Name: synthesis of infectious bacteriophages in an e. coli-based cell-free expression system
Uploaded: 2017-08-17T15:00:00
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Este material é baseado no trabalho suportado pelo escritório de pesquisa Naval prêmio número N00014-13-1-0074 (V.N.), o programa de ciência de fronteira humana conceder número RGP0037/2015 (a V.N.), e a Fundação científica Binacional conceder 2014400 (V.N.).

Nota: as seguintes etapas de amplificação e método de extração são amplamente generalizáveis para muitos do fago de DNA dupla-hélice, por exemplo, do bacteriófago T7, enterobactérias do fago T4 ou enterobactérias do fago λ (L). Eles são predominantemente utilizados para um phage cujo genoma não está prontamente disponível para a compra de fontes comerciais.
 1. amplificação do fago Nota: A único-placa, ciclo multi fago (SPMC) produção t...

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	<li>Carlson, E. D., Gan, R., Hodgman, C. E., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+protein+synthesis:+Applications+come+of+age.">Cell-free protein synthesis: Applications come of age.</a> Biotechnol Adv. , (2011).</li><li>Hodgman, C. E., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+synthetic+biology:+Thinking+outside+the+cell.">Cell-free synthetic biology: Thinking outside the cell.</a> Metab Eng. , (2011).</li><li>Caschera, F., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+2.3+mg/mL+of+protein+with+an+all+Escherichia+coli+cell-free+transcription-translation+system.">Synthesis of 2.3 mg/mL of protein with an all Escherichia coli cell-free transcription-translation system.</a> Biochimie. 99, 162-168 (2014).</li><li>Shin, J., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+E.+coli+cell-free+expression+toolbox:+application+to+synthetic+gene+circuits+and+artificial+cells.">An E. coli cell-free expression toolbox: application to synthetic gene circuits and artificial cells.</a> ACS Synth Biol. 1 (1), 29-41 (2012).</li><li>Chemla, Y., Ozer, E., Schlesinger, O., Noireaux, V., Alfonta, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+expanded+cell-free+protein+synthesis+using+endogenous+pyrrolysyl+orthogonal+translation+system.">Genetically expanded cell-free protein synthesis using endogenous pyrrolysyl orthogonal translation system.</a> Biotechnol Bioeng. , (2015).</li><li>Hong, S. H., Kwon, Y. C., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-standard+amino+acid+incorporation+into+proteins+using+Escherichia+coli+cell-free+protein+synthesis.">Non-standard amino acid incorporation into proteins using Escherichia coli cell-free protein synthesis.</a> Frontiers in Chemistry. 2, (2014).</li><li>Noireaux, V., Bar-Ziv, R., Libchaber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+cell-free+genetic+circuit+assembly.">Principles of cell-free genetic circuit assembly.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (22), 12672-12677 (2003).</li><li>Sun, Z. Z., Yeung, E., Hayes, C. A., Noireaux, V., Murray, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linear+DNA+for+Rapid+Prototyping+of+Synthetic+Biological+Circuits+in+an+Escherichia+coli+Based+TX-TL+Cell-Free+System.">Linear DNA for Rapid Prototyping of Synthetic Biological Circuits in an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free System.</a> Acs Synthetic Biology. 3 (6), 387-397 (2014).