Name: electrophysiological recording from drosophila trichoid sensilla in response to odorants of low volatility
Uploaded: 2017-07-27T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Electrophysiological Recording from Drosophila Trichoid Sensilla in Response to Odorants of Low Volatility at JoVE.com

Agradecemos a Ye Zhang por la ayuda con los trazos de muestra y Tin Ki Tsang por la ayuda con las fotos. Este trabajo fue apoyado por un Premio de carrera temprana de la fundación de Ray Thomas Edwards y una concesión de NIH (R01DC015519) a las concesiones de C.-YS y de NIH (R01DC009597 y R01DK092640) a JWW

1. Preparación del hardware para la grabación de at4 <ol><li> Utilice un instrumento de extracción de pipeta para preparar electrodos con tubos de vidrio de aluminosilicato (OD 1,0 mm, ID 0,64 mm). Blunt la punta del electrodo de referencia ligeramente con un par de pinzas finas para facilitar la inserción en el clypeus de la mosca ( es decir, una placa redondeada en la parte delantera de la cabeza de la mosca, por encima de las partes bucales). NOTA: En este estudio se utilizaron varones WT de 7 d...

<ol>
	<li>Lin, H. -. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hormonal+modulation+of+pheromone+detection+enhances+male+courtship+success.">Hormonal modulation of pheromone detection enhances male courtship success.</a> Neuron. 90 (6), 1272-1285 (2016).</li><li>Hallem, E. A., Carlson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coding+of+odors+by+a+receptor+repertoire.">Coding of odors by a receptor repertoire.</a> Cell. 125 (1), 143-160 (2006).</li><li>Silbering, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complementary+function+and+integrated+wiring+of+the+evolutionarily+distinct+Drosophila+olfactory+subsystems.">Complementary function and integrated wiring of the evolutionarily distinct Drosophila olfactory subsystems.</a> J Neurosci. 31 (38), 13357-13375 (2011).</li><li>Min, S., Ai, M., Shin, S. A., Suh, G. S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dedicated+olfactory+neurons+mediating+attraction+behavior+to+ammonia+and+amines+in+Drosophila.">Dedicated olfactory neurons mediating attraction behavior to ammonia and amines in Drosophila.</a> Proc Nat Acad Sci USA. 110, 1321-1329 (2013).</li><li>Kurtovic, A., Widmer, A., Dickson, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+class+of+olfactory+neurons+mediates+behavioural+responses+to+a+Drosophila+sex+pheromone.">A single class of olfactory neurons mediates behavioural responses to a Drosophila sex pheromone.</a> Nature. 446 (7135), 542-546 (2007).</li><li>Van der Goes van Naters, W., Carlson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptors+and+neurons+for+fly+odors+in+Drosophila.">Receptors and neurons for fly odors in Drosophila.</a> Curr Biol. 17, 606-612 (2007).</li><li>Schlief, M. L., Wilson, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Olfactory+processing+and+behavior+downstream+from+highly+selective+receptor+neurons.">Olfactory processing and behavior downstream from highly selective receptor neurons.</a> Nat Neurosci. 10 (5), 623-630 (2007).</li><li>Laughlin, J. D., Ha, T. S., Jones, D. N. M., Smith, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+Pheromone-sensitive+neurons+is+mediated+by+conformational+activation+of+pheromone-binding+protein.">Activation of Pheromone-sensitive neurons is mediated by conformational activation of pheromone-binding protein.</a> Cell. 133 (7), 1255-1265 (2008).</li><li>Gomez-Diaz, C., Reina, J. H., Cambillau, C., Benton, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligands+for+pheromone-sensing+neurons+are+not+conformationally+activated+odorant+binding+proteins.">Ligands for pheromone-sensing neurons are not conformationally activated odorant binding proteins.</a> PLoS Biol. 11 (4), e1001546 (2013).</li><li>Dweck, H. K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pheromones+mediating+copulation+and+attraction+in+Drosophila.">Pheromones mediating copulation and attraction in Drosophila.</a> Proc Nat Acad USA. 112, 2829-2835 (2015).</li><li>Cappa, C. D., Lovejoy, E. R., Ravishankara, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaporation+rates+and+vapor+pressures+of+the+even-numbered+C8-C18monocarboxylic+acids.">Evaporation rates and vapor pressures of the even-numbered C8-C18monocarboxylic acids.</a> J Phys Chem A. 112 (17), 3959-3964 (2008).</li><li>Kimura, K. -. I., Sato, C., Yamamoto, K., Yamamoto, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+the+back+or+front:+the+courtship+position+is+a+matter+of+smell+and+sight+in+Drosophila+melanogaster+males.">From the back or front: the courtship position is a matter of smell and sight in Drosophila melanogaster males.</a> J Neurogenet. 29 (1), 18-22 (2015).</li><li>Grosjean, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+olfactory+receptor+for+food-derived+odours+promotes+male+courtship+in+Drosophila.">An olfactory receptor for food-derived odours promotes male courtship in Drosophila.</a> Nature. 478 (7368), 236-240 (2011).</li><li>Wang, J. W., Wong, A. M., Flores, J., Vosshall, L. B., Axel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+calcium+imaging+reveals+an+odor-evoked+map+of+activity+in+the+fly+brain.">Two-photon calcium imaging reveals an odor-evoked map of activity in the fly brain.</a> Cell. 112 (2), 271-282 (2003).</li><li>Pellegrino, M., Nakagawa, T., Vosshall, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+sensillum+recordings+in+the+insects+Drosophila+melanogaster+and+Anopheles+gambiae.">Single sensillum recordings in the insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae.</a> J Vis Exp. (36), e1-e5 (2010).</li></ol>

