Name: synthesis of infectious bacteriophages in an e. coli-based cell-free expression system
Uploaded: 2017-08-17T15:00:00
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Ce matériel est basé sur le travail pris en charge par l’Office of Naval Research award nombre de N00014-13-1-0074 (V.N.), le Human Frontier Science Program grant nombre RGP0037/2015 (à V.N.), et la Science Binational Foundation accorde 2014400 (à V.N.).

Remarque : les étapes suivantes de l’amplification et la méthode d’extraction sont largement généralisables pour nombreux phage ADN double-brin, par exemple, le bactériophage T7, phage entérobactéries T4 ou enterobacteria phage λ (L). Ils sont utilisés principalement pour un phage dont le génome n’est pas facilement disponible à l’achat de sources commerciales.
 1. Amplification du phage Remarque : la technique de production de phage (S...

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	<li>Carlson, E. D., Gan, R., Hodgman, C. E., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+protein+synthesis:+Applications+come+of+age.">Cell-free protein synthesis: Applications come of age.</a> Biotechnol Adv. , (2011).</li><li>Hodgman, C. E., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+synthetic+biology:+Thinking+outside+the+cell.">Cell-free synthetic biology: Thinking outside the cell.</a> Metab Eng. , (2011).</li><li>Caschera, F., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+2.3+mg/mL+of+protein+with+an+all+Escherichia+coli+cell-free+transcription-translation+system.">Synthesis of 2.3 mg/mL of protein with an all Escherichia coli cell-free transcription-translation system.</a> Biochimie. 99, 162-168 (2014).</li><li>Shin, J., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+E.+coli+cell-free+expression+toolbox:+application+to+synthetic+gene+circuits+and+artificial+cells.">An E. coli cell-free expression toolbox: application to synthetic gene circuits and artificial cells.</a> ACS Synth Biol. 1 (1), 29-41 (2012).</li><li>Chemla, Y., Ozer, E., Schlesinger, O., Noireaux, V., Alfonta, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+expanded+cell-free+protein+synthesis+using+endogenous+pyrrolysyl+orthogonal+translation+system.">Genetically expanded cell-free protein synthesis using endogenous pyrrolysyl orthogonal translation system.</a> Biotechnol Bioeng. , (2015).</li><li>Hong, S. H., Kwon, Y. C., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-standard+amino+acid+incorporation+into+proteins+using+Escherichia+coli+cell-free+protein+synthesis.">Non-standard amino acid incorporation into proteins using Escherichia coli cell-free protein synthesis.</a> Frontiers in Chemistry. 2, (2014).</li><li>Noireaux, V., Bar-Ziv, R., Libchaber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+cell-free+genetic+circuit+assembly.">Principles of cell-free genetic circuit assembly.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (22), 12672-12677 (2003).</li><li>Sun, Z. Z., Yeung, E., Hayes, C. A., Noireaux, V., Murray, R. 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K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+and+prototyping+genetic+networks+with+cell-free+transcription-translation+reactions.">Characterizing and prototyping genetic networks with cell-free transcription-translation reactions.