</li><li>Takahashi, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+and+prototyping+genetic+networks+with+cell-free+transcription-translation+reactions.">Characterizing and prototyping genetic networks with cell-free transcription-translation reactions.</a> Methods. , (2015).</li><li>Shin, J., Jardine, P., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+Replication,+Synthesis,+and+Assembly+of+the+Bacteriophage+T7+in+a+Single+Cell-Free+Reaction.">Genome Replication, Synthesis, and Assembly of the Bacteriophage T7 in a Single Cell-Free Reaction.</a> ACS Synthetic Biology. 1 (9), 408-413 (2012).</li><li>Garamella, J., Marshall, R., Rustad, M., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+All+E.+coli+TX-TL+Toolbox+2.0:+A+Platform+for+Cell-Free+Synthetic+Biology.">The All E. coli TX-TL Toolbox 2.0: A Platform for Cell-Free Synthetic Biology.</a> ACS Synth Biol. , (2016).</li><li>Karzbrun, E., Shin, J., Bar-Ziv, R. H., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coarse-grained+dynamics+of+protein+synthesis+in+a+cell-free+system.">Coarse-grained dynamics of protein synthesis in a cell-free system.</a> Phys Rev Lett. 106 (4), 048104 (2011).</li><li>Daube, S. S., Arad, T., Bar-Ziv, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+co-synthesis+of+protein+nanoassemblies:+tubes,+rings,+and+doughnuts.">Cell-free co-synthesis of protein nanoassemblies: tubes, rings, and doughnuts.</a> Nano Lett. 7 (3), 638-641 (2007).</li><li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+immunoblot+assay+reveals+that+bacteriophage+T4+thymidylate+synthase+and+dihydrofolate+reductase+are+not+virion+proteins.">An immunoblot assay reveals that bacteriophage T4 thymidylate synthase and dihydrofolate reductase are not virion proteins.</a> J Virol. 69 (4), 2119-2125 (1995).</li><li>Sun, Z. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocols+for+implementing+an+Escherichia+coli+based+TX-TL+cell-free+expression+system+for+synthetic+biology.">Protocols for implementing an Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology.</a> J Vis Exp. (79), e50762 (2013).</li><li>Shin, J. N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+cell-free+expression+with+the+endogenous+E.+coli+RNA+polymerase+and+sigma+factor+70.">Efficient cell-free expression with the endogenous E. coli RNA polymerase and sigma factor 70.</a> J Biol Eng. , (2010).</li><li>Caschera, F., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+amino+acid+mixtures+for+cell-free+expression+systems.">Preparation of amino acid mixtures for cell-free expression systems.</a> Biotechniques. 58 (1), 40-43 (2015).</li><li>Minton, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+can+biochemical+reactions+within+cells+differ+from+those+in+test+tubes.">How can biochemical reactions within cells differ from those in test tubes.</a> J Cell Sci. 119, 2863-2869 (2006).</li><li>Minton, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implications+of+macromolecular+crowding+for+protein+assembly.">Implications of macromolecular crowding for protein assembly.</a> Curr Opin Struct Biol. 10 (1), 34-39 (2000).</li><li>Zimmerman, S. B., Minton, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macromolecular+crowding:+biochemical,+biophysical,+and+physiological+consequences.">Macromolecular crowding: biochemical, biophysical, and physiological consequences.</a> Annu Rev Biophys Biomol Struct. 22, 27-65 (1993).</li></ol>

