Name: stereotactic atlas-guided laser capture microdissection of brain regions affected by traumatic injury
Uploaded: 2017-09-11T15:00:00
Duration: 9 min 29 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Stereotactic Atlas-Guided Laser Capture Microdissection of Brain Regions Affected by Traumatic Injury at JoVE.com

Vi ønsker å erkjenne Elizabeth Sumner for hennes hjelp til å redigere dette manuskriptet. Finansiering for dette prosjektet mottok delvis av Moody Project for Traumatisk Brain skader translasjonsforskning og RO1NS052532 klart å etablere.

Merk: alle dyreforsøk godkjent av institusjonelle Animal Care og bruk komiteen ved University of Texas Medical Branch, Galveston, Texas som anvist av nasjonale institutter for helse Guide og bruk av Forsøksdyr (8nde Edition, National Forskningsrådet).
 1. vev innsamling, regionen identifikasjon og Sectioning <ol><li>emnet voksen hann, Sprague-Dawley rotter, omtrent seks uker gammel og 250-300 g, for eksperimentell væske perkusjon skade, som beskrevet i Shimamura et al. 4.</li> <li>tjuefire timer etter eksperimentelle TBI, Human avlive dyrene ved å plassere dem i et kammer med en isoflurane konsentrasjon på 4% til dypt anesthetized. Sikre døden ved halshogging avgiftsdirektoratet hjernen og umiddelbart fryse i pulverisert tørris. Butikken frossen hjerner i-80 ° C fryser før snitting.</li>
	<li>Før noen LCM prosedyren som inkluderer transcriptional analyse, Rengjør alle flater med RNase eliminere vaskemiddel for å redusere risikoen for forurensning og RNA fornedrelse. 
	Merknad: Denne rengjøring inneholder området som brukes til farging, kryostaten der vev er delt, og området rundt LCM enheten.</li>
	<li>Hente hjernevevet fra lagring og sted i en kryostaten kjølt ned til -20 ° C. Tillat hjernen til equilibrate til temperaturen i kryostatkammeret i ~ 10 min.</li>
	<li>Plasser på hjernen ventral side opp på en gasbind på kryostaten scenen. Med en ren, RNase-fri barberblad, kuttet av den bakre delen bare rostral til lillehjernen (kan lagres eller forkastet) og delen bare anterior optikk chiasm (och).</li>
	<li>Plasser en liten mengde optimal kutte temperatur (OCT) medium i to separate cryomolds. Plass hjernen (som inneholder frontal association cortex (FrA) og nucleus accumbens kjernen (AcbC)) i cryomolds fremre siden ned. Legg nok OCT medium dekke vevet.
	<ol><li>Gjenta dette trinnet med hjernevev inneholder hippocampus (Hp) og suprachiasmatic kjernen (SCN).</li>
		<li>Tillate OCT mediet fryse helt for ~ 20 min i kryostaten.</li>
	</ol></li> <li>Når den vev og OCT medium er helt frosset, presse litt OCT på en montering leder og trykk den frosne cryomolds som inneholder vev på montering hodet. Tillate Tilpasningsverktøy for Office til å fryse helt slik at mold som inneholder vevet er godt festet til hodet.</li>
	<li>Sikre hodet vedlegget til snitting mount og skru til skruen. Justere cutting vinkel i forhold til kryostaten bladet med justering spakene å sikre inndelinger er kuttet jevnt.</li>
	<li>Angi snittykkelsen 30 µm. Ved snitting vev blokken som inneholder FrA og AcbC, først begynner snitting til hjernebarken er tydelig og deretter starte innsamling.</li>
	<li>Under henvisning til rotte hjernen Atlas 12, delen og samle hjernen delene av forsiktig plassere romtemperatur polyetylen napthalate (PENN) membran lysbilder på appa vev for FrA til sekundære motorisk cortex (M2 ) nås på Bregma 5,16 mm.
	<ol><li>Visuelt sikrer at slide ved inspeksjon hvis vev og OCT er helt smeltet på lysbildet. Lagre alle lysbildene med vev seksjoner i kryostaten til farging.</li>
	</ol></li> <li>Fortsette snitting til den fremre commissure (aca) blir synlige og forener i en fullstendig commissure under de nå tilsynelatende sideventriklene (LV) på Bregma 1,80 mm.</li>
	<li>Samle deler til LVs vises koble med aca på Bregma 0.84 mm.</li>
	<li>Når snitting for FrA og AcbC er fullført, fjerne montert vev blokken, og erstatte med blokken med HP og SCN.</li>
	<li>Delen før och slås på Bregma-0.48 mm, når den tredje ventrikkel (3V) blir tydelig.</li>
	<li>Samle deler for SCN fra dette punktet før Bregma-0.72 mm supraoptic decussation (sox) begynner. 
	Merk: Det kan være nødvendig å samle flere vev inndelinger i hele och som SCN er enkelt forbigått.</li>
	<li>For HP samling, delen til hornene av granule celle lag dentate gyrus (GrDG) er tydelig tydelig i Bregma-3.00 mm.</li>
	<li>Samle delene til hippocampus CA underfelt er smeltet i framskaffet ved Bregma-4.78 mm. Denne detaljen gir komplett samling av hippocampus under området craniotomy og skaden. 
