Name: laboratory protocol for genetic gut content analyses of aquatic macroinvertebrates using group-specific rdna primers
Uploaded: 2017-10-05T12:55:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Laboratory Protocol for Genetic Gut Content Analyses of Aquatic Macroinvertebrates Using Group-specific rDNA Primers at JoVE.com

Agradecemos a Silke Classen do Instituto de pesquisa para análise do ecossistema e avaliação (gaiac), RWTH Aachen pela sua assistência no estabelecimento dos conjuntos específicos de grupo primário usado neste protocolo. Agradecemos também Peter Martin e Laura Schynawa da Universidade de Kiel para a cooperação em experimentos dos ácaros da água. Agradecemos também os assistentes de laboratório técnico para manutenção de laboratório funcionando sem problemas e preparar o registo das empresas e números de catálogo. Este trabalho foi financiado pela Fundação de pesquisa alemã (DFG; projeto GE 2219/3-1).

1. coleta de macroinvertebrados do campo e preparar as amostras para análises de conteúdo genético Gut.
<ol><li>Coleta de macroinvertebrados em cada local, resolver indivíduos da espécie de consumidores de interesse nos tubos simples e diretamente, congelá-los em nitrogênio líquido ou gelo seco para evitar afastamento do intestino e degradação do DNA. 
	Nota: Evite armazenar as amostras em álcool, porque alguns macroinvertebrados tendem a regurgitar antes o álcool mata-los.</li>
	<li>Use somen...

<ol>
	<li>Carreon-Martinez, L., Heath, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revolution+in+food+web+analysis+and+trophic+ecology:+diet+analysis+by+DNA+and+stable+isotope+analysis.">Revolution in food web analysis and trophic ecology: diet analysis by DNA and stable isotope analysis.</a> Mol Ecol. 9 (1), 25-27 (2010).</li><li>Hardy, C. M., Krull, E. S., Hartley, D. M., Oliver, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carbon+source+accounting+for+fish+using+combined+DNA+and+stable+isotope+analyses+in+a+regulated+lowland+river+weir+pool.">Carbon source accounting for fish using combined DNA and stable isotope analyses in a regulated lowland river weir pool.</a> Mol Ecol. 19 (1), 197-212 (2010).</li><li>Baxter, C. V., Fausch, K. D., Saunders, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tangled+webs:+reciprocal+flows+of+invertebrate+prey+link+streams+and+riparian+zones.">Tangled webs: reciprocal flows of invertebrate prey link streams and riparian zones.</a> Freshwater Biol. 50 (2), 201-220 (2005).</li><li>Baxter, C. V., Fausch, K. D., Murakami, M., Chapman, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fish+invasion+restructures+stream+and+forest+food+webs+by+interrupting+reciprocal+prey+subsidies.">Fish invasion restructures stream and forest food webs by interrupting reciprocal prey subsidies.</a> Ecol. 85 (10), 2656-2663 (2004).</li><li>Traugott, M., Kamenova, S., Ruess, L., Seeber, J., Plantegenest, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Empirically+Characterising+Trophic+Networks:+What+Emerging+DNA-Based+Methods,+Stable+Isotope+and+Fatty+Acid+Analyses+Can+Offer.">Empirically Characterising Trophic Networks: What Emerging DNA-Based Methods, Stable Isotope and Fatty Acid Analyses Can Offer.</a> Adv. Ecol. Res. Vol 49: Ecological Networks in an Agricultural World. 49, 177-224 (2013).</li><li>Diaz Arredondo, M. A., Guzman del Proo, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feeding+habits+of+the+spiny+lobster+(Panulirus+interruptus+Randall,+1840)+in+Bahia+Tortugas,+Baja+California+Sur.">Feeding habits of the spiny lobster (Panulirus interruptus Randall, 1840) in Bahia Tortugas, Baja California Sur.</a> Cienc Mar. 21 (4), 439-462 (1995).</li><li>Letourneur, Y., Galzin, R., Harmelin-Vivien, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+variations+in+the+diet+of+the+damselfish+Stegastes+nigricans+(Lacep&#232;de)+on+a+R&#233;union+fringing+reef.">Temporal variations in the diet of the damselfish Stegastes nigricans (Lacep&#232;de) on a R&#233;union fringing reef.</a> J Exp Mar Biol Ecol. 217 (1), 1-18 (1997).</li><li>Akin, S., Winemiller, K. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seasonal+variation+in+food+web+composition+and+structure+in+a+temperate+tidal+estuary.">Seasonal variation in food web composition and structure in a temperate tidal estuary.