</a> Methods. , (2015).</li><li>Shin, J., Jardine, P., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+Replication,+Synthesis,+and+Assembly+of+the+Bacteriophage+T7+in+a+Single+Cell-Free+Reaction.">Genome Replication, Synthesis, and Assembly of the Bacteriophage T7 in a Single Cell-Free Reaction.</a> ACS Synthetic Biology. 1 (9), 408-413 (2012).</li><li>Garamella, J., Marshall, R., Rustad, M., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+All+E.+coli+TX-TL+Toolbox+2.0:+A+Platform+for+Cell-Free+Synthetic+Biology.">The All E. coli TX-TL Toolbox 2.0: A Platform for Cell-Free Synthetic Biology.</a> ACS Synth Biol. , (2016).</li><li>Karzbrun, E., Shin, J., Bar-Ziv, R. H., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coarse-grained+dynamics+of+protein+synthesis+in+a+cell-free+system.">Coarse-grained dynamics of protein synthesis in a cell-free system.</a> Phys Rev Lett. 106 (4), 048104 (2011).</li><li>Daube, S. S., Arad, T., Bar-Ziv, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+co-synthesis+of+protein+nanoassemblies:+tubes,+rings,+and+doughnuts.">Cell-free co-synthesis of protein nanoassemblies: tubes, rings, and doughnuts.</a> Nano Lett. 7 (3), 638-641 (2007).</li><li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+immunoblot+assay+reveals+that+bacteriophage+T4+thymidylate+synthase+and+dihydrofolate+reductase+are+not+virion+proteins.">An immunoblot assay reveals that bacteriophage T4 thymidylate synthase and dihydrofolate reductase are not virion proteins.</a> J Virol. 69 (4), 2119-2125 (1995).</li><li>Sun, Z. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocols+for+implementing+an+Escherichia+coli+based+TX-TL+cell-free+expression+system+for+synthetic+biology.">Protocols for implementing an Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology.</a> J Vis Exp. (79), e50762 (2013).</li><li>Shin, J. N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+cell-free+expression+with+the+endogenous+E.+coli+RNA+polymerase+and+sigma+factor+70.">Efficient cell-free expression with the endogenous E. coli RNA polymerase and sigma factor 70.</a> J Biol Eng. , (2010).</li><li>Caschera, F., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+amino+acid+mixtures+for+cell-free+expression+systems.">Preparation of amino acid mixtures for cell-free expression systems.</a> Biotechniques. 58 (1), 40-43 (2015).</li><li>Minton, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+can+biochemical+reactions+within+cells+differ+from+those+in+test+tubes.">How can biochemical reactions within cells differ from those in test tubes.</a> J Cell Sci. 119, 2863-2869 (2006).</li><li>Minton, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implications+of+macromolecular+crowding+for+protein+assembly.">Implications of macromolecular crowding for protein assembly.</a> Curr Opin Struct Biol. 10 (1), 34-39 (2000).</li><li>Zimmerman, S. B., Minton, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macromolecular+crowding:+biochemical,+biophysical,+and+physiological+consequences.">Macromolecular crowding: biochemical, biophysical, and physiological consequences.</a> Annu Rev Biophys Biomol Struct. 22, 27-65 (1993).</li></ol>