	Merk: Som vist i forrige publikasjonen fra denne lab, mest skadet celler blir tydelig innen denne rekkevidden og egner seg for genet eller microRNA uttrykk analyse.</li>
</ol> 2. Farging protokollen <ol><li>før til farging, vask alle servise og flekker området i kjemisk avtrekksvifte med RNase-eliminere vaskemiddel. Dette preparatet begrenser risikoen for RNA degradering grunnet forurensning.</li>
	<li>Forberede alle flekker reagenser og løsninger i nuclease gratis vann.</li>
	<li>Ta et rack av lysbilder lagret i kryostaten og plass i avtrekksvifte. Tillate lysbilder å varme for 30 s. sted dem til farging løsninger (forberedt med nuclease kostnadsfritt vann) som følger: 75% EtOH for 1 min, nuclease gratis vann for 1 min, 1% cresyl violet for 1 min, nuclease gratis vann for 30 s, nuclease gratis vann for 30 s , 95% EtOH for 30 s, 100% EtOH for 30 s, xylen for 3 min og xylen for 3 min.</li>
	<li>Tillat stativet til air-dry for mer enn 10 min ved romtemperatur i avtrekksvifte. Alternativt sted stativer i en Rnase-gratis vakuum desiccator for raskere tørking. Når tørket, fortsette umiddelbart å LCM.</li>
</ol> 3. Stereotactic Atlas guidet Laser fange Microdissection med MFM systemet <ol><li>før begynnelsen noen LCM prosedyre for RNA analyse, tørke ned området samling og området rundt enheten med RNase-eliminere vaskemiddel og 100% EtOH.</li>
	<li>Vend strømbryteren på IR laser genererer enheten før du slår på mikroskopet base, og la systemet starte før programvaren startes fra skrivebordet. 
	Merk: Hvis ikke er fullført i denne rekkefølgen, programvaren gjenkjenner ikke mikroskopet.</li>
	<li>Når programvaren har startet og kjøre gjennom initialisering av trinnene, trykk på &#34; nåværende stadiet &#34; knappen i programvaren &#34; Setup Kontrollpanel. &#34; modulære scenen flyttes til posisjonen der MFM makro Caps og lysbilder kan lastes inn og lastet.</li>
	<li>Plasserer pennen membran lysbildene i innehaverne (opptil tre samtidig) med frostet kanten mot høyre. 
	Merk: Hvis abonnenten i feil retning, programvaren kanskje ikke skikkelig anerkjenner den ønskede IR eller UV klippeområdet.</li>
	<li>Klikk på &#34; Mem &#34; sjekkheftet inne det &#34; Cap og håndtering lysbildeområdet &#34; ved siden av respektive lysbildet (dvs., A, B eller C). Dette trinnet angir Hvis lysbildet er en membran objektglass. Klikk på ønsket lysbildet overføres først.</li>
	<li>å gjøre kameraet tar et flislagt bilde for vev sted og retningen for cap plasseringer, Velg &#34; bildet &#34; på verktøylinjen og velg &#34; anskaffe oversikt. &#34; 
	Merk: Hvis du er kjent med vevet samles, dette trinnet kan utelates ved manuell rullekulen til å plassere den &#34; regionen Center &#34; for samlingen.</li>
	<li>Plasser markøren over området på fliser bilde (eller relativ plassering uten fliser bilde), høyreklikk og velg &#34; sted Cap på regionen Center. &#34; programvaren vil automatisk plassere en cap over den valgte stillingen.</li>
	<li>Velge en plassering. 
	Merk: IR laser er riktig justert og henter bare områder hvor stedene er lagt ved programvaren at det må være plassert før du fortsetter.
	<ol>
		<li>Flytter til et område i hetten hvor ingen vev er tilstede. Klikk &#34; jeg &#34; i den &#34; Microdissect verktøy-panelet &#34; og den &#34; IR finne &#34; kategorien. Fra ruten brann en IR test skudd for å vurdere hvor IR laser skyting og størrelsen på stedet.</li>
		<li>Med markøren, Høyreklikk i IR spot og velg &#34; finner sted på IR. &#34; 
		Merk: Størrelse og intensitet av IR strålen kan endres ved å manuelt endre det &#34; makt, Diameter eller varighet &#34; under hver størrelsen betegnelse eller ved at glideskala nederst i dialogboksen. Flere prøvebilder må sparken for å sikre riktig størrelsen. IR laser må være re beliggenhet hver gang plasseringen av cap endringer eller lysbilder endres.</li>
		<li>For UV skjæring, finne UV laser ved å velge den &#34; UV finne &#34; kategorien i dialogboksen. 
		Merk: Fordi UV laser og IR laser beveger seg i samklang, det er ikke nødvendig å stadig finne igjen UV laser hver gang plasseringen endres.</li>
	</ol></li> <li>Velg den &#34; Frihånd &#34; alternativ i den &#34; Velg verktøy ruten &#34;. Bruke en berøringsskjerm pekepennen, trekke rundt perimeteren av området rundt samtidig sørge for ikke å miste kontakt mellom berøringsskjermen og hodet pekepennen. Sørg for å koble begynnelsen og end-meningene sammen. 
	Merk: IR flekker være fastsatt automatisk gjennom programvaren, men brukeren kan velge å legge ned flere steder å sikre vevet er overholdt cap etter UV kutte er utført.</li>
	<li>For FrA samling, utføre en brutto laser fangst av kortikale vev til når M2 cortex vises på Bregma 5,16 mm. 
