Name: synthesis of infectious bacteriophages in an e. coli-based cell-free expression system
Uploaded: 2017-08-17T15:00:00
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Questo materiale si basa su lavori sostenuta dall'Office of Naval Research award numero N00014-13-1-0074 (V.N.), Human Frontier Science Program grant numero RGP0037/2015 (per V.N.) e la Fondazione di scienza binazionale concedere 2014400 (al V.N.).

Nota: la seguente procedura di amplificazione e il metodo di estrazione sono in gran parte generalizzabile per molti dei fagi del DNA double-stranded, ad es., fago T7, Fago T4 di enterobatteri o enterobatteri fago λ (L). Sono usati principalmente per un fago cui genoma non è prontamente disponibile per l'acquisto da fonti commerciali.
 1. amplificazione dei fagi Nota: la tecnica di produzione dei fagi (SPMC) singolo-placca, multi-ciclo è ben descritta pe...

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	<li>Carlson, E. D., Gan, R., Hodgman, C. E., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+protein+synthesis:+Applications+come+of+age.">Cell-free protein synthesis: Applications come of age.</a> Biotechnol Adv. , (2011).</li><li>Hodgman, C. E., Jewett, M. 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H., Kwon, Y. C., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-standard+amino+acid+incorporation+into+proteins+using+Escherichia+coli+cell-free+protein+synthesis.">Non-standard amino acid incorporation into proteins using Escherichia coli cell-free protein synthesis.</a> Frontiers in Chemistry. 2, (2014).</li><li>Noireaux, V., Bar-Ziv, R., Libchaber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+cell-free+genetic+circuit+assembly.">Principles of cell-free genetic circuit assembly.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (22), 12672-12677 (2003).</li><li>Sun, Z. Z., Yeung, E., Hayes, C. A., Noireaux, V., Murray, R. 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H., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coarse-grained+dynamics+of+protein+synthesis+in+a+cell-free+system.">Coarse-grained dynamics of protein synthesis in a cell-free system.</a> Phys Rev Lett. 106 (4), 048104 (2011).</li><li>Daube, S. S., Arad, T., Bar-Ziv, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+co-synthesis+of+protein+nanoassemblies:+tubes,+rings,+and+doughnuts.">Cell-free co-synthesis of protein nanoassemblies: tubes, rings, and doughnuts.</a> Nano Lett. 7 (3), 638-641 (2007).</li><li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+immunoblot+assay+reveals+that+bacteriophage+T4+thymidylate+synthase+and+dihydrofolate+reductase+are+not+virion+proteins.">An immunoblot assay reveals that bacteriophage T4 thymidylate synthase and dihydrofolate reductase are not virion proteins.</a> J Virol. 69 (4), 2119-2125 (1995).</li><li>Sun, Z. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocols+for+implementing+an+Escherichia+coli+based+TX-TL+cell-free+expression+system+for+synthetic+biology.">Protocols for implementing an Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology.</a> J Vis Exp. (79), e50762 (2013).</li><li>Shin, J. N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+cell-free+expression+with+the+endogenous+E.+coli+RNA+polymerase+and+sigma+factor+70.">Efficient cell-free expression with the endogenous E. coli RNA polymerase and sigma factor 70.</a> J Biol Eng. , (2010).</li><li>Caschera, F., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+amino+acid+mixtures+for+cell-free+expression+systems.">Preparation of amino acid mixtures for cell-free expression systems.</a> Biotechniques. 58 (1), 40-43 (2015).</li><li>Minton, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+can+biochemical+reactions+within+cells+differ+from+those+in+test+tubes.">How can biochemical reactions within cells differ from those in test tubes.</a> J Cell Sci. 119, 2863-2869 (2006).</li><li>Minton, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implications+of+macromolecular+crowding+for+protein+assembly.">Implications of macromolecular crowding for protein assembly.</a> Curr Opin Struct Biol. 10 (1), 34-39 (2000).</li><li>Zimmerman, S. B., Minton, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macromolecular+crowding:+biochemical,+biophysical,+and+physiological+consequences.">Macromolecular crowding: biochemical, biophysical, and physiological consequences.</a> Annu Rev Biophys Biomol Struct. 22, 27-65 (1993).</li></ol>

Seguendo la tecnica in Chen, et al. 14 per SPMC, un passaggio critico è raggiunto nel determinare le condizioni adeguate per superinfezione. Il parametro che controlla maggiormente capacità di un ceppo di host di resistere a superinfezione è frequentemente la concentrazione iniziale del fago d'infezione. Cellule dell'ospite devono essere in fase di crescita logaritmica prima infezione iniziale con una piccola quantità del fago. Alla fine, il fago raggiungerà anche crescita logaritmic...