Aquí, se describe un procedimiento por el cual las respuestas de Or47b ORNs a palmitoleic ácido puede ser fuertemente inducida y registrada. Se modificó un método convencional de entrega de olores a larga distancia 2 , 7 , 10 para solucionar el problema de suministro insuficiente de odorante de feromonas. Se abordó la cuestión de la baja volatilidad olorosa mediante la entrega del compuesto a través de cartuchos de olor,...

<html> Los ORNs de Drosophila responden a un gran número de odorantes, con longitudes de cadena de carbono ampliamente extendidas y una variedad de grupos funcionales, incluyendo ésteres, alcoholes, cetonas, lactonas, aldehídos, terpenos, ácidos orgánicos, aminas, compuestos de azufre, heterocíclicos y aromáticos 2 , 3 . Odorantes variados en sus características físico-químicas pueden tener volatilidades marcadamente diferentes, indicadas por la presión de vapor del compuesto. En particular, los odorantes biológicamente relevantes para Drosophila melanogaster difieren enormemente en su volatilidad. Por ejemplo, los ORN de Ir92a responden al amoníaco 4 , que es altamente volátil, con una presión de vapor de 6.432 mmHg a 20 ° C. Por el contrario, Or67d ORNs responden a una feromona masculina, acetato de cis- vinceno ( c VA) 5 , 6 , cuya presión de vapor es de 43 mmHg a 20 ° C. El estudio de la respuesta olfativa a los odorantes de baja volatilidad es particularmente difícil con los métodos convencionales de suministro de olores, en los que los odorizantes se suministran a través de una corriente de aire portadora a una distancia relativamente larga ( es decir, varios centímetros) A un determinado odorante de baja volatilidad puede variar en gran medida, dependiendo del diseño del sistema de suministro de olor.Por ejemplo, la respuesta informada de Or67d ORNs a una dosis alta de c VA oscila entre ~ 40 7 -&gt; 200 picos / s 6 . Además, la entrega ineficaz de c VA con métodos convencionales de entrega es probablemente atribuida a falsos resultados negativos, lo que lleva a la interpretación de que c VA por sí mismo no es suficiente para activar Or67d ORNs 8. Esta interpretación fue más tarde impugnada por otro estudio utilizando un Método de distribución de olores a corta distancia.Desarrollar un robusto sistema de suministro de olores para la presentación eficaz de olorantes de baja volatilidad. Recientemente, identificamos varios ácidos grasos cuticulares de cadena larga como ligandos para los ORN de Or47b. Se alojan en el tipo 4 Antennal Trichoid Sensillum (at4). Entre los odorantes de ácidos grasos de cadena larga, encontramos que el ácido palmitoleico funciona como una feromona afrodisíaca que promueve el cortejo masculino mediante la activación de Or47b ORNs 1 . Sin embargo, en otro estudio utilizando un método de suministro de olor convencional, se demostró que el laurato de metilo induce respuestas de los ORN de Or47b, mientras que el ácido palmitoleico no evoca respuesta cuando se presenta a partir de la misma distancia 10 . En comparación con c VA, los ácidos grasos de cadena larga son aún menos volátiles, con presiones de vapor inferiores a 0,001 mmHg a 25 ° C 11 . La volatilidad inherentemente baja de los odorantes de ácidos grasos de cadena larga, que impide la presentación eficiente a la antena víaConvencional de los sistemas de suministro de olores, probablemente representaron los resultados falsos negativos [ 10] . Esta incoherencia pone de manifiesto la insuficiencia de los sistemas convencionales de suministro de olores al presentar olorantes de baja volatilidad. Anteriormente se demostró que el suministro efectivo de olores cuticulares de mosca requiere una estrecha proximidad entre la fuente de olor y el tejido diana 6 . Por lo tanto, para caracterizar completamente los efectos de las feromonas biológicamente activas mientras mimetiza la distancia desde la cual son probablemente encontrados por las moscas de la fruta en la naturaleza 12 , 13 , acordamos que la distancia mínima debe ser de alta prioridad en nuestro procedimiento. Nuestro método tiene otras ventajas, incluyendo la compatibilidad con equipos y técnicas de electrofisiología estándar. Las configuraciones de equipos preexistentes requieren una modificación mínima para acomodar este protocolo, y la mayoría de los pasos de SSR requieren solo ajustes menores. EstaHace que nuestra técnica sea fácilmente accesible a los investigadores con experiencia en SSR. Además, nuestra técnica permite la presentación de odorantes de baja volatilidad con inicio y desplazamiento agudos, correlacionando el estímulo con la respuesta neuronal. Finalmente, la disposición del hardware facilita los intercambios rápidos entre los cartuchos de olor, acelerando la recopilación de datos sobre un rango de dosificación deseado. Empezaremos por revisar la preparación de los electrodos de referencia y de registro, la solución de hemolinfa tipo adulto (AHL), los cartuchos de suministro de odorantes y el olfatómetro correspondiente. A continuación se discute la preparación de las soluciones odorantes de ácido palmitoleico, seguido por la preparación de la mosca para su registro. Se procede a considerar los criterios para seleccionar un tricloide sensillum para registrar y examinar más de cerca el posicionamiento del cartucho odorante antes de presentar datos representativos adquiridos usando este método. Finalmente, concluimos explorando aplicaciones útiles de esta técnicaUe, algunos problemas encontrados y sus soluciones.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Prep Setup &#38; Miscellaneous Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Puller Instrument&#160;</td>