Seguindo a técnica em Chen, et al 14 para SPMC, um passo crítico é atingido quando determinar condições adequadas para o superinfeção. O parâmetro que controla a capacidade de uma estirpe hospedeiro para resistir a superinfeção mais estreitamente com frequência é a concentração inicial do fago infectante. As células hospedeiras devem estar em fase de crescimento logarítmico antes da infecção inicial, com uma pequena quantidade do fago. Eventualmente, a Praga também alca...

Na última década, a tecnologia de célula livre expressão foi projetada para aplicações de romance endereço em biologia relacionadas a sintética e quantitativos de investigação multidisciplinar emergente áreas. Originalmente usado para expressar proteínas independentes de um organismo vivo, novos sistemas TXTL sem célula foram desenvolvidos para ambas as ciências básicas e aplicadas1,2, ampliar consideravelmente o alcance desta tecnologia. A nova geração de plataformas TXTL foi projetada para ser amigável, mais eficiente (atingindo 2 mg/mL de síntese de proteínas em modo de lote3), a mais versátil a nível de transcrição4e modular para integram facilmente romance natural ou funções sintéticas expandir as capacidades existentes sistemas biológicos5,6. Em particular, sistemas TXTL sem célula tornaram-se útil para a prototipagem rápida de programas genéticos, tais como elementos reguladores ou pequenos circuitos genéticos7,8,9, reduzindo o projeto-compilação-teste a alguns dias do ciclo. Notavelmente, os novos sistemas TXTL também são capazes de processar grandes programas de DNA como a síntese completa de coliphages10,11, demonstrando forte suficiente performances para apoiar a reconstituição da genômica ativo DNA codificado entidades vivas.
Sistemas TXTL apresentam muitas vantagens técnicas em relação ao tradicional em vitro construtivo ensaios bioquímicos. TXTL sem célula vincula o processo de expressão gênica ao produto final em um ambiente aberto e reduzido, em oposição ao complexo citoplasma de uma célula viva. TXTL usa DNA para reconstruir sistemas bioquímicos em vitro, que, com modernas técnicas de montagem de DNA, é acessível e rápido além de não exigir etapas de purificação de proteínas fastidioso. Expressão sem célula fornece acesso direto a maioria dos componentes nas reações bioquímicas, permitindo assim uma dissecação mais profunda das interações moleculares12. Em uma reação TXTL, um pode alterar as configurações de bioquímicas e biofísicas à vontade, que é quase impossível em uma célula viva. Dadas essas vantagens e melhorias recentes, a tecnologia TXTL está se tornando cada vez mais popular como uma plataforma alternativa para a biologia sintética e quantitativa. Enquanto a comunidade de pesquisa usando TXTL está crescendo rapidamente e TXTL está se tornando uma tecnologia padrão em bioengenharia, é essencial para entender como usar tais plataformas a fim de desenvolver práticas adequadas relacionadas com a execução de reações TXTL e para a interpretação dos resultados.
Neste artigo, descrevemos como usar um sistema TXTL de e. coli todos para sintetizar, em um pot-reações, bacteriófagos de seu genoma11, tais como MS2 (RNA, 3,4 kb), ΦΧ174 (ssDNA, 5,4 kb) e T7 (dsDNA, 40 kb). Mostramos como a quantidade do fago sintetizado as alterações em relação a algumas das configurações de bioquímica das reações (concentração de magnésio e potássio). Apinhamento molecular, emulado por uma gama de PEG 8000 concentrações, tem um efeito dramático na síntese do fago sobre várias ordens de grandeza. A realização desses grandes sistemas bioquímicos em reações de único tubo de ensaio que recapitular simultaneamente os processos de transcrição, tradução e self-assembly, é interessante para abordar questões básicas relacionadas com a biologia e biofísica 10 (regulação gênica auto-montagem), bem como para desenvolvimento de aplicações, tais como a redefinição de funções do fago para construir novas nanoestruturas13. Além de um prático em TXTL, nós fornecemos métodos para amplificação do fago, extração de genoma e purificação e quantificação do fago por ensaio da chapa. Os métodos apresentados neste manuscrito são adequados para os investigadores que utilizam sistemas de célula livre extrato com base em Escherichia coli e estão interessados em bacteriófagos.
Os protocolos apresentados neste trabalho podem ser resumidos como segue: amplificação do fago 1) (1 dia: preparar inoculação células, dia 2: única placa, o crescimento do fago, múltiplas e concentração e dia 3: purificação do fago), 2) extração de DNA dupla-hélice do genoma (extração fenol/clorofórmio) e 3) sem célula reação do fago e experimento de título (1 dia: células hospedeiras da placa e fazer placas de ágar, dia 2: reação celular livre e anfitrião de células pré-cultura e dia 3: título de cultura e do fago de célula hospedeiro).

