Name: evaluation of synapse density in hippocampal rodent brain slices
Uploaded: 2017-10-06T14:00:00
Duration: 7 min 44 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Synapse Density in Hippocampal Rodent Brain Slices at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af MRC, EU RP7, ARUK, Wellcome Trust og Parkinsons UK. Vi vil også gerne takke Ms. Johanna Buchler for hendes bidrag af Konfokal billeder og medlemmer af lab for deres konstruktive bidrag på manuskriptet og metodologi.

alle eksperimenter ved hjælp af mus og rotter blev godkendt og udført ved hjælp af skema 1 procedurer omfattet Home Office dyr (videnskabelige procedurer) act 1986. Den kunstige cerebrospinalvæske (ACSF) opskrift kan findes i tabel 1.
 1. akut hippocampus skive forberedelse <ol><li>fjerne musen hjernen så hurtigt som muligt, ved hjælp af en spatel og skarp saks til at klippe kraniet, og placere den i iskold, iltet (95% O 2, 5% CO 2), høj-saccharose ACSF (~ 100 mL).</li>
	<li>Placerer musen hjernen på en petriskål og fjerner lillehjernen og en lille del af den frontale cortex med en skalpel før hemisecting ned med midterlinjen af hjernen.</li>
	<li>Placere de to hjernehalvdele på den side, der var bare klip og lim hver halvkugle på scenen af en vibratome.</li>
	<li>Skære 200-300 µm-tykke dele af den komplette region af interesse. I tilfælde af hippocampus, ca 3-4 skiver pr. halvkugle bør opnås.</li>
	<li>Ved hjælp af en plastik Pasteur pipette, overføre skiver til et kammer neddykket i iltet (95% O 2, 5% CO 2) ACSF. Vedligehold på 34 ° C i 30 min. 
	Bemærk: Behandling af skiver med aktive farmakologiske stoffer, såsom rekombinant Dkk1 proteiner, kan udføres på dette tidspunkt ved at tilføje agenter til skive afdeling.</li>
	<li>Fjerne skiver fra kammeret ved hjælp af et paintbrush, placere dem i en 24-godt plade og fix i 20 min. til 1 time i 4% PARAFORMALDEHYD (PFA)/4% saccharose ved stuetemperatur (RT). 
	Forsigtig: PFA er giftigt, bære passende beskyttelse.</li>
	<li>Vask skiver tre gange i 1 X PBS (10 min). 
	Bemærk: Protokollen kan være midlertidigt her for 1-2 dage, så længe skiverne opbevares ved 4 ° C i 1 X PBS.</li>
</ol> 2. Immunfluorescens for Synaptic markører Bemærk: opskrifter på alle buffere anvendes kan findes i tabel 2.
<ol><li>Erstatte PBS med blokering/permeabilizing buffer (tabel 2) i Skive brønde og Inkuber på RT for 4-6 h.</li>
	<li>Fortyndes polyklonale marsvin antistof mod vGlut1 på en 1:2,000 fortynding i blokerer/permeabilization buffer. 
	Bemærk: vGlut1 er en markør for pre synaptic excitatoriske terminal visualisering. For post synaptic excitatoriske synapse identifikation, bruge en polyklonale antistof mod PSD-95 og fortyndet 1: 500 i samme løsning. Bruge en mindstemængde af 300 µL i hver brønd. Du kan identificere den anatomiske placering af hippocampus, bruge et antistof, der kan også identificere de neuronale struktur, såsom MAP2 eller Tubulin. Træne de korrekte koncentrationer af alle primære antistoffer til de synaptiske markører af valg (præ- og post synaptic) og fortyndes i frisk blokerer/permeabilizing buffer.</li>
	<li>Inkuberes skiver i den primære antistof løsning natten over (eller i 1-2 dage) ved 4 ° C. Brug en rystende platform med kraftig bevægelse.</li>
	<li>Vask skiver tre gange i PBS (10 min).</li>
	<li>Fortyndes passende sekundære antistoffer 1: 500 i blokerende buffer. For eksempel, når du bruger vGlut1 marsvin antistof, anvende en sekundær antistof, der genkender komponenten marsvin (fx æsel anti-guinea-svin) konjugeret med et bestemt fluorophore. Når du bruger PSD-95 kanin antistof, anvende en sekundær antistof, der genkender komponenten kanin (fx æsel anti-kanin) konjugeret med et forskellige specifikke fluorophore.</li>
	<li>Ruger skiver i denne opløsning i 2-3 timer ved RT. sikre at skiverne er beskyttet mod lyset, som sekundære antistoffer er lysfølsomt.</li>
	<li>Vask skiver tre gange i PBS (10 min).</li>
	<li>Forsigtigt fjerne skiver fra 24-godt pladen ved hjælp af et paintbrush og placere dem jævnt på forud mærket glas lysbilleder. Tilføj en dråbe af montering medium oven på hver skive og derefter forsigtigt placere et glas coverslip oven på skiver. Undgå dannelsen af luftbobler. Sørge for at bruge nok montering medium (300-400 µL), som en utilstrækkelig mængde kan føre til tørt skiver.</li>
	<li>Lad det tørre i mindst 1-2 dage på RT og holde de dias, beskyttet mod lys.</li>
	<li>Gemme dias ved 4 ° C på kort sigt, men til langtidsopbevaring, holde dem på -20 ° C.</li>
</ol> 3. Konfokal billede erhvervelse og analyse <ol><li>Imaging ved hjælp af Konfokal laser scanning mikroskopi.
