VWR Peqlab</td>
			<td>732-2879</td>
			<td>Used for PCR reactions.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Profile Tube Stripes 0.15 ml with Flat Cap Stripes</td>
			<td>VWR Peqlab</td>
			<td>732-3223</td>
			<td>Cap stripes used to close the PCR plates.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Peqlab</td>
			<td>35-1020</td>
			<td>Used for gel electrophoresis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwave</td>
			<td>Any</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical flask</td>
			<td>Any</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Measuring cylinder</td>
			<td>Any</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horizontal electrophoresis unit and respective combs with teeth</td>
			<td>Any</td>
			<td>NA</td>
			<td>For agarose gel electrophoresis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis Power Supply PS3002</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium bromide solution 1 %</td>
			<td>carlroth</td>
			<td>2218.1</td>
			<td>Used to prepare staining bath for agarose gels.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formamide</td>
			<td>carlroth</td>
			<td>6749.1</td>
			<td>Needded for the denaturation buffer for SSCP analyses.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromphenol blue</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A3640.0010</td>
			<td>Needed for the loading dye for agarose gel electrophoresis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>carlroth</td>
			<td>4621.1</td>
			<td>Needed for the loading dye for agarose gel electrophoresis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 bp-DNA-Ladder extended</td>
			<td>carlroth</td>
			<td>T835.1</td>
			<td>As size standard for agarose gel electrophoresis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV-Documentation system</td>
			<td>Any</td>
			<td>NA</td>
			<td>To visualize gel electrophoresis results.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotiphorese NF-Acrylamide/Bis-solution 40 % (29:1)</td>
			<td>carlroth</td>
			<td>A121.1</td>
			<td>For the preparation of polyacrylamid gels.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium peroxydisulphate</td>
			<td>carlroth</td>
			<td>9592.2</td>
			<td>For the preparation of polyacrylamid gels.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>foldback clips (32 mm)</td>
			<td>Any</td>
			<td>NA</td>
			<td>For the preparation of polyacrylamid gels.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>square-shaped plastic box (21 &#215; 6.5 &#215; 5 cm)</td>
			<td>Any</td>
			<td>NA</td>
			<td>For the preparation of polyacrylamid gels.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td>
			<td>carlroth</td>
			<td>23.67.1</td>
			<td>For the preparation of polyacrylamid gels.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beaker</td>
			<td>Any</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RC 10 Digital chiller</td>
			<td>VWR</td>
			<td>462-0138</td>
			<td>For SSCP analyses using polyacrylamide gel electrophoresis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical electrophoresis unit P10DS (OWL Separation Systems)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>700-2361</td>
			<td>For SSCP analyses using polyacrylamide gel electrophoresis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Notched glass plate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>730-0261</td>
			<td>For SSCP analyses using polyacrylamide gel electrophoresis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blank glass plate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>730-0260</td>
			<td>For SSCP analyses using polyacrylamide gel electrophoresis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spacers</td>
			<td>VWR</td>
			<td>730-0262</td>
			<td>For SSCP analyses using polyacrylamide gel electrophoresis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Comb with 25 teeth</td>
			<td>VWR</td>
			<td>730-0294</td>
			<td>For SSCP analyses using polyacrylamide gel electrophoresis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking platform</td>
			<td>Any</td>
			<td>NA</td>
			<td>For constant shaking of the staining bath.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GelStar Nucleic Acid Stain (Lonza Rockland, Inc.)</td>
			<td>Biozym</td>
			<td>850535 (50535)</td>
			<td>For staining of polyacrylamide gels.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenomeLab DNA Size Standard Kit 400bp</td>
			<td>AB Sciex</td>
			<td>608098</td>
			<td>For automated fragment analyses. Size stanard for Batch B.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenomeLab DNA Size Standard Kit 600bp</td>
			<td>AB Sciex</td>
			<td>608095</td>
			<td>For automated fragment analyses. Size stanard for Batch A.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample Loading Solution (SLS)</td>
			<td>AB Sciex</td>
			<td>608082</td>
			<td>For automated fragment analyses.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sequenzing plate - 96 Well Polypropylene PCR Microplate</td>
			<td>Costar</td>
			<td>6551</td>
			<td>For automated fragment analyses.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate centrifuge, PerfectSpin P</td>
			<td>VWR Peqlab</td>
			<td>NA</td>
			<td>mini plate centrifuge used to spin down PCR products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer plate - 96 Well EIA/RIA Clear Flat Bottom Polystyrene Not Treated Microplate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>9017</td>
			<td>For automated fragment analyses.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenomeLab Seperation buffer</td>
			<td>AB Sciex</td>
			<td>608012</td>
			<td>For automated fragment analyses.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Separation Gel - LPAI</td>
			<td>AB Sciex</td>
			<td>608010</td>
			<td>For automated fragment analyses.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sequenzer - CEQ8000 Genetic Analysis System</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>NA</td>
			<td>For automated fragment analyses.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneMarker V1.95</td>
			<td>Softgenetics</td>
			<td>NA</td>
			<td>To analyze results of automated fragment analyses.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

laboratory protocol for genetic gut content analyses of aquatic macroinvertebrates using group-specific rdna primers