	Merk: Disse detaljene kan endres slik at bare bestemte deler av FrA eller spesifikke celletyper samles.</li>
	<li>For AcbC samling, laser fange et område tett i nærhet til aca. 
	Kjernen og skall av AcbC utføre forskjellige funksjoner og unike fysiologisk. Derfor er det viktig å følge hjernen atlas så nær som mulig. Det anbefales å samle fra lenger forbi bregma 0.84 mm, som to delområder blitt for nært knyttet til hverandre.</li>
	<li>For Hp samling, laser fange den CA 1, 2 og 3 hippocampus underfelt starter på Bregma 3.00 mm og bruker den fullstendig dannet GrDG som et fysisk landemerke for morfologiske identifikasjon. 
	Merk: Ved anvendelsen av denne studien, samle ikke forbi Bregma-4.78 mm, som kan være visuelt grenser som når Hp underfelt er smeltet og velg ventrally. Dette området ble valgt som mest skadet neurons kan bli oppdaget under skade nettstedet 6.</li>
	<li>For SCN samling, først visuelt identify tettpakkede kjerner som sitter rygg å och og deretter samle.</li>
	<li>Etter samling av regioner (nevnt ovenfor), flytte MFM makro Caps å det &#34; QC posisjon &#34; og kontroller for komplett vev overholdelse ved visuelt UV kuttet vev er knyttet til membranen. Raskt plassere cap ontoan RNase-fri 0,5 mL tynne vegger reaksjon rør som inneholder 100 µL av cellen lyseringsbuffer.</li>
	<li>Vortex prøver kort å sikre fullstendig lyse og lagre på-80 ° C. Foreløpig LCM kan pauses og prøver lagret inntil brukes for nedstrøms genomisk analyse 6.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Bota, M., Dong, H. W., Swanson, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+gene+networks+to+brain+networks.">From gene networks to brain networks.</a> Nat. Neurosci. 6 (8), 795-799 (2003).</li><li>Mills, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unique+transcriptome+patterns+of+the+white+and+grey+matter+corroborate+structural+and+functional+heterogeneity+in+the+human+frontal+lobe.">Unique transcriptome patterns of the white and grey matter corroborate structural and functional heterogeneity in the human frontal lobe.</a> PLoS One. 8 (10), e78480 (2013).</li><li>Doppenberg, E. M., Choi, S. C., Bullock, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+trials+in+traumatic+brain+injury:+lessons+for+the+future.">Clinical trials in traumatic brain injury: lessons for the future.</a> J Neurosurg Anesthesiol. 16 (1), 87-94 (2004).</li><li>Shimamura, M., Garcia, J. M., Prough, D. S., Hellmich, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection+and+analysis+of+amplified+antisense+RNA+from+distinct+cell+populations+of+the+young+and+aged+rat+brain:+effect+of+traumatic+brain+injury+on+hippocampal+gene+expression.">Laser capture microdissection and analysis of amplified antisense RNA from distinct cell populations of the young and aged rat brain: effect of traumatic brain injury on hippocampal gene expression.</a> Mol Brain Res. 122 (1), 47-61 (2004).</li><li>Bast, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+an+integrative+perspective+on+hippocampal+function:+from+the+rapid+encoding+of+experience+to+adaptive+behavior.">Toward an integrative perspective on hippocampal function: from the rapid encoding of experience to adaptive behavior.</a> Rev Neurosci. 18 (3-4), 253-281 (2007).</li><li>Rojo, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+stochastic+gene+expression+on+the+cell+survival+rheostat+after+traumatic+brain+injury.">Influence of stochastic gene expression on the cell survival rheostat after traumatic brain injury.</a> PLoS.One. 6 (8), e23111 (2011).</li><li>Shah, S. A., Prough, D. S., Garcia, J. M., DeWitt, D. S., Hellmich, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+correlates+of+age-specific+responses+to+traumatic+brain+injury+in+mice.">Molecular correlates of age-specific responses to traumatic brain injury in mice.</a> Exp Gerontol. 41 (11), 1201-1205 (2006).</li><li>Shearer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochastic+fluctuations+in+gene+expression+in+aging+hippocampal+neurons+could+be+exacerbated+by+traumatic+brain+injury.">Stochastic fluctuations in gene expression in aging hippocampal neurons could be exacerbated by traumatic brain injury.</a> Aging Clin.Exp.Res. 28 (2), 363-367 (2015).</li><li>Caeyenberghs, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+structural+networks+and+executive+deficits+in+traumatic+brain+injury+patients.">Altered structural networks and executive deficits in traumatic brain injury patients.</a> Brain Struct.Funct. 219 (1), 193-209 (2014).