</a> Estuar Coast. 29 (4), 552-567 (2006).</li><li>Redd, K. S., Jarman, S. N., Frusher, S. D., Johnson, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+molecular+approach+to+identify+prey+of+the+southern+rock+lobster.">A molecular approach to identify prey of the southern rock lobster.</a> Bull Entomol Res. 98 (3), 233-238 (2008).</li><li>Gergs, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dreissena+polymorpha+in+Lake+Constance:+An+example+of+a+keystone+engineer?.">Dreissena polymorpha in Lake Constance: An example of a keystone engineer?.</a> Universit&#228;t Konstanz. , (2009).</li><li>Sheppard, S. K., Harwood, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+molecular+ecology:+tracking+trophic+links+through+predator-prey+food-webs.">Advances in molecular ecology: tracking trophic links through predator-prey food-webs.</a> Funct Ecol. 19 (5), 751-762 (2005).</li><li>Jarman, S. N., Ward, R. D., Elliott, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligonucleotide+primers+for+PCR+amplification+of+coelomate+introns.">Oligonucleotide primers for PCR amplification of coelomate introns.</a> Mar Biotechnol (NY). 4 (4), 347-355 (2002).</li><li>Verma, S. K., Singh, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+universal+primers+establish+identity+of+an+enormous+number+of+animal+species+for+forensic+application.">Novel universal primers establish identity of an enormous number of animal species for forensic application.</a> Mol Ecol Notes. 3 (1), 28-31 (2003).</li><li>Deagle, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+scatology+as+a+tool+to+study+diet:+analysis+of+prey+DNA+in+scats+from+captive+Steller+sea+lions.">Molecular scatology as a tool to study diet: analysis of prey DNA in scats from captive Steller sea lions.</a> Mol Ecol. 14 (6), 1831-1842 (2005).</li><li>Jarman, S. N., Deagle, B. E., Gales, N. 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W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+sensitive+is+PCR-SSCP?.">How sensitive is PCR-SSCP?.</a> Hum Mutat. 2 (5), 338-346 (1993).</li><li>Glava&#269;, D., Dean, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+the+single-strand+conformation+polymorphism+(SSCP)+technique+for+detection+of+point+mutations.">Optimization of the single-strand conformation polymorphism (SSCP) technique for detection of point mutations.</a> Hum Mutat. 2 (5), 404-414 (1993).</li><li>M&#252;lhardt, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Der Experimentator Molekularbiologie / Genomics. , (2013).</li><li>Lee, S. V., Bahaman, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discriminatory+Power+of+Agarose+Gel+Electrophoresis+in+DNA+Fragments+Analysis.">Discriminatory Power of Agarose Gel Electrophoresis in DNA Fragments Analysis.</a> Gel Electrophoresis - Principles and Basics. , (2012).</li><li>Wang, X. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+electrophoresis+technique+to+separate+microsatellite+alleles.">A new electrophoresis technique to separate microsatellite alleles.</a> Afr J Biotechnol. 8 (11), 2432-2436 (2009).</li><li>Gemmer, I., Gergs, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+first+twelve+microsatellite+loci+for+the+amphipod+Gammarus+roeselii+(Crustacea:+Amphipoda).">Characterization of the first twelve microsatellite loci for the amphipod Gammarus roeselii (Crustacea: Amphipoda).</a> Conserv Genet Resour. 5 (4), 955-957 (2013).</li><li>Olafsson, K., Hjorleifsdottir, S., Pampoulie, C., Hreggvidsson, G. O., Gudjonsson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+set+of+multiplex+assays+(SalPrint15)+for+efficient+analysis+of+15+microsatellite+loci+of+contemporary+samples+of+the+Atlantic+salmon+(Salmo+salar).">Novel set of multiplex assays (SalPrint15) for efficient analysis of 15 microsatellite loci of contemporary samples of the Atlantic salmon (Salmo salar).</a> Mol Ecol Resour. 10 (3), 533-537 (2010).</li><li>Baric, S., Hollrigl, A., Fureder, L., Petutschnig, J., Dalla Via, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=First+analysis+of+genetic+variability+in+Carinthian+populations+of+the+white-clawed+crayfish+Austropotamobius+pallipes.">First analysis of genetic variability in Carinthian populations of the white-clawed crayfish Austropotamobius pallipes.