	<ol><li>Identificere regionen i hippocampus til afbildning (fx cornu ammonis 1 og 3 (CA1, CA3) eller den dentate gyrus (GD)) ved hjælp af en 10 x eller 20 x mål.</li>
		<li>Ændring på en 40 x eller 63 x oliebestan mål for at sikre den skive anatomi er intakt ved at identificere løbende neurites og organiseret struktur. Brug en neuronal markør, såsom MAP2, som reference ( figur 1A).</li>
		<li>Efterfølgende, skifte til en 60 x oliebestan mål (NA = ~1.3 - 1.4) og justere indstillingerne for hver kanal for at få optimale signal og kontrast. Angive intensiteten på hver laser til at undgå mætningen af alle pixel ved hjælp af en høj / lav kontrast indstilling. 
		Bemærk: Disse indstilling vil afhænge af mikroskop bruges, men henvise til Bordet af materialer til laser power-indstillinger anvendes i figur 2, figur 3, og Figur 4. For de bedste resultater, skal du bruge en 1024 x 1024-pixel opløsning. Indstillingerne skal forblive konstant gennem de forskellige forhold i den samme eksperiment. Yderligere zoom kan anvendes, hvis det kræves.</li>
		<li>Vurdere dybde hvor farvning er selv og erhverve billedstakke af mindst 8 ækvidistante (250 nm) fly. Derefter tage 3 tilstødende repræsentative billeder stakke fra samme område af interesse pr. skive. 
		Bemærk: Dybde kan variere fra ét udsnit til en anden men bør altid være ca 2-5 µm fra overfladen af udsnittet.</li>
		<li>Gentage erhvervelse i mindst 3 skiver pr. betingelse og fra 6-8 dyr pr. behandling gruppe.</li>
	</ol></li> <li>Billede analyse. 
	Bemærk: Brug en automatiseret billede analyse software (Se Tabel af materialer). Bemærk, at nogle systemer kræver en licens, mens andre er fri, såsom ImageJ. Den anvendte software skal analysere billeder i 3D under hensyntagen til alle fly i stakken afbildet. Henvises til Tabel af materialer til detaljer i den programmel anvendte i billedanalyse ( figur 1).
	<ol><li>Brug en custom-baseret intensitet tærskel protokol til at identificere alle synaptic puncta og neuronal markører, der manuelt er optimeret og valgt i softwaren [Se Tabel af materialer til den specifikke software, der anvendes i dette protokol]. 
		Bemærk: Softwaren identificerer en minimums- og intensitet for hver fluorophore og knytter en procentdel af intensitet for hver anerkendte objekt. Bemærk, at procentdelen af intensiteten vil variere afhængigt af fluorophore anvendes og antistof mod den synaptiske markør.</li>
		<li>For synaptic markører, sikre at størrelse filtre (&#62; 0.1µm 3 og &#60; 0.8µm 3) er valgt i softwaren og anvendt på billedet. Justere parametre for at sikre, at de markerede objekter ikke er overlappende. Udelukke ethvert objekt, der er for stor eller for lille til at blive betragtet som synaptic puncta (Se figur 2B). 
		Bemærk: Når optimeret, de samme tærskelværdier er derefter anvendt på alle billeder inden for en given eksperiment.</li>
		<li>Kvantificere gennemsnitlige antal, intensitet og omfanget af individuelle synaptic puncta (præ- eller post synaptic) ved hjælp af optimeret tærskel protokoller valgt i softwaren. Normalisere puncta antallet til omfanget af billedfeltet (groft 16,928 µm 3 i systemet bruges her). Normalisere synaptiske puncta intensitet til intensiteten af reference neuronal markør. 