</li><li>Bewernick, B. H., Kayser, S., Sturm, V., Schlaepfer, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+effects+of+nucleus+accumbens+deep+brain+stimulation+in+treatment-resistant+depression:+evidence+for+sustained+efficacy.">Long-term effects of nucleus accumbens deep brain stimulation in treatment-resistant depression: evidence for sustained efficacy.</a> Neuropsychopharmacology. 37 (9), 1975-1985 (2012).</li><li>Karatsoreos, I. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Circadian+Disruption+on+Mental+and+Physical+Health.">Effects of Circadian Disruption on Mental and Physical Health.</a> Curr.Neurol.Neurosci Rep. 12 (2), 218-225 (2012).</li><li>Drexel, M., Puhakka, N., Kirchmair, E., H&#246;rtnagl, H., Pitk&#228;nen, A., Sperk, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+GABA+receptor+subunits+in+the+hippocampus+and+thalamus+after+experimental+traumatic+brain+injury.">Expression of GABA receptor subunits in the hippocampus and thalamus after experimental traumatic brain injury.</a> Neuropharmacology. 88, 122-133 (2015).</li><li>Huusko, N., Pitkanen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parvalbumin+immunoreactivity+and+expression+of+GABAA+receptor+subunits+in+the+thalamus+after+experimental+TBI.">Parvalbumin immunoreactivity and expression of GABAA receptor subunits in the thalamus after experimental TBI.</a> Neuroscience. 267, 30-45 (2014).</li><li>Paxinos, G., Watson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The rat brain in stereotaxic coordinates. , (2013).</li><li>Boone, D. R., Sell, S. L., Hellmich, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection+of+enriched+populations+of+neurons+or+single+neurons+for+gene+expression+analysis+after+traumatic+brain+injury.">Laser capture microdissection of enriched populations of neurons or single neurons for gene expression analysis after traumatic brain injury.</a> Journal of Visualized Experiments. (74), 1-7 (2012).</li><li>Hellmich, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathway+analysis+reveals+common+pro-survival+mechanisms+of+metyrapone+and+carbenoxolone+after+traumatic+brain+injury.">Pathway analysis reveals common pro-survival mechanisms of metyrapone and carbenoxolone after traumatic brain injury.</a> PLoS.One. 8 (1), e53230 (2013).</li><li>Boone, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathway-focused+PCR+array+profiling+of+enriched+populations+of+laser+capture+microdissected+hippocampal+cells+after+traumatic+brain+injury.">Pathway-focused PCR array profiling of enriched populations of laser capture microdissected hippocampal cells after traumatic brain injury.</a> PLoS.One. 10 (5), e0127287 (2015).</li><li>Boone, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traumatic+Brain+Injury-induced+Dysregulation+of+the+Circadian+Clock.">Traumatic Brain Injury-induced Dysregulation of the Circadian Clock.</a> PLoS.One. 7 (10), e46204 (2012).</li><li>Truettner, J. S., Motti, D., Dietrich, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+overexpression+increases+cortical+neuronal+vulnerability+to+injury.">MicroRNA overexpression increases cortical neuronal vulnerability to injury.</a> Brain Res. 1533, 122-130 (2013).</li><li>Hellmich, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traumatic+brain+injury+and+hemorrhagic+hypotension+suppress+neuroprotective+gene+expression+in+injured+hippocampal+neurons.">Traumatic brain injury and hemorrhagic hypotension suppress neuroprotective gene expression in injured hippocampal neurons.</a> Anesthesiology. 102 (4), 806-814 (2005).</li><li>Ginsberg, S. D., Alldred, M. J., Che, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+levels+assessed+by+CA1+pyramidal+neuron+and+regional+hippocampal+dissections+in+Alzheimer's+disease.">Gene expression levels assessed by CA1 pyramidal neuron and regional hippocampal dissections in Alzheimer's disease.</a> Neurobiol.Dis. 45 (1), 99-107 (2012).</li><li>Elstner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+analysis+of+dopaminergic+neurons+in+Parkinson's+disease+and+aging+links+transcriptional+dysregulation+of+energy+metabolism+to+cell+death.">Expression analysis of dopaminergic neurons in Parkinson's disease and aging links transcriptional dysregulation of energy metabolism to cell death.</a> Acta Neuropathol. 122 (1), 75-86 (2011).</li><li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improvement+of+tissue+preparation+for+laser+capture+microdissection:+application+for+cell+type-specific+miRNA+expression+profiling+in+colorectal+tumors.">Improvement of tissue preparation for laser capture microdissection: application for cell type-specific miRNA expression profiling in colorectal tumors.</a> BMC.Genomics. 11, 163 (2010).</li></ol>