</a> Bull. Fr. Peche Piscicult. (380-381), 977-990 (2006).</li><li>Koester, M., Gergs, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=No+evidence+for+intraguild+predation+of+Dikerogammarus+villosus+(Sowinsky,+1894)+at+an+invasion+front+in+the+Untere+Lorze,+Switzerland.">No evidence for intraguild predation of Dikerogammarus villosus (Sowinsky, 1894) at an invasion front in the Untere Lorze, Switzerland.</a> Aquat Invasions. 9 (4), 489-497 (2014).</li><li>Sonnenberg, R., Nolte, A. W., Tautz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+evaluation+of+LSU+rDNA+D1-D2+sequences+for+their+use+in+species+identification.">An evaluation of LSU rDNA D1-D2 sequences for their use in species identification.</a> Front Zool. 4 (6), 6 (2007).</li><li>Koester, M., Bayer, B., Gergs, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+Dikerogammarus+villosus+(Crustacea,+Gammaridae)+a+'killer+shrimp'+in+the+River+Rhine+system?.">Is Dikerogammarus villosus (Crustacea, Gammaridae) a 'killer shrimp' in the River Rhine system?.</a> Hydrobiologia. 768 (1), 299-313 (2016).</li><li>Koester, M., Cla&#223;en, S., Gergs, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+group-specific+PCR+primers+for+the+identification+of+freshwater+macroinvertebrates.">Establishment of group-specific PCR primers for the identification of freshwater macroinvertebrates.</a> Conserv Genet Resour. 5 (4), 1091-1093 (2013).</li><li>Martin, P., Koester, M., Schynawa, L., Gergs, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=First+detection+of+prey+DNA+in+Hygrobates+fluviatilis+(Hydrachnidia,+Acari):+a+new+approach+for+determining+predator-prey+relationships+in+water+mites.">First detection of prey DNA in Hygrobates fluviatilis (Hydrachnidia, Acari): a new approach for determining predator-prey relationships in water mites.</a> Exp Appl Acarol. 67 (3), 373-380 (2015).</li><li>Deagle, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+Seabird+Diet+through+Genetic+Analysis+of+Faeces:+A+Case+Study+on+Macaroni+Penguins+(Eudyptes+chrysolophus).">Studying Seabird Diet through Genetic Analysis of Faeces: A Case Study on Macaroni Penguins (Eudyptes chrysolophus).</a> PLoS One. 2 (9), e831 (2007).</li><li>Sint, D., Niederklapfer, B., Kaufmann, R., Traugott, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Group-Specific+Multiplex+PCR+Detection+Systems+for+the+Identification+of+Flying+Insect+Prey.">Group-Specific Multiplex PCR Detection Systems for the Identification of Flying Insect Prey.</a> PLoS One. 9 (12), e115501 (2014).</li><li>Zarzoso-Lacoste, D., Corse, E., Vidal, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+PCR+detection+of+prey+in+molecular+diet+studies:+importance+of+group-specific+primer+set+selection+and+extraction+protocol+performances.">Improving PCR detection of prey in molecular diet studies: importance of group-specific primer set selection and extraction protocol performances.</a> Mol Ecol Resour. 13 (1), 117-127 (2013).</li><li>Vestheim, H., Jarman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blocking+primers+to+enhance+PCR+amplification+of+rare+sequences+in+mixed+samples+-+a+case+study+on+prey+DNA+in+Antarctic+krill+stomachs.">Blocking primers to enhance PCR amplification of rare sequences in mixed samples - a case study on prey DNA in Antarctic krill stomachs.</a> Front Zool. 5 (1), 12 (2008).</li><li>Harper, G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+screening+of+invertebrate+predators+for+multiple+prey+DNA+targets.">Rapid screening of invertebrate predators for multiple prey DNA targets.</a> Mol Ecol. 14 (3), 819-827 (2005).</li></ol>

Aqui, apresentamos um método fácil e custo-eficiente para determinação de PCR-baseados de interações predador-presa de amostras de campo através de cartilhas específicas do grupo para as regiões de rDNA, que podem ser combinadas com outras análises non-molecular dos mesmos espécimes. No entanto, existem várias etapas críticas dentro do protocolo. Em primeiro lugar, assegurando a especificidade dos primers usados é essencial. Em segundo lugar, é fundamental evitar contaminação e perda de material de conte...