Nell'ultimo decennio, la tecnologia di espressione senza cellula è stata studiata per applicazioni innovative di indirizzo in biologia relativa sintetica e quantitativa di aree di ricerca multidisciplinare emergente. Originariamente utilizzato per esprimere proteine indipendenti di un organismo vivente, nuovi sistemi senza cellula di TXTL sono stati sviluppati per entrambi Scienze di base e applicata1,2, ampliando notevolmente il campo di questa tecnologia. La nuova generazione di piattaforme TXTL è stata progettata per essere facile da usare, più efficiente (raggiungendo 2 mg/mL di sintesi proteica in batch mode3), più versatile a livello di trascrizione4e modulare in modo da integrare facilmente romanzo naturale o funzioni sintetiche che ampliano le funzionalità esistenti sistemi biologici5,6. In particolare, sistemi TXTL senza cellula sono diventati comodo per la prototipazione rapida di programmi genetici, quali elementi regolatori o piccoli circuiti genetici7,8,9, riducendo la progettazione-costruzione-prova ciclo per un paio di giorni. Notevolmente, i nuovi sistemi TXTL sono anche in grado di elaborare programmi di grandi dimensioni del DNA come la sintesi completa di fagi10,11, dimostrando forte abbastanza prestazioni per supportare la ricostituzione dell'attivo genomica DNA codificato entità viventi.
TXTL sistemi presentano molti vantaggi rispetto ai tradizionali in vitro costruttiva analisi biochimiche. Senza cellula TXTL collega il processo di espressione genica al prodotto finale in un ambiente aperto e ridotto, in contrasto con il complesso citoplasma di una cellula vivente. TXTL utilizza il DNA per ricostruire sistemi biochimici in vitro, che, con moderne tecniche di assemblaggio di DNA, è conveniente e veloce oltre a non richiedere fasi di purificazione della proteina fastidiosa. Espressione senza cellula fornisce accesso diretto alla maggior parte dei componenti nelle reazioni biochimiche, permettendo così una dissezione più profonda delle interazioni molecolari12. In una reazione di TXTL, uno può cambiare le impostazioni biochimiche e biofisiche a volontà, che è quasi impossibile in una cellula vivente. Dato questi vantaggi e miglioramenti recenti, la tecnologia TXTL sta diventando sempre più popolare come una piattaforma alternativa per la biologia sintetica e quantitativa. Mentre la comunità di ricerca utilizzando TXTL è in rapida crescita e TXTL sta diventando una tecnologia standard in Bioingegneria, è essenziale comprendere come utilizzare tali piattaforme al fine di sviluppare adeguate pratiche relazionate all'esecuzione delle reazioni di TXTL e alla interpretazione dei risultati.
In questo articolo, descriviamo come utilizzare un sistema TXTL di e. coli tutto per sintetizzare, nelle reazioni di uno-pentola, batteriofagi dal loro genoma11, quali MS2 (RNA, 3,4 kb), ΦΧ174 (ssDNA, 5,4 kb) e T7 (dsDNA, 40 kb). Vi mostriamo come la quantità di fagi sintetizzata cambiamenti per quanto riguarda alcune delle impostazioni biochimiche delle reazioni (concentrazioni di magnesio e potassio). Affollamento molecolare, emulato attraverso una gamma di PEG 8000 concentrazioni, ha un effetto drammatico sulla sintesi dei fagi parecchi ordini di grandezza. La realizzazione di questi grandi sistemi biochimici nelle reazioni di singola provetta che ricapitolano contemporaneamente i processi di trascrizione, traduzione e auto-assemblaggio, sono interessante per affrontare questioni fondamentali legate alla biologia e biofisica 10 (regolazione genica, self-assembly), come pure per lo sviluppo di applicazioni, ad esempio di riuso funzioni dei fagi per costruire nuove nanostrutture13. Oltre a un pratico su TXTL, sono disponibili metodi per l'amplificazione dei fagi, genoma estrazione e purificazione e quantificazione dei fagi dall'analisi della placca. I metodi presentati in questo manoscritto sono appropriati per i ricercatori che utilizzano sistemi senza cellula basata l'Estratto di e. coli e sono interessati a batteriofagi.
I protocolli presentati in questo lavoro si possono riassumere come segue: amplificazione 1) dei fagi (giorno 1: preparare l'inoculazione cellule, giorno 2: singola placca, più crescita dei fagi e concentrazione e 3 ° giorno: purificazione del fago), 2) estrazione di DNA Double-stranded del genoma (estrazione del fenolo/cloroformio) e 3) senza cellula reazione dei fagi e titolo esperimento (giorno 1: piastra di cellule dell'ospite e rendere le piastre di agar, giorno 2: reazione senza cellula e host cella pre-cultura e il giorno 3: titolo di cultura e dei fagi cellula ospite).