Forfatterne ikke avsløre.

Molekylære studier av pattedyr hjernen, har LCM blitt en viktig teknikk. Denne artikkelen viser at med kombinasjonen av de IR og UV kutte lasere i LCM systemet kan fange genomisk endringer i en region av pattedyr hjernen. Disse områdene omfatter de identifiserbar med konvensjonelle LCM-kompatible flekker, som cresyl fiolett eller hematoxylin og eosin. Hastigheten på laser-fangst prosessen og evne til å utføre LCM på tykkere 30 µm deler på pennen membran lysbilder kan ikke bare hente tilstrekkelige mengder av cellen prøver, men også å isolere RNA fra LCM prøver av egnet kvalitet for alle typer nedstrøms genomic analyse; Disse analysene er microarrays16, PCR matriser17og kvantitative sanntid PCR18.
Våre data gi en begrunnelse for studier som utnytter LCM vev. Vi finner at miR-15b upregulated i hippocampus og cortex (Figur 4) men downregulated i nucleus accumbens og kan være biologisk gjelder forståelsen av differensial virkningene av TBI i hjernen. En tidligere studie antydet at økninger i kortikale neuronal sikkerhetsproblemet for skade skyldes overuttrykte flere miRNAs som negativt regulerer Pro overlevelse gener, som Bcl-219. Målet skanning analyser viser Bcl-2 også regulert av miR-15b; dermed våre data tyder på en mekanistisk forklaring for hvorfor regioner av hjernen (dvs., FCx) kan være selektivt sårbare for TBI. Det er viktig å huske de fleste gener er regulert av flere miRNAs og samkjøre endringer i noen en miRNA til et bestemt mål gen er vanskelig. Videre indikerer disse dataene at visse endringer i genet og microRNA uttrykk kan brukes som biomarkers på regionspesifikke hjerneskade. Faktisk vi bruker disse dataene i studier av hvordan nye neuroprotective narkotika forbindelser med antidepressant egenskaper kan ulikt påvirke gene og microRNA uttrykk i områder av hjernen knyttet til nevropsykiatriske lidelser. En begrensning av vår undersøkelse er at under flere trinn av lysbildet forberedelse prosesser for LCM, RNA integritet kan bli kompromittert. Denne protokollen beskriver fremgangsmåten for å redusere risikoen for RNA degradering. En annen begrensning er relativt liten utvalgsstørrelsen brukt til statistisk beregning. I fremtiden bør studier, øke utvalgsstørrelsen redusere effektene av gene og miRNA uttrykk blant enkelte dyr.
Fordelen med LCM er realisert i translasjonsforskning genomisk studier med dyr modeller for menneskelig sykdom og sykt vev20,21,22,23. Uten evne til å fange bestemt celle populasjoner, ville transcriptional profiler av ulike hjernen regioner være en ukjent og økonomiregneark blanding av mange celletyper. Bruke LCM metoder i hjernen skade studier har ført til dagens innsats å avgrense hjernen regionen bestemte biomarkers og å forstå hvordan de samsvarer med sirkulerende biomarkers for TBI.