Interações predador-presa, que constituem a maioria da comida da web dinâmica e interações tróficas, são aspectos fundamentais para caracterizar os fluxos de matéria e energia ao longo de teias de alimento dentro e entre os ecossistemas, o que é um dos principais objetivos da ecologia 1. a determinação da fonte e fluxo de carbono e nutrientes é promover a compreensão da conectividade ecológica entre ecossistemas2. No entanto, os ecossistemas, tais como rios e suas bacias hidrográficas, não estão ligados somente por fluxos de matéria orgânica e nutrientes, mas também pelos movimentos de organismos3. Assim, alterações de habitat, interrompendo o fluxo de recursos que associam esses sistemas podem fortemente alterar as teias alimentares de ambos os ecossistemas, não só diretamente, mas também indiretamente alterando a respectiva composição das comunidades de predador-presa. Por exemplo, alterações de teias alimentares foram mostradas para ser ligado aos movimentos de predador única espécie (por exemplo, truta arco-íris)4. Tais alterações potencialmente ameaçam a biodiversidade e o funcionamento dos ecossistemas aquáticos. Portanto, analisar interações predador-presa no campo é essencial para determinar o impacto das mudanças ambientais induzidas pelo homem, tais como as práticas de gestão de água, sobre a biodiversidade nativa dos ecossistemas aquáticos.
Desde ligações tróficas de rastreamento é difícil em sistemas complexos, várias abordagens foram estabelecidas que permitem a avaliação da alimentação interações no campo5. Tradicionalmente, as investigações de interações no campo de alimentação baseiam-se na identificação visual dos restos de presas nas entranhas dissecados e exigem um amplo conhecimento sobre diversidade morfológica presa. Análises de conteúdo Visual intestino forneceram introspecções na utilização dos recursos de vários grupos de consumidores (por exemplo, variação sazonal na dieta de lagosta peixe e6 7,8 ou alimentando preferências de copépodes). No entanto, o processo físico de digestão dificulta as análises de conteúdo visual do intestino e perde geralmente suave rapina encorpado-organismos9. Para a alimentação de espécies por ingestão de líquidos ou para alguns consumidores invertebrados que fragmentá intensamente sua comida antes de ingestão, como anfípodas, identificação visual das espécies de presas no conteúdo do intestino é impossível10. Devido a essas limitações, a análise molecular fornece uma alternativa promissora.
Análises moleculares tornaram-se uma ferramenta comum permitindo a deteção de presa rápida e precisa no conteúdo do intestino. A variedade de tais técnicas é diversa: estratégias baseadas em anticorpos monoclonais ou reacções em cadeia do polymerase (PCR) são frequentemente usadas, por causa de sua alta especificidade e sensibilidade11. O desenvolvimento de novos anticorpos monoclonais é demorada e de custo, portanto, a aplicação de outras técnicas moleculares é mais útil quando os anticorpos já não existem11. Outra abordagem comum é a amplificação das regiões do ácido desoxirribonucleico (DNA), como o ácido ribonucleico ribossômico (RNA) genes presentes na maioria das espécies, usando primer universal define12,13. Ao usar essa técnica, muitas vezes não é possível identificar toda a gama de organismos presas dentro de fontes mistas de DNA14. Uma abordagem eficaz para evitar tal uma desvantagem é usar primer grupo específico define para análises de conteúdo genético do intestino. Projetado para amplificar apenas as regiões de ADN de determinados grupos-alvo e excluir todas as outras espécies15,16, primers específicos de grupo possibilitam a identificação de organismos de rapina no nível taxonômico dos grupos especificados sem análises secundárias de tempo - e onerosos. No entanto, como todos estripá-análise de conteúdo, tais análises fornecem apenas um instantâneo do comportamento alimentar. Portanto, combinar as análises de conteúdo intestino molecular com análises de traçadores naturais-integração de tempo (por exemplo, isótopos estáveis) é considerado benéfico1,2.