			<td>Sutter Instruments 
			Novato CA USA</td>
			<td>P97</td>
			<td>Pipette Puller</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate Glass Capillaries</td>
			<td>World Precision Instruments 
			Sarasota FL USA</td>
			<td>1B100F-4</td>
			<td>to make holding rods</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminosilicate Glass Capillaries&#160;</td>
			<td>Sutter Instruments 
			Novato CA USA</td>
			<td>AF100-64-10</td>
			<td>to make electrodes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Microscope Slides</td>
			<td>Fisher Scientific 
			Pittsburgh PA USA</td>
			<td>12-550-143</td>
			<td>for fly-prep station</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permanent Double Sided Tape</td>
			<td>Scotch 
			St. Paul MN USA</td>
			<td>NA</td>
			<td>for fly-prep station</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Upright microscope</td>
			<td>Olympus 
			Shinjuku Tokyo Japan</td>
			<td>BX51</td>
			<td>for recording rig</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastalina modeling clay</td>
			<td>Van Aken 
			North Charleston SC USA</td>
			<td>B0019QZMQQ</td>
			<td>for prep station and to stablize the holding rod</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rapid-Flow Sterile Disposable Filter Unit with SFCA Membrane, 0.45 mm</td>
			<td>Nalgene 
			Rochester NY USA</td>
			<td>#156-4045</td>
			<td>to sterilize AHL solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cartridge Materials</td>
			<td>&#160;&#160;&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#181;L pipette tip&#160;</td>
			<td>VWR 
			Radnor PA USA</td>
			<td>53508-810</td>
			<td>to make odor cartridges and fly prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter Paper</td>
			<td>Whatman 
			Maidstone Kent UK</td>
			<td>740-E</td>
			<td>to make odor cartridges&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Desiccator&#160;</td>
			<td>Cole-Parmer 
			Vernon Hills IL USA</td>
			<td>VX-06514-30</td>
			<td>to vaporize ethanol solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odorant Materials</td>
			<td>&#160;&#160;&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cis-palmitoleic acid</td>
			<td>Cayman Chemical 
			Ann Arbor MI USA</td>
			<td>#10009871 (CAS # 373-49-9)</td>
			<td>Or47b odorant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trans-palmitoleic acid</td>
			<td>Cayman Chemical 
			Ann Arbor MI USA</td>
			<td>#9001798 (CAS # 10030-73-6)</td>
			<td>Or47b odorant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Spectrum Chemical MFG.&#160; 
			New Brunswick NJ USA</td>
			<td>E1028-500MLGL</td>
			<td>to dilute palmitoleic acid&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rig Setup Materials</td>
			<td>&#160;&#160;&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odorant Cartridge Micromanipulator</td>
			<td>Siskiyou 
			Grants Pass OR USA</td>
			<td>MX130R</td>
			<td>to position the olfactometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Vision software&#160;</td>
			<td>Alicat 
			Tuscon AZ USA</td>
			<td>FLOWVISIONSC</td>
			<td>software to control flow rate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mass Controller</td>
			<td>Alicat 
			Tuscon AZ USA</td>
			<td>MC-2SLPM-D</td>
			<td>to control the flow rate for humidified air</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mass Controller</td>
			<td>Alicat 
			Tuscon AZ USA</td>
			<td>MC-500SCCM-D</td>
			<td>to control the flow rate for odor stimulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clampex</td>
			<td>Molecular Devices 
			Sunnyvale CA USA</td>
			<td>Ver. 10.4</td>
			<td>Data acquisition software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Air delivery tube</td>
			<td>Ace Glass 
			Vineland NJ USA</td>
			<td>8802-936&#160;</td>
			<td>to deliver humidified air</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50x objective lens&#160;</td>
			<td>Olympus 
			Shinjuku Tokyo Japan</td>
			<td>LMPLFL50X</td>
			<td>recording rig</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clampfit 10</td>
			<td>Molecular Devices 
			Sunnyvale CA USA</td>
			<td>Ver. 10.4</td>
			<td>software for spike analysis&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Igor Pro 6</td>
			<td>WaveMetrics 
			Lake Oswego OR USA</td>
			<td>Ver. 6.37</td>
			<td>software for data analysis&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Audio Monitor</td>
			<td>ALA Scientific Instruments 
			Farmingdale NY USA</td>
			<td>NPIEXB-AUDIS-08B</td>
			<td>Aurally reports individual spikes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extracellular Amplifier</td>
			<td>ALA Scientific Instruments 
			Farmingdale NY USA</td>
			<td>NPIEXT-02F</td>
			<td>to increase the amplitude of electrical signals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Valve Controller</td>
			<td>Warner Instruments&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>VC-8</td>
			<td>to control the opening of the valve for odor stimulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recording Electrode Micromanipulator</td>
			<td>Sutter Instruments 
			Novato CA USA</td>
			<td>MP-285</td>
			<td>to position recording electrode</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Headstage Amplifier</td>
			<td>ALA Scientific Instruments 
			Farmingdale NY USA</td>
			<td>EQ-16.0008</td>
			<td>to increase the amplitude of electrical signals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oscilloscope</td>
			<td>Tektronix 
			Beaverton OR USA</td>
			<td>TDS2000C</td>
			<td>Visual report of individual spikes</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