<table width="899">
	<colgroup>
		<col style="width:162pt" width="216" />
		<col style="width:168pt" width="224" />
		<col style="width:219pt" width="292" />
		<col style="width:125pt" width="167" />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:162pt;height:15.75pt" width="216">Ultracentrifugation tubes</td>
			<td class="xl21" style="width:168pt" width="224">Beckman Coulter</td>
			<td class="xl21" style="width:219pt" width="292">344057</td>
			<td class="xl20" style="width:125pt" width="167"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="height:15.75pt">Conical tubes</td>
			<td class="xl22" style="width:168pt" width="224">Falcon</td>
			<td class="xl21">352070</td>
			<td class="xl20"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="height:15.75pt">Gradient maker</td>
			<td class="xl21">BioComp Gradient Master</td>
			<td class="xl22" style="width:219pt" width="292">see Anal Biochem. 1985 Jul;148(1):254-9.</td>
			<td class="xl20"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="height:15.75pt">Syringe and Blunt Cannula</td>
			<td class="xl21">Monoject</td>
			<td class="xl21">8881513918 and 888202017</td>
			<td class="xl20"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="height:15.75pt">Wide-bore pipette tips</td>
			<td class="xl21">Fischerbrand</td>
			<td class="xl21">02-707-134</td>
			<td class="xl20"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="height:15.75pt">Plaque counter</td>
			<td class="xl21">New Brunswik Scientific</td>
			<td class="xl21">Colony Counter Model C-110</td>
			<td class="xl20"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="height:15.75pt">Culture tubes</td>
			<td class="xl22" style="width:168pt" width="224">Fischerbrand</td>
			<td class="xl21">14-961-33</td>
			<td class="xl20"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="height:15.75pt">Cell-free system</td>
			<td class="xl22" style="width:168pt" width="224">Mycroarray Inc</td>
			<td class="xl22" style="width:219pt" width="292">Mytxtl</td>
			<td class="xl20"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl17" height="21" style="width:162pt;height:15.75pt" width="216">BioComp Gradient Master</td>
			<td class="xl17" style="width:168pt" width="224">BioComp Instruments</td>
			<td class="xl17" style="width:219pt" width="292">Model 105ME</td>
			<td class="xl20"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl17" height="21" style="width:162pt;height:15.75pt" width="216">LB agar plate recipe</td>
			<td class="xl20"></td>
			<td class="xl20"></td>
			<td class="xl24" style="width:512pt" width="683">25 g/L Luria-Bertani medium (LB Broth, Miller - Fisher BioReagents product number BP1426) and 15 g/L Bacto-Agar solid (Brenton, Dickenson and Company - product number 214010).</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

synthesis of infectious bacteriophages in an e. coli-based cell-free expression system

Una nuova generazione di sistemi senza cellula trascrizione-traduzione (TXTL), progettato per avere una maggiore versatilità e modularità, fornire nuove funzionalità per eseguire delle scienze di base ed applicate in provetta reazioni. Nell'ultimo decennio, senza cellula TXTL è diventata una tecnica potente per un'ampia gamma di biologia related to quantitativa e sintetiche aree di ricerca multidisciplinare romanzo. Le nuove piattaforme TXTL sono particolarmente utili per costruire e interrogare i sistemi biochimici mediante l'esecuzione di circuiti gene sintetico o naturale. In vitro TXTL ha dimostrato conveniente rapidamente elementi regolatori prototipo e reti biologiche anche per quanto riguarda Riepilogo molecolare autoassemblaggio meccanismi trovano nei sistemi viventi. In questo articolo, descriviamo come infettivi batteriofagi, quali MS2 (RNA), ΦΧ174 (ssDNA) e T7 (dsDNA), interamente sono sintetizzati dal loro genoma in reazioni di uno-pentola usando un tutti Escherichia coli, sistema senza cellula TXTL. Sintesi dei tre fagi sono quantificato utilizzando il saggio della placca. Vi mostriamo come la resa del fago sintetizzato dipende dalle impostazioni delle reazioni biochimiche. Affollamento molecolare, emulato attraverso una controllata concentrazione di PEG 8000, influisce sulla quantità di fagi sintetizzati da ordini di grandezza. Inoltre descriviamo come amplificare i fagi e purificare i loro genomi. L'insieme di protocolli e risultati presentati in questo lavoro dovrebbe essere di interesse per i ricercatori multidisciplinari coinvolti in Bioingegneria e biologia sintetica senza cellula.

Indichiamo quattro risultati rappresentativi. Nella Figura 1, vi presentiamo una serie di controlli negativi per garantire che il sistema TXTL senza cellula e le scorte di DNA dei fagi non sono contaminate con vita cellule di Escherichia coli . Verificare che il sistema TXTL senza cellula è libero di intatto e. coli contaminazione della cellula da placcatura sia una soluzione di reazione non incubate e incubate Sub del DNA genomico (<strong...

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Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System

Sintesi dei batteriofagi infettive in un e. coli -basato sistema di espressione senza cellula

Una nuova generazione di piattaforme senza cellula trascrizione-traduzione è stata progettata per costruire sistemi biochimici in vitro mediante l'esecuzione di circuiti di gene. In questo articolo, descriviamo come batteriofagi, quali MS2, ΦΧ174 e T7, sono sintetizzati dal loro genoma utilizzando un sistema di TXTL senza cellula e. coli .

A new generation of cell-free transcription-translation (TXTL) systems, engineered to have a greater versatility and modularity, provide novel ...

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