Aqui, descrevemos um método detalhado de inquéritos baseados em PCR de interações predador-presa usando conjuntos de cartilha de grupo específicas para as regiões de ADN (rDNA) ribosomal nucleares deve ser combinada com análises de isótopos estáveis do mesmo espécime. Descrevemos a detecção de DNA de rapina única grupos através de eletroforese em gel de agarose. Além disso, apresentamos uma oportunidade para ainda mais a jusante análises de produtos PCR de tais primers específicos de grupo aplicáveis sempre que uma resolução taxonômica maior do que a especificidade dos primers é necessária. Porque o único encalhado DNA (ssDNA) fragmentos de conformações terciário de forma que são determinadas pela sua sequência primária17, pequenas variações em fragmentos amplificados por tais cartilhas específicas do grupo levam a mudanças conformacionais. Tais mudanças podem ser detectadas pelas análises de polimorfismo (SSCP) único filamento conformação com géis de poliacrilamida17,18, permitindo uma identificação mais precisa de organismos de presa (até ao nível de espécie).
Enquanto a eletroforese em gel de agarose é uma ferramenta comum e de baixo custo para visualizar os fragmentos de DNA e determinar seu comprimento aproximado19, a resolução depende da quantidade de DNA e o corante de coloração usado20. Geralmente, a visualização é direta quando se trabalha com amostras de DNA puras, mas potencialmente baixas quantidades de rapina DNA no conteúdo do intestino dos consumidores pode complicar a Pontuação dos resultados de eletroforese de gel de agarose. Ainda, esse método de deteção é viável para a tela de um baixo número de espécimes de consumidor do campo para um ou alguns grupos de presas, mas complicação o artilheiro faz a seleção de um número elevado de amostras para vários táxons de presas extremamente tempo intensivo e, portanto, impraticável. Um método de deteção mais sensível é a análise automatizada de fragmentos através de eletroforese capilar, que além disso permite a determinação do comprimento exato de fragmentos21. Vários microssatélites com base em estudos têm mostrado que usando diferentes corantes fluorescentes como rótulos, é possível detectar e determinar diferentes fragmentos de comprimento comparável por fragmento automatizado análise22,23, 24. Portanto, apresentamos também um protocolo detalhado para a deteção paralela do DNA de várias presas grupos usando PCR com rotulado primeira demão específicas do grupo de moda e deteção através de análise de fragmento automatizado com um sequenciador automático. Além disso, apresentamos os resultados de um estudo de caso, demonstrando que a detecção de DNA de presas através de análise automatizada de fragmento é uma abordagem que também permite uma quantificação relativa de presas ingeridas.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>liquid nitrogen</td>
			<td>Any</td>
			<td>NA</td>
			<td>For transport of field samples of macroinvertebrates to the laboratory.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 ml reaction tubes - Safelock</td>
			<td>Any</td>
			<td>NA</td>
			<td>For collection of consumer specimens in the field and subsequent conservation in liquid nitrogen reaction tubes do not necessarily need to be PCR clean. To avoid exploding of the tubes, the lid of the tubes should be punctured with a needle.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Any</td>
			<td>NA</td>
			<td>Make sure magnification is suitable to prepare the gastro-intestinaltract of the size of consumer of interest.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Any</td>
			<td>NA</td>
			<td>To dissect the gastro-intestinal tract of consumer specimens under the stereomikroscope.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel foceps: Dumont forceps No. 7</td>
			<td>Bioform</td>
			<td>B40d</td>
			<td>This curved stainless steel forceps can sometimes be very helful to hold specimen fixed inbetween the curved part without puncturing the gastro-intestinal tract.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel foceps: Dumont forceps Electronic No. 5</td>
			<td>Bioform</td>
			<td>B40b</td>
			<td>This fine stainless steel forceps is ideally suited for the preparation of the gastro-intestinal tract of consumer specimens.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA-ExitusPlus</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A7409,1000RF</td>
			<td>Decontamination solution for the removal of DNA and RNA contaminations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fuzz-free paper towel</td>
			<td>Any</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab scale</td>