Selon la technique de Chen, et al. 14 pour SPMC, une étape essentielle est atteinte lorsqu’il détermine les conditions appropriées pour la surinfection. Le paramètre qui contrôle plus étroitement les capacité de souche hôte de résister à une surinfection est fréquemment la concentration initiale du phage infectant. Les cellules de l’hôte doivent être en phase de croissance logarithmique avant l’infection initiale avec une très petite quantité du phage. Finalement, le ...

Ces dix dernières années, la technologie d’expression acellulaire a été conçue pour les nouvelles applications en biologie liés à synthétique et quantitative de recherche multidisciplinaire emergent zones d’adresse. Initialement utilisé pour exprimer les protéines indépendants d’un organisme vivant, TXTL acellulaire-nouveaux systèmes ont été développés pour les deux sciences fondamentales et appliquées1,2, d’élargir considérablement la portée de cette technologie. La nouvelle génération de plates-formes TXTL a été conçue pour être facile à utiliser, plus efficace (atteignant 2 mg/mL de la synthèse protéique en batch mode3), plus polyvalent au niveau de la transcription4et modulaire afin d’intègrent facilement le roman naturel ou fonctions synthétiques qui étendent les fonctionnalités existantes des systèmes biologiques5,6. En particulier, systèmes TXTL acellulaires sont devenus très pratiques pour le prototypage rapide de programmes génétiques, tels que des éléments de régulation ou de petits circuits génétiques7,8,9, en réduisant la conception-construction-test cycle de quelques jours. Remarquablement, les nouveaux systèmes TXTL sont également capables de traiter de grands programmes de l’ADN telles que la synthèse complète de coliphages10,11, démontrant fort assez spectacles pour soutenir la reconstitution de l’actif de génomique ADN codée des entités vivantes.
TXTL systèmes présentent de nombreux avantages techniques par rapport aux traditionnels in vitro des épreuves biochimiques constructive. Acellulaire TXTL relie le processus de l’expression génique au produit final dans un environnement ouvert et réduit, par opposition à complex cytoplasme d’une cellule vivante. TXTL utilise l’ADN pour reconstruire les systèmes biochimiques in vitro, qui, avec des techniques modernes d’assemblage ADN, est abordable et rapide en plus d’étapes de purification de protéine fastidieux ne nécessitant ne pas. Acellulaire expression offre un accès direct à la plupart des composants dans les réactions biochimiques, ce qui permet une dissection plus profonde des interactions moléculaires12. Dans une réaction TXTL, on peut changer les paramètres biochimiques et biophysiques à volonté, qui est presque impossible dans une cellule vivante. Compte tenu de ces avantages et améliorations récentes, la technologie TXTL devient plus populaire comme une plateforme pour la biologie synthétique et quantitative. Alors que le milieu de la recherche à l’aide de TXTL croît rapidement et TXTL devient une technologie standard en bio-ingénierie, il est essentiel de comprendre comment utiliser ces plateformes afin de développer des pratiques adéquates relies à l’exécution des réactions TXTL et à la interprétation des résultats.
Dans cet article, nous décrivons comment utiliser un système TXTL tous les e. coli de synthétiser, dans les réactions d’un pot, bactériophages dans leur génome11, comme MS2 (ARN, 3,4 Ko), ΦΧ174 (ssDNA, 5,4 Ko) et T7 (dsDNA, 40 Ko). Nous montrons comment la quantité de phages synthétisé modifications par rapport à certains paramètres biochimiques des réactions (concentrations en magnésium et potassium). Un encombrement moléculaire, imité à travers une gamme de PEG 8000 des concentrations, a un effet dramatique sur la synthèse des phages sur plusieurs ordres de grandeur. La réalisation de ces grands systèmes biochimiques dans les réactions de simple tube à essai qui récapitulent en même temps les processus de transcription, traduction et autoassemblage, sont intéressant pour aborder des questions fondamentales liées à la biologie et la biophysique 10 (régulation des gènes, auto-assemblage), ainsi que pour développer des applications, telles que la réaffectation des fonctions phage pour construire de nouvelles nanostructures13. Outre une pratique sur TXTL, nous fournissent des méthodes pour l’amplification de phage, génome extraction et purification et quantification des phages par l’essai de plaque. Les méthodes présentées dans ce manuscrit sont appropriées pour les chercheurs qui utilisent des e. coli extrait basé des systèmes acellulaires et sont intéressés par les bactériophages.
Les protocoles présentés dans cet ouvrage peuvent être résumées comme suit : amplification 1) Phage (jour 1 : préparer l’inoculation de cellules, jour 2 : simple plaque, multiples phages croissance, concentration et jour 3 : purification du phage), 2) extraction d’ADN Double-brin du génome (extraction de phénol/chloroforme) et 3) réaction de phage acellulaire et expérience de titre (jour 1 : cellules hôtes sur plaque et faire des plaques d’agar, jour 2 : réaction acellulaire et host cell pré-culture et jour 3 : host cell culture et phage titre).