<table width="899">
	<colgroup>
		<col style="width:162pt" width="216" />
		<col style="width:168pt" width="224" />
		<col style="width:219pt" width="292" />
		<col style="width:125pt" width="167" />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:162pt;height:15.75pt" width="216">Ultracentrifugation tubes</td>
			<td class="xl21" style="width:168pt" width="224">Beckman Coulter</td>
			<td class="xl21" style="width:219pt" width="292">344057</td>
			<td class="xl20" style="width:125pt" width="167"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="height:15.75pt">Conical tubes</td>
			<td class="xl22" style="width:168pt" width="224">Falcon</td>
			<td class="xl21">352070</td>
			<td class="xl20"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="height:15.75pt">Gradient maker</td>
			<td class="xl21">BioComp Gradient Master</td>
			<td class="xl22" style="width:219pt" width="292">see Anal Biochem. 1985 Jul;148(1):254-9.</td>
			<td class="xl20"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="height:15.75pt">Syringe and Blunt Cannula</td>
			<td class="xl21">Monoject</td>
			<td class="xl21">8881513918 and 888202017</td>
			<td class="xl20"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="height:15.75pt">Wide-bore pipette tips</td>
			<td class="xl21">Fischerbrand</td>
			<td class="xl21">02-707-134</td>
			<td class="xl20"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="height:15.75pt">Plaque counter</td>
			<td class="xl21">New Brunswik Scientific</td>
			<td class="xl21">Colony Counter Model C-110</td>
			<td class="xl20"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="height:15.75pt">Culture tubes</td>
			<td class="xl22" style="width:168pt" width="224">Fischerbrand</td>
			<td class="xl21">14-961-33</td>
			<td class="xl20"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="height:15.75pt">Cell-free system</td>
			<td class="xl22" style="width:168pt" width="224">Mycroarray Inc</td>
			<td class="xl22" style="width:219pt" width="292">Mytxtl</td>
			<td class="xl20"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl17" height="21" style="width:162pt;height:15.75pt" width="216">BioComp Gradient Master</td>
			<td class="xl17" style="width:168pt" width="224">BioComp Instruments</td>
			<td class="xl17" style="width:219pt" width="292">Model 105ME</td>
			<td class="xl20"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl17" height="21" style="width:162pt;height:15.75pt" width="216">LB agar plate recipe</td>
			<td class="xl20"></td>
			<td class="xl20"></td>
			<td class="xl24" style="width:512pt" width="683">25 g/L Luria-Bertani medium (LB Broth, Miller - Fisher BioReagents product number BP1426) and 15 g/L Bacto-Agar solid (Brenton, Dickenson and Company - product number 214010).</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

synthesis of infectious bacteriophages in an e. coli-based cell-free expression system

Uma nova geração de sistemas sem célula transcrição-tradução (TXTL), projetado para ter uma maior versatilidade e modularidade, fornecer novos recursos para executar ciências básicas e aplicadas em reações de tubo de ensaio. Na última década, sem célula TXTL tornou-se uma técnica poderosa para uma ampla gama de biologia relacionados quantitativa e sintético de pesquisa multidisciplinar romance áreas. As novas plataformas TXTL são particularmente úteis para construir e interrogar os sistemas bioquímicos através da execução de circuitos de gene sintético ou natural. In vitro TXTL provou conveniente rapidamente elementos reguladores do protótipo e redes biológicas, bem como para recapitular molecular auto-montagem mecanismos encontraram em sistemas vivos. Neste artigo, descrevemos como infecciosos bacteriófagos, tais como MS2 (RNA), ΦΧ174 (ssDNA) e T7 (dsDNA), são sintetizados inteiramente do seu genoma em um pot-reações usando um todos Escherichia coli, célula livre sistema TXTL. Síntese dos três coliphages é quantificada utilizando o ensaio da chapa. Mostramos como o rendimento do fago sintetizado depende das configurações bioquímicas das reações. Apinhamento molecular, emulado por uma concentração controlada de PEG 8000, afeta a quantidade de fago sintetizado por ordens de magnitude. Descrevemos também como amplificar os fago e como purificar seus genomas. O conjunto de protocolos e resultados apresentados neste trabalho deve ser de seu interesse multidisciplinares pesquisadores envolvidos em Bioengenharia e biologia sem célula sintética.

Vamos mostrar quatro resultados representativos. Na Figura 1, apresentamos um conjunto de controles negativos para garantir que o sistema TXTL livre de célula e as existências de ADN do fago não estão contaminadas com vivos células de Escherichia coli . Verificamos que o sistema TXTL sem célula é livre de intacto Escherichia coli célula contaminação por chapeamento uma solução não incubados e incubadas reação vazio de DNA gen?...

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Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System

Síntese de bacteriófagos infecciosa em uma e. coli-com base em sistema de expressão livre de célula

Uma nova geração de plataformas de transcrição-tradução livre de célula foi projetada para construir sistemas bioquímicos em vitro através da execução de circuitos de gene. Neste artigo, descrevemos como bacteriófagos, como MS2, ΦΧ174 e T7, são sintetizados a partir de seu genoma usando um Escherichia coli célula livre todos os sistema de TXTL.

A new generation of cell-free transcription-translation (TXTL) systems, engineered to have a greater versatility and modularity, provide novel ...

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