			<td>Any</td>
			<td>NA</td>
			<td>Precision needs to be at least 0.01 g.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microlitre pipettes (0.5-10/10-100/50-200/100-1000 &#956;L)</td>
			<td>Any</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safe-Lock Tubes 2.0 ml</td>
			<td>VWR</td>
			<td>211-2165</td>
			<td>It is crucial that these raction tubes are free of DNA, DNase, RNase and PCR inhibitors (PCR clean)!</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safe-Lock Tubes 1.5 ml</td>
			<td>VWR</td>
			<td>211-2164</td>
			<td>It is crucial that these raction tubes are free of DNA, DNase, RNase and PCR inhibitors (PCR clean)!</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride &#8805;99.5%, p.a., ACS, ISO</td>
			<td>carlroth</td>
			<td>3957.3</td>
			<td>For salt extraction buffer (SEB) and 5M NaCl-solution required for extraction of DNA.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(hydroxymethyl)-aminomethane Tris</td>
			<td>carlroth</td>
			<td>4855.2</td>
			<td>For salt extraction buffer (SEB) and TBE buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microlitre pipettes (0.5-10/10-100/50-200/100-1000 &#956;L)</td>
			<td>carlroth</td>
			<td>8043.1</td>
			<td>For salt extraction buffer (SEB) and TBE buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric acid &#8805;99.8 %, p.a., ACS, ISO</td>
			<td>carlroth</td>
			<td>6943.2</td>
			<td>For TBE buffer. Not needed if commercialy available TBE buffer is obtained.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>carlroth</td>
			<td>4360.1</td>
			<td>For extraction of DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K lyophil.</td>
			<td>carlroth</td>
			<td>7528.1</td>
			<td>Prepare a working solution containing 10 mg/ml.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TissueLyser II</td>
			<td>Quiagen</td>
			<td>85300</td>
			<td>Bead mill for homogenization of the samples.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless Steel Beads, 5 mm</td>
			<td>Quiagen</td>
			<td>69989</td>
			<td>For homogenization of samples.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating Thermoshaker</td>
			<td>Any</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex Mixer</td>
			<td>Any</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated centrifuge: himac CT 15 RE</td>
			<td>Hitachi</td>
			<td>NA</td>
			<td>Refrigerated centrifuge used for centrifugation during the extraction of DNA (Protocol 1).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>carlroth</td>
			<td>6752.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 99.8 %, p.a.</td>
			<td>Any</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Molecular biology grade (ddH2O)</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A7398,1000</td>
			<td>nuclease-free (stream sterilized and DEPC treated) water used for re-suspension of DNA and whenever refered to ddH2O within the manuscript</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unmodified Olegonucleotides</td>
			<td>Eurofins MWG Operon</td>
			<td>NA</td>
			<td>Primers unlabeled</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Modified olegonucleotides</td>
			<td>Metabion International AG</td>
			<td>NA</td>
			<td>Primers labelled</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>peqGOLD Taq all inclusive</td>
			<td>VWR Peqlab</td>
			<td>01-1000</td>
			<td>Taq all inclusive for PCR reaction mixtures (reaction buffer Y and S, dNTPs and MgCl2)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primus 96 advanced gradient thermocycler or peqStar96x Universal Gradient</td>
			<td>Peqlab</td>
			<td>NA</td>
			<td>Primer sets were originally established on a Primus 96 advanced gradient thermocycler. As this cycler was quite old, we than checked if our primer sets are efficient and specific under the same conditions using the peqSta96x (which also could simulate the older model). However, tests showed that our primers work well and are still specific (see Koester et al. 2013) without using the simulation of the old machine.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard 96 Well PCR Plates</td>
			<td>VWR Peqlab</td>
			<td>732-2879</td>
			<td>Used for PCR reactions.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Profile Tube Stripes 0.15 ml with Flat Cap Stripes</td>
			<td>VWR Peqlab</td>
			<td>732-3223</td>
			<td>Cap stripes used to close the PCR plates.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Peqlab</td>
			<td>35-1020</td>
			<td>Used for gel electrophoresis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwave</td>