Pattedyr hjernen er utrolig komplekse og heterogene hundrevis til tusenvis av cellen typer1. Faktisk menneskelig studier har vist at i regioner som frontal cortex, strukturelle og funksjonelle forskjeller i hvit og grå materie gjenspeiles i distinkte og divergerende transcriptional profiler2. Hjernen heterogenitet har vært en stor utfordring å tolke genuttrykk data og innen hjerneskade. Denne tvetydighet i preklinisk studier har senere førte til hundrevis av mislykkede kliniske studier av behandlinger for hjernen skade3.
Vi bruker laser fange microdissection (LCM) metoder for å studere traumatisk hjerneskade (TBI)-indusert genet feilregulering i rotte hjernen4, med fokus på hippocampus, en hjerne region som er avgjørende for læring og hukommelse5. Laser fangst og analysere genuttrykk både døde og overlevende neurons gir oss en større forståelse av rollen stochasticity i genuttrykk for utfallet (neuronal overlevelse) etter TBI6. LCM teknikker har også vist seg nyttig for å utforske effekten av TBI på hippocampus neurons sammenlignet unge og aldring mus7 eller rotter8.
Nyere studier undersøkt vi andre områder av rotte hjernen negativt påvirket av TBI, med fokus på områder i rotter og menneskelige TBI pasienter som er tilknyttet executive funksjon (dvs. frontal cortex9) og TBI samtidige; disse samtidige inkluderer depresjon (i.e. nucleus accumbens10) og døgnrytmen (suprachiasmatic kjernen11). I tidligere studier, Huusko og Pitkanen12 og Drexel et al. 13 brukte LCM undersøke genuttrykk i thalamus og hypothalamus. Vår studie bygger på disse tidligere observasjoner og omfatter fire andre hjernen områder. For å studere regionspesifikke molekylær endringene indusert etter TBI, var det nødvendig å få kompetanse i å identifisere og få celletyper i disse områdene bruker en LCM system. UV-skjæring og infrarød (IR) laser tillater presis microdissection ønsket hjernen regioner. Her beskriver vi hvordan vi bruker dette LCM systemet, guidet av stereotaxic koordinater i den rotte hjernen atlas14, og laser fange fire rotte hjernen regioner som er ulikt påvirket av metoden eksperimentell væske-perkusjon hjernen skader 4.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Arcturus Laser Capture Microdissection System</td>
			<td>Applied Biosystems (Life Technologies)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 2100 Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G2939AA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 6000 Pico Kit</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-1513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arcturus PEN Membrane Glass Slides&#160;</td>
			<td>Applied Biosystems (Life Technologies)</td>
			<td>LCM0522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capsure LCM caps</td>
			<td>Applied Biosystems (Life Technologies)</td>
			<td>LCM0211/LCM0214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cresyl Violet Acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5042-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene (Histological grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>X3P-1GAL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 200 proof (Histological grade)</td>
			<td>UTMB Pharmacy</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAqueous Micro- Kit</td>
			<td>Life Technologies (Ambion)</td>
			<td>AM1931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taqman Gene Expression Primer/Probes</td>
			<td>Applied Biosystems (Life Technologies)</td>
			<td>4331182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taqman microRNA Expression Primer/Probes</td>
			<td>Applied Biosystems (Life Technologies)</td>
			<td>A25576</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lightcycler 96 System</td>
			<td>Roche</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