Analysere næringskjeder er avgjørende for en bedre forståelse av økosystemene. For eksempel kan næringskjeden interaksjoner gjennomgå alvorlige endringer forårsaket av invasjonen av ikke-stedegne arter. Men er en nøyaktig identifikasjon av feltet predator-byttedyr interaksjoner vanskelig i mange tilfeller. Disse analysene er ofte basert på en visuell vurdering av tarmen innhold eller analyse av stabil isotop prosenter (ses15N og ses13C). Slike metoder krever omfattende kunnskap om, henholdsvis morfologiske mangfold eller isotopanrikning signatur fra personlige byttedyr organismer, fører til hindringer i nøyaktig identifikasjon av byttedyr organismer. Visuelle gut innhold analyser undervurdere spesielt myk bodied byttedyr organismer, fordi maserasjon, fordøyelse og fordøyelse av byttedyr gjøre identifikasjon av spesifikk arter vanskelig. Derfor polymerase kjedereaksjon (PCR) basert strategier, for eksempel bruk av gruppespesifikke primer sett, gir et kraftig verktøy for etterforskningen av næringskjeden interaksjoner. Her beskriver vi detaljerte protokoller for å undersøke gut innholdet macroinvertebrate forbrukere fra feltet bruker gruppespesifikke primer sett for kjernefysisk ribosomal deoksyribonukleinsyre (rDNA). DNA kan være Hentet fra hele eksemplarer (i tilfelle av små taxa) eller fra tarmen innholdet av samlet i feltet. Tilstedeværelse og funksjonelle effektivitet DNA malene må bekreftes direkte fra den testede enkelt bruker universell primer sett målretting den respektive delenhet i DNA. Vi viser også at brukte byttedyr kan bestemmes videre til arter nivå via PCR med uforandret gruppespesifikke primere kombinert med påfølgende enkelt tråd konformasjon polymorfisme (SSCP) analyser bruker polyakrylamid gels. Videre viser vi at bruk av ulike fluorescerende fargestoffer som etiketter kan parallelle screening for DNA fragmenter av ulike byttedyr grupper fra flere gut innhold prøver via automatisert fragment analyse.

Vi brukt trinnene som beskrives i denne protokollen for diett analyser i forskjellige studier. I denne delen presenterer vi eksempler som beskriver anvendelse av de forskjellige delene av protokollen.
Som et eksempel for å demonstrere effektiviteten av gruppespesifikke primer sett av forfattere28 og potensialet for videre nedstrøms analyser av PCR produkter av SSCP analyser, ble en fôring eksperimentet...

Watch this Scientific Journal Video about Laboratory Protocol for Genetic Gut Content Analyses of Aquatic Macroinvertebrates Using Group-specific rDNA Primers at JoVE.com

Laboratory Protocol for Genetic Gut Content Analyses of Aquatic Macroinvertebrates Using Group-specific rDNA Primers

Vanligste gut innhold analyser av macroinvertebrates er visuelle. Krever intens kunnskap om morfologiske mangfold av byttedyr organismer, de savner myk bodied byttedyr og på grunn av sterk comminution av byttedyr, er nesten umulig for noen organismer, inkludert amfipoder. Vi gir detaljert, romanen genetiske metoder for macroinvertebrate byttedyr identifikasjon i kostholdet av amfipoder.

Laboratoriet protokoll for genetisk Gut innhold analyser av akvatiske Macroinvertebrates bruke gruppe-spesifikke rDNA primere

Analyzing food webs is essential for a better understanding of ecosystems. For example, food web interactions can undergo severe changes caused by the ...

Research

JoVE Journal

Biology

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture)

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo New Culture

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

Genetic Studies of Human DNA Repair Proteins Using Yeast as a Model System 

Understanding the roles of human DNA repair proteins in genetic pathways is a formidable challenge to many researchers.  Genetic studies in mammalian ...

DNA Extraction from Paraffin Embedded Material for Genetic and Epigenetic Analyses

Disease development and progression are characterized by frequent genetic and epigenetic aberrations including chromosomal rearrangements, copy number ...

Evisceration of Mouse Vitreous and Retina for Proteomic Analyses

While the mouse retina has emerged as an important genetic model for inherited retinal disease, the mouse vitreous remains to be explored. The vitreous is ...

Generation of Human Cardiomyocytes: A Differentiation Protocol from Feeder-free Human Induced Pluripotent Stem Cells

Generation of Human Cardiomyocytes: En Differensiering Protokoll fra mater-frie menneskeskapte pluripotent stamceller

In order to investigate the events driving heart development and to determine the molecular mechanisms leading to myocardial diseases in humans, it is ...

DNA Electroporation, Isolation and Imaging of Myofibers

DNA Electroporation, Isolering og Imaging av Myofibers

Mature muscle has a unique structure that is amenable to live cell imaging. Herein, we describe the experimental protocol for expressing fluorescently ...

Cellular Redox Profiling Using High-content Microscopy

Cellular Redox Profiling ved hjelp av høy innholdsmikroskopi

Reactive oxygen species (ROS) regulate essential cellular processes including gene expression, migration, differentiation and proliferation. However, ...