			<td>Any</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical flask</td>
			<td>Any</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Measuring cylinder</td>
			<td>Any</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horizontal electrophoresis unit and respective combs with teeth</td>
			<td>Any</td>
			<td>NA</td>
			<td>For agarose gel electrophoresis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis Power Supply PS3002</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium bromide solution 1 %</td>
			<td>carlroth</td>
			<td>2218.1</td>
			<td>Used to prepare staining bath for agarose gels.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formamide</td>
			<td>carlroth</td>
			<td>6749.1</td>
			<td>Needded for the denaturation buffer for SSCP analyses.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromphenol blue</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A3640.0010</td>
			<td>Needed for the loading dye for agarose gel electrophoresis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>carlroth</td>
			<td>4621.1</td>
			<td>Needed for the loading dye for agarose gel electrophoresis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 bp-DNA-Ladder extended</td>
			<td>carlroth</td>
			<td>T835.1</td>
			<td>As size standard for agarose gel electrophoresis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV-Documentation system</td>
			<td>Any</td>
			<td>NA</td>
			<td>To visualize gel electrophoresis results.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotiphorese NF-Acrylamide/Bis-solution 40 % (29:1)</td>
			<td>carlroth</td>
			<td>A121.1</td>
			<td>For the preparation of polyacrylamid gels.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium peroxydisulphate</td>
			<td>carlroth</td>
			<td>9592.2</td>
			<td>For the preparation of polyacrylamid gels.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>foldback clips (32 mm)</td>
			<td>Any</td>
			<td>NA</td>
			<td>For the preparation of polyacrylamid gels.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>square-shaped plastic box (21 &#215; 6.5 &#215; 5 cm)</td>
			<td>Any</td>
			<td>NA</td>
			<td>For the preparation of polyacrylamid gels.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td>
			<td>carlroth</td>
			<td>23.67.1</td>
			<td>For the preparation of polyacrylamid gels.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beaker</td>
			<td>Any</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RC 10 Digital chiller</td>
			<td>VWR</td>
			<td>462-0138</td>
			<td>For SSCP analyses using polyacrylamide gel electrophoresis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical electrophoresis unit P10DS (OWL Separation Systems)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>700-2361</td>
			<td>For SSCP analyses using polyacrylamide gel electrophoresis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Notched glass plate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>730-0261</td>
			<td>For SSCP analyses using polyacrylamide gel electrophoresis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blank glass plate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>730-0260</td>
			<td>For SSCP analyses using polyacrylamide gel electrophoresis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spacers</td>
			<td>VWR</td>
			<td>730-0262</td>
			<td>For SSCP analyses using polyacrylamide gel electrophoresis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Comb with 25 teeth</td>
			<td>VWR</td>
			<td>730-0294</td>
			<td>For SSCP analyses using polyacrylamide gel electrophoresis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking platform</td>
			<td>Any</td>
			<td>NA</td>
			<td>For constant shaking of the staining bath.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GelStar Nucleic Acid Stain (Lonza Rockland, Inc.)</td>
			<td>Biozym</td>
			<td>850535 (50535)</td>
			<td>For staining of polyacrylamide gels.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenomeLab DNA Size Standard Kit 400bp</td>
			<td>AB Sciex</td>
			<td>608098</td>
			<td>For automated fragment analyses. Size stanard for Batch B.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenomeLab DNA Size Standard Kit 600bp</td>
			<td>AB Sciex</td>
			<td>608095</td>
			<td>For automated fragment analyses. Size stanard for Batch A.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample Loading Solution (SLS)</td>
			<td>AB Sciex</td>
			<td>608082</td>
			<td>For automated fragment analyses.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sequenzing plate - 96 Well Polypropylene PCR Microplate</td>
			<td>Costar</td>
			<td>6551</td>