<table width="899">
	<colgroup>
		<col style="width:162pt" width="216" />
		<col style="width:168pt" width="224" />
		<col style="width:219pt" width="292" />
		<col style="width:125pt" width="167" />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:162pt;height:15.75pt" width="216">Ultracentrifugation tubes</td>
			<td class="xl21" style="width:168pt" width="224">Beckman Coulter</td>
			<td class="xl21" style="width:219pt" width="292">344057</td>
			<td class="xl20" style="width:125pt" width="167"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="height:15.75pt">Conical tubes</td>
			<td class="xl22" style="width:168pt" width="224">Falcon</td>
			<td class="xl21">352070</td>
			<td class="xl20"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="height:15.75pt">Gradient maker</td>
			<td class="xl21">BioComp Gradient Master</td>
			<td class="xl22" style="width:219pt" width="292">see Anal Biochem. 1985 Jul;148(1):254-9.</td>
			<td class="xl20"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="height:15.75pt">Syringe and Blunt Cannula</td>
			<td class="xl21">Monoject</td>
			<td class="xl21">8881513918 and 888202017</td>
			<td class="xl20"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="height:15.75pt">Wide-bore pipette tips</td>
			<td class="xl21">Fischerbrand</td>
			<td class="xl21">02-707-134</td>
			<td class="xl20"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="height:15.75pt">Plaque counter</td>
			<td class="xl21">New Brunswik Scientific</td>
			<td class="xl21">Colony Counter Model C-110</td>
			<td class="xl20"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="height:15.75pt">Culture tubes</td>
			<td class="xl22" style="width:168pt" width="224">Fischerbrand</td>
			<td class="xl21">14-961-33</td>
			<td class="xl20"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="height:15.75pt">Cell-free system</td>
			<td class="xl22" style="width:168pt" width="224">Mycroarray Inc</td>
			<td class="xl22" style="width:219pt" width="292">Mytxtl</td>
			<td class="xl20"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl17" height="21" style="width:162pt;height:15.75pt" width="216">BioComp Gradient Master</td>
			<td class="xl17" style="width:168pt" width="224">BioComp Instruments</td>
			<td class="xl17" style="width:219pt" width="292">Model 105ME</td>
			<td class="xl20"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl17" height="21" style="width:162pt;height:15.75pt" width="216">LB agar plate recipe</td>
			<td class="xl20"></td>
			<td class="xl20"></td>
			<td class="xl24" style="width:512pt" width="683">25 g/L Luria-Bertani medium (LB Broth, Miller - Fisher BioReagents product number BP1426) and 15 g/L Bacto-Agar solid (Brenton, Dickenson and Company - product number 214010).</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

synthesis of infectious bacteriophages in an e. coli-based cell-free expression system

Une nouvelle génération de systèmes de transcription-traduction acellulaire (TXTL), machinées pour avoir une plus grande polyvalence et modularité, fournir de nouvelles capacités pour effectuer des sciences fondamentales et appliquées dans les réactions de l’éprouvette. Ces dix dernières années, TXTL acellulaire est devenu une technique puissante pour un large éventail de biologie liés à quantitative et synthétiques de zones nouvelles recherches multidisciplinaires. Les nouvelles plateformes TXTL sont particulièrement utiles à construire et à interroger les systèmes biochimiques grâce à l’exécution des circuits d’un gène synthétique ou naturelle. In vitro TXTL s’avère pratique pour rapidement les éléments de régulation prototype et réseaux biologiques aussi bien quant à rappel moléculaire auto-assemblage mécanismes trouvent dans les systèmes vivants. Dans cet article, nous décrivons comment infectieuses bactériophages, tels que MS2 (ARN), ΦΧ174 (ssDNA) et T7 (dsDNA), sont entièrement synthétisée à partir de leur génome dans les réactions d’un pot en utilisant un toutes les Escherichia coli, système TXTL acellulaire. Synthèse des trois coliphages est quantifiée à l’aide de l’essai de plaque. Nous montrons comment le rendement du phage synthétisée dépend des paramètres biochimiques des réactions. Encombrement moléculaire, imité par une concentration contrôlée de PEG 8000, détermine la quantité de phages synthétisées par ordres de grandeur. On décrit aussi comment amplifier les phages et purifier leurs génomes. L’ensemble des protocoles et des résultats présentés dans ce travail devrait être d’intérêt pour les chercheurs multidisciplinaires en bio-ingénierie et biologie synthétique acellulaire.

Nous montrons quatre résultats représentatifs. Dans la Figure 1, nous présentons un ensemble de contrôles négatifs pour s’assurer que le système TXTL acellulaire et les stocks de l’ADN du phage ne soient pas contaminées avec la vie cellules d’Escherichia coli . Nous vérifions que le système TXTL acellulaire est libre d’intact e. coli cellule contamination en ensemençant les deux une solution non incubés et couvés réactio...

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Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System

Synthèse des bactériophages infectieuses dans un e. coli -basé système d’Expression acellulaire

Une nouvelle génération de plates-formes de transcription-traduction acellulaire a été conçue pour construire des systèmes biochimiques in vitro par le biais de l’exécution des circuits de gène. Dans cet article, nous décrivons comment bactériophages MS2, ΦΧ174 et T7, sont synthétisés à partir de leur génome en utilisant un système tous les e. coli acellulaire TXTL.

A new generation of cell-free transcription-translation (TXTL) systems, engineered to have a greater versatility and modularity, provide novel ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

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