stereotactic atlas-guided laser capture microdissection of brain regions affected by traumatic injury

Muligheten til å isolere bestemte hjernen regioner av interesse kan hindres i vev tilknytningene teknikker som ikke beholder deres geografiske fordeling. Slike teknikker skew også potensielt gene expression analyse fordi selve prosessen kan endre uttrykket mønstre i enkeltceller. Her beskriver vi en laser fange microdissection (LCM) metode for å selektivt samle spesifikke hjernens regionene påvirkes av traumatisk hjerneskade (TBI) ved hjelp av en modifisert Nissl (cresyl fiolett) flekker protokollen og veiledning av en rotte hjernen atlas. LCM gir tilgang til områder av hjernen i deres opprinnelige posisjoner og muligheten til å bruke anatomiske landemerker for identifikasjon av hver bestemt område. Dette har LCM vært brukt tidligere til å undersøke hjernen regionen bestemte byggkorn under TBI. Denne protokollen tillater undersøkelse av TBI-induserte endringer i genet og microRNA uttrykk i forskjellige hjernen områder innenfor samme dyret. Prinsippene for denne protokollen kan endres og brukes til en rekke studier som undersøker genomisk uttrykk i andre sykdom og/eller dyremodeller.

Den Skjematisk presentert i figur 1 illustrerer hele arbeidsflyten for atlas guidet LCM bestemte hjernen regioner og nedstrøms bruksmuligheter. Denne studien fokusert på fire hjernen regioner relevante TBI patofysiologi og utviklingen av samtidige: FrA, AcbC, SCN og Hp. En begrensning i LCM bestemte hjernen regioner er at anatomiske steder er ofte skjult av mangel på definerte grenser, som kan ses i figur 2 (A, D, G, J). Bruk av en hjerne atlas guide snitting og laser erobringen av bestemte områder reduserer muligheten for eksempel forurensning med hjernen regioner enn målet. Når omsorg tas til følge vev landemerker, både under snitting og etter Nissl flekker, kan LCM-teknologi gi et svært konsekvent middel for diskret bestander av celler, kjerner eller regioner15. De langsiktige mål av disse studiene er å identifisere tilblivelse og microRNAs som kan potensielt tjene som surrogat, ikke-invasiv biomarkers for hjerneskade regionen bestemte. Det første trinnet i denne biomarkør utvikling rørledningen er karakterisering av vev-spesifikke transcriptional endringer etter eksperimentelle TBI. Disse dataene kan deretter være korrelert med skade-induserte endringer i sirkulerende biofluids.
Presentert prosedyrer var optimalisert for å redusere risiko RNA nedbrytningsprodukter slik at RNA analyse via omvendt transkripsjon av totale MFM før kvantitative sanntid PCR (RT-qPCR). Totalt RNA (inkludert små og store RNA arter) ble isolert med en kolonne-baserte isolasjon metode på vev som var laser-fanget fra personlige hjernen regioner. For å vurdere RNA integriteten, kvaliteten og antall etter isolering prosedyrer, var RNA prøvene kort denaturert på 70 ° C og kjøre på en RNA analyserer. Kvalitative mål inkludert analysere peak amplituder 18s og 28s rRNA band ()Figur 3), som kan være representant for generell fornedrelse, og bruker "RNA integritet Number" (RIN). Hvis bruker forsiktig RNase-gratis teknikker, isolert RNA fra LCM prøver vanligvis resulterer i RINs som spenner fra 6-8. En lavere RIN kan antyde RNA kvalitet og kan potensielt redusere nøyaktigheten av gene og microRNA uttrykk analyse. Derimot kan en høyere RIN forbedre tilliten i gyldigheten av resultatene som genereres av RNA analyse.
RT-qPCR ble utført med primer/sonde sett for enkelte gener og microRNAs (Figur 4). Ca 1 ng av totalt var omvendt-transkribert til cDNA og pre forsterket før qPCR ble utført i henhold til produsentens protokollen. Skade-relaterte gener vurdert i denne studien inkluderte BCL2 tilknyttet X, apoptose Regulator (Bax), B-celle CLL/lymfom 2 (Bcl-2), Caspase 3, Apoptosis-Related cystein Peptidase (Casp3) , Hjerne-avledet nevrotropisk faktor (Bdnf) og leiren forståelsesfull Element bindende Protein 1 (Creb). MiR-15b ble valgt fordi det har vist endres etter eksperimentelle TBI i individuelle døende neurons. Det også eksperimentelt har validert og bioinformatically spådd genet mål med Pro overlevelse funksjoner (upubliserte data). Normalisert fold-endring prosenter ble beregnet av ΔΔCt metoden sammenligning gene og microRNA uttrykk nivåer i TBI dyr og naiv kontroller, med normalisering en endogen genet (Gapdh) eller liten RNA (U6), henholdsvis. En fold-endring over 1 angir en generell oppregulering i genet eller microRNA, og motsatt, fold endre lavere enn 1 angir en downregulation. Statistisk analyse viste betydelige endringer i genuttrykk mellom TBI og naiv kontroll (p ≤ 0,05) som var hjernen regionen avhengige. Ingen vesentlige endringer i miR-15b uttrykket ble funnet mellom TBI og naiv, men det var trender mot høyere og lavere uttrykk i hjernen regionen avhengig mote. Disse data tyder på at ytterligere optimalisering er nødvendig å vurdere endringer i microRNA uttrykk. Det er også mulig utvalgsstørrelsen er for liten til å få statistisk betydning, delvis på grunn av iboende variasjon i uttrykket. Fremtidige studier vil inkludere humbug-opererte dyr for å sikre at genet og microRNA uttrykk endringer tilskrives TBI og ikke på grunn av kirurgiske utarbeidelse.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56134/56134fig1.jpg"> 
Figur 1. Arbeidsflyten for Atlas-guidede MFM for nedstrøms genomisk analyse. (A-F) Prosedyrer fra dyr forberedelse til nedstrøms qPCR analyse: (A) voksen, mannlige Sprague Dawley rotter (~ 6 uker og veier 300 g) anesthetized, utsettes for væske perkusjon TBI og humant euthanized 24 timer etter skader. (B) føljetong deler (30 µm) frisk frosne hjerner er basert på koordinatene til bestemte hjernen regioner (FrA, AcbC, Hp, SCN) fra Paxinos og Watson rotte Brain atlas. (C) deler er fast, Nissl-farget (1% Cresyl fiolett), dehydrert, og tørket. (D). LCM på identifisert hjernen regioner med MFM System. (E) MFM makro Caps overføres på en RNase-fri 0,5 mL tube med 100 μL celle lyseringsbuffer og lagret på-80 º c til RNA isolasjon for nedstrøms genomisk analyse. RNA kan deretter omvendt-transkribert for genet eller microRNA RT-qPCR analyse undersøke differensial uttrykk for molekylær målet (r) etter TBI og/eller mellom hjernen regioner av interesse (F). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56134/56134fig1large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56134/56134fig2.jpg"> 
Figur 2. MFM for TBI berørte områder av hjernen. Representant bilder av vev deler samlet fra ipsilateral side av skade området med IR og UV laser funksjoner på LCM systemet (A-jeg). Vev ble delt på en kryostaten (30 µm) og samlet på pennen membran lysbilder. Delene ble så fast, Nissl-farget med cresyl violet (1%), og dehydrert for å identifisere bestemte hjernen områder basert på anatomiske landemerker i Paxinos og Watson The Rat hjernen Atlas. (A-C) Et område på frontal association cortex (FrA) (D-F) komponenter i CA1 CA2 og CA3 pyramideformet lag av hippocampus (Hp) ligger ved fullt dannet hornene av granule laget av dentate gyrus (GrDG). (G-jeg) Et område på nucleus accumbens coRe (AcbC) proksimale og rostral til den fremre commissure (aca). (J-K) Suprachiasmatic kjernen (SCN) rostral til supraoptic chiasm (og). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56134/56134fig2large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56134/56134fig3.jpg"> 
Figur 3. Representant skanninger av RNA kvalitet. Representant electropherograms og tilknyttede gel bilder av avledet fra LCM samlet vev (A-D). Electropherograms og tilhørende gel bilder viser intakt RNA basert på utseendet av 18s og 28s rRNA toppene og gel. Denne RNA er egnet for alle nedstrøms programmer, inkludert genomisk og proteomic analyser. (A) Frontal association cortex (FrA) RNA. RIN 6.1. (B) Hippocampus (Hp) RNA. RIN 4.4. (C) Nucleus accumbens core (AcbC) RNA. RIN 7.3. (D) Suprachiasmatic kjernen (SCN) RNA. RIN 7.6. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56134/56134fig3large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56134/56134fig4.jpg"> 
Figur 4. Nedstrøms analyse av hjernen regionspesifikke Gene og MicroRNA uttrykk via RT-qPCR. Individuelle RT-qPCR for gener av interesse (Bax, Bcl-2, Bdnf, Casp3, Creb) og microRNA rundt (miR-15b) ble utført på laser fanget hjernen regioner etter TBI (Hp og AcbC n = 5, FrA n = 4) og sammenlignet uskadet naiv dyr (n = 4). Analyse av gener knyttet til TBI patogenesen ble utført for Hp, AcbC, FCx. Data presenteres som normalisert fold endre prosenter forhold til naiv kontroll hjernen regioner (kort t test med welchs korreksjon ± SEM; * p ≤ 0,05) (A). Differensial uttrykk for miR-15b i forskjellige hjernen regioner er presentert som normalisert fold endringer i forhold til naiv kontroll (± SEM) (B). Data fra SCN (n = 2) ikke inkludert. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56134/56134fig4large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Stereotactic Atlas-Guided Laser Capture Microdissection of Brain Regions Affected by Traumatic Injury at JoVE.com