			<td>For automated fragment analyses.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate centrifuge, PerfectSpin P</td>
			<td>VWR Peqlab</td>
			<td>NA</td>
			<td>mini plate centrifuge used to spin down PCR products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer plate - 96 Well EIA/RIA Clear Flat Bottom Polystyrene Not Treated Microplate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>9017</td>
			<td>For automated fragment analyses.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenomeLab Seperation buffer</td>
			<td>AB Sciex</td>
			<td>608012</td>
			<td>For automated fragment analyses.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Separation Gel - LPAI</td>
			<td>AB Sciex</td>
			<td>608010</td>
			<td>For automated fragment analyses.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sequenzer - CEQ8000 Genetic Analysis System</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>NA</td>
			<td>For automated fragment analyses.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneMarker V1.95</td>
			<td>Softgenetics</td>
			<td>NA</td>
			<td>To analyze results of automated fragment analyses.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

laboratory protocol for genetic gut content analyses of aquatic macroinvertebrates using group-specific rdna primers

Analisar tróficas é essencial para uma melhor compreensão dos ecossistemas. Por exemplo, comida web interações podem sofrer graves alterações causadas pela invasão de espécies não-nativas. No entanto, a identificação exata das interações predador-presa de campo é difícil em muitos casos. Essas análises são frequentemente baseadas em uma avaliação visual do conteúdo do intestino ou a análise de isótopos estáveis (δ15N e δ13C). Esses métodos exigem conhecimento abrangente sobre, respectivamente, diversidade morfológica ou assinatura isotópica de organismos individuais presas, levando a obstáculos na identificação exata dos organismos de rapina. Análises de conteúdo Visual intestino especialmente subestime organismos suave rapina encorpado, porque maceração, ingestão e digestão de presas organismos dificultam a identificação de espécies específicas. Portanto, estratégias de reação em cadeia (PCR) com base de polimerase, por exemplo o uso de primer grupo específico define, fornecer uma ferramenta poderosa para a investigação de interações web de comida. Aqui, descrevemos protocolos detalhados para investigar o conteúdo do intestino dos consumidores de macroinvertebrados do campo usando conjuntos específicos de grupo primário para ácido desoxirribonucleico de ribosomal nuclear (rDNA). DNA pode ser extraído a partir de espécimes inteiro (no caso de pequenos táxons) ou do conteúdo do intestino de espécimes coletados no campo. Presença e eficiência funcional dos modelos de DNA precisam ser confirmada diretamente do indivíduo testado usar primer universal define visando a respectiva subunidade de DNA. Também demonstramos que presa consumida pode ser determinada mais para baixo ao nível de espécie através de PCR com primers de grupo específicas sem modificações combinadas com análises de polimorfismo (SSCP) conformação subsequente único fio usando géis de poliacrilamida. Além disso, mostramos que o uso de corantes fluorescentes diferentes como rótulos permite rastreio paralelo de fragmentos de DNA de presas diferentes grupos de várias amostras de conteúdo intestino através de análise automatizada de fragmento.

Usamos com sucesso as etapas descritas neste protocolo para análises de dieta dentro de diferentes estudos. Nesta seção, apresentamos exemplos descrevendo a aplicabilidade das diferentes secções do protocolo.
Por exemplo, para demonstrar a eficácia dos conjuntos específicos de grupo primário estabelecido pelos autores28 e o potencial de mais a jusante as análises de produtos PCR por análises SSC...

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Laboratory Protocol for Genetic Gut Content Analyses of Aquatic Macroinvertebrates Using Group-specific rDNA Primers

Análises de conteúdo de intestino mais comuns de macroinvertebrados são visuais. Exigindo intenso conhecimento sobre diversidade morfológica de organismos de presas, eles falta suave rapina encorpada e, devido à forte cominuição de rapina, são quase impossíveis para alguns organismos, incluindo anfípodes. Nós fornecemos abordagens genéticas detalhadas, a novela de macroinvertebrados presas identificação na dieta de anfípodes.

Protocolo do laboratório para análises genéticas de conteúdo intestino de rDNA usando de macroinvertebrados aquáticos grupo-específicos Primers

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