electrophysiological recording from drosophila trichoid sensilla in response to odorants of low volatility

Los insectos dependen de su sentido del olfato para guiar una amplia gama de comportamientos que son críticos para su supervivencia, tales como la búsqueda de alimentos, la evitación de depredadores, la oviposición y el apareamiento. Se han identificado innumerables sustancias químicas de diferentes volatilidades como olores naturales que activan las Neuronas de Receptor Olfativas de Insectos (ORN). Sin embargo, el estudio de las respuestas olfativas a los odorizantes de baja volatilidad se ha visto obstaculizado por la incapacidad de presentar eficazmente tales estímulos usando métodos convencionales de suministro de olor. En este sentido, describimos un procedimiento que permite la presentación eficaz de los odorantes de baja volatilidad para la grabación de Sensillum único (SSR) in vivo . Al minimizar la distancia entre la fuente de olor y el tejido diana, este método permite la aplicación de los odorantes biológicamente sobresalientes pero hasta ahora inaccesibles, incluyendo el ácido palmitoleico, una feromona de estimulación con un efecto demostrado sobre ORNs implicados en cortejo y apareamiento comportamiento 1.Nuestro procedimiento proporciona así una nueva vía para analizar una serie de odorantes de baja volatilidad para el estudio de olfato de insectos y la comunicación de feromonas.

Nuestra técnica se aplicó con éxito para determinar la eficacia relativa de los isómeros trans ( Figura 5A ) versus isómeros cis ( Figura 5B ) del ácido palmitoleico. Nuestros datos representativos demuestra que el ácido trans- palmitoléico es un ligando más eficaz para Or47b ORNs en comparación con la cis isoforma ( Figura 5C ]. Se registró una única ...

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Electrophysiological Recording from Drosophila Trichoid Sensilla in Response to Odorants of Low Volatility

El objetivo general de este protocolo es demostrar cómo presentar olorosos de baja volatilidad para el registro de un solo sensor de Drosophila neuronas receptoras olfativas que responden a la cadena larga de feromonas cuticulares.

Registro electrofisiológico de<em&gt; Drosophila</em&gt; Tricoide Sensilla en Respuesta a Odorantes de Baja Volatilidad

Insects rely on their sense of smell to guide a wide range of behaviors that are critical for their survival, such as food-seeking, predator avoidance, ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

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