Stereotactic Atlas-Guided Laser Capture Microdissection of Brain Regions Affected by Traumatic Injury

Vi beskriver bruk av laser fange microdissection hente prøver av ulike celle populasjoner fra forskjellige hjernen regioner genet og microRNA. Denne teknikken tillater studiet av differensial effekter for traumatisk hjerneskade i bestemte regioner av rotte hjernen.

Stereotactic Atlas-guidede Laser fange Microdissection av hjernen regionene påvirkes av traumatisk skade

The ability to isolate specific brain regions of interest can be impeded in tissue disassociation techniques that do not preserve their spatial ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

The dendritic arborization (da) neurons of the Drosophila peripheral nervous system (PNS) provide an excellent model system in which to investigate the ...

Lateral Fluid Percussion: Model of Traumatic Brain Injury in Mice

Traumatic brain injury (TBI) research has attained renewed momentum due to the increasing awareness of head injuries, which result in morbidity and ...

Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling

Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling  |

Non-Laser Capture Mikroskopi Approach for mikrodisseksjon av Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation og nedstrøms Next-Generation Sekvensering og Gene Expression Profiling

As technological platforms, approaches such as next-generation sequencing, microarray, and qRT-PCR have great promise for expanding our understanding of ...

Laser Capture Microdissection of Enriched Populations of Neurons or Single Neurons for Gene Expression Analysis After Traumatic Brain Injury

Laser Capture mikrodisseksjon av anriket Bestander av neuroner eller Enslige nevroner for genekspresjonsanalyse etter traumatisk hjerneskade

Long-term cognitive disability after TBI is associated with injury-induced neurodegeneration in the hippocampus-a region in the medial temporal lobe that ...

Laser Capture Microdissection of Neurons from Differentiated Human Neuroprogenitor Cells in Culture

Laser Capture microdissection av nerveceller fra Differensiert Menneskelig Neuroprogenitor celler i kultur

Neuroprogenitor cells (NPCs) isolated from the human fetal brain were expanded under proliferative conditions in the presence of epidermal growth factor ...

Production of RNA for Transcriptomic Analysis from Mouse Spinal Cord Motor Neuron Cell Bodies by Laser Capture Microdissection

Produksjon av RNA for transkripsjonsanalyse fra mus ryggmargsmotor neuroncellelegemer ved laserfangst mikrodeseksjon

Preparation of high-quality RNA from cells of interest is critical to precise and meaningful analysis of transcriptional differences among cell types or ...

Laser Capture Microdissection - A Demonstration of the Isolation of Individual Dopamine Neurons and the Entire Ventral Tegmental Area

Laser Capture mikrodisseksjon - En demonstrasjon av Isolering av Individuell dopaminneuroner og hele Ventral tegmentale området

Laser capture microdissection (LCM) is used to isolate a concentrated population of individual cells or precise anatomical regions of tissue from tissue ...

A Method to Inflict Closed Head Traumatic Brain Injury in Drosophila

A Method to Inflict Closed Head Traumatic Brain Injury in Drosophila

En metode å påføre Stengt Leder traumatisk hjerneskade i<em&gt; Drosophila</em

Traumatic brain injury (TBI) affects millions of people each year, causing impairment of physical, cognitive, and behavioral functions and death. Studies ...

A Novel In Vitro Model of Blast Traumatic Brain Injury

A Novel In Vitro Model of Blast Traumatic Brain Injury

Romanen In Vitro modell for Blast traumatisk hjerneskade

Traumatic brain injury is a leading cause of death and disability in military and civilian populations. Blast traumatic brain injury results from the ...

Effects of Blast-induced Neurotrauma on Pressurized Rodent Middle Cerebral Arteries

Effekter av Blast-indusert Biografiske filmer på trykksatt gnager midt Cerebral arterier

Though there have been studies on the histopathological and behavioral effects of blast exposure, fewer have been dedicated to blast&#39;s cerebral ...