		Bemærk: Synapser er defineret som co lokaliseringen mellem både præ- og post synaptic markører. Når tærsklen protokoller for præ- og post synaptic puncta hAve blevet etableret, softwaren skal identificere Co lokaliseringen af synaptic puncta som overlapning af 1 pixel eller mere i et enkelt fly. 
		Bemærk: For statistisk analyse, Bekræft, at alle serier proeveemner følger normalitet og homogenitet af varians, som bestemmes af Lilliefords og χ2-test, henholdsvis. Prøver viser en normalfordeling og homogenitet af afvigelse skal analyseres med parametrisk test, som beskrevet nedenfor. For eksempel bør excitatoriske synaptic puncta analyse udføres ved hjælp af en en-vejs ANOVA med blokering og replikering. Hver enkelt eksperiment bør betragtes som en blok; der er typisk tre uafhængige eksperimenter, hver med 1-3 mus fra hver tilstand.</li>
	</ol></li></ol> <img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56153/56153fig1.jpg" /> figur 1: analyse af synaptic puncta ved hjælp af billedanalyse software. (A) Screenshot af intensitet tærskel protokol tilpasning. Eksemplet er for PSD-95, hvor den valgte puncta har en defineret størrelse af &#62; 0,1 µm 3 og &#60; 0,8 µm 3 og nuværende minimeret overlappende objekter. Bemærk, at billedet vist for en Konfokal fly at aktivere lettere visualisering af synaptic puncta og nøjagtige parameter valg. (B) Screenshot af analysen output fra programmet (efter udvælgelsen af den optimerede protokol). Et eksempel på rå synaptic puncta antal målinger baseret på volumen. Disse værdier er derefter eksporteres til et regneark software. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56153/56153fig1large.jpg" target="_blank"> venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
 <img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56153/56153fig2.jpg" /> figur 2: kvalitet check af skive og parameter indstillinger for synaptic puncta. (A) repræsentative Konfokal billeder (40 x mål) for det pågældende område: CA1 stratum radiatum (sr) og stratum oriens (så) af en hippocampus skive identificeres ved MAP2 farvning. Skalalinjen = 2 µm. (B) Konfokal billeder (60 x mål og en yderligere 1,3 X forstørrelse på erhvervelse software) i CA1 stratum radiatum, med excitatoriske markører-vGlut1 (grøn) og PSD-95 (rød)-fra hippocampus skiver. Bemærk identifikation af klare præ- og post synaptic puncta. Puncta større end 0,8 µm 3 er udelukket fra kvantificering (hvide pile). Skalalinjen = 2 µm (C) Confocal billeder (60 x mål og en yderligere 1,3 X forstørrelse på erhvervelse software) i CA1 stratum radiatum, med excitatoriske markører-vGlut1 (grøn)-fra kryostaterne-cut hippocampus sektioner fra hele hjerner fast i PFA. Bemærk tilstedeværelsen af store huller og uregelmæssige, klumpet vGlut1 farvning. Skalalinjen = 2 µm. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56153/56153fig2large.jpg" target="_blank"> venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>

<ol>
	<li>Malenka, R. C., Bear, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LTP+and+LTD:+an+embarrassment+of+riches.">LTP and LTD: an embarrassment of riches.</a> Neuron. 44 (1), 5-21 (2004).</li><li>Arendt, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+degeneration+in+Alzheimer's+disease.">Synaptic degeneration in Alzheimer's disease.</a> Acta Neuropathol. 118 (1), 167-179 (2009).</li><li>Missler, M., Sudhof, T. C., Biederer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+cell+adhesion.">Synaptic cell adhesion.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 4 (4), a005694 (2012).</li><li>Chua, J. J., Kindler, S., Boyken, J., Jahn, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+architecture+of+an+excitatory+synapse.">The architecture of an excitatory synapse.</a> J Cell Sci. 123 (Pt 6), 819-823 (2010).</li><li>Dobie, F. A., Craig, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitory+synapse+dynamics:+coordinated+presynaptic+and+postsynaptic+mobility+and+the+major+contribution+of+recycled+vesicles+to+new+synapse+formation.">Inhibitory synapse dynamics: coordinated presynaptic and postsynaptic mobility and the major contribution of recycled vesicles to new synapse formation.</a> J Neurosci. 31 (29), 10481-10493 (2011).</li><li>Jackson, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+tau+increases+amyloid+beta+plaque+size+but+not+amyloid+beta-mediated+synapse+loss+in+a+novel+mouse+model+of+Alzheimer's+disease.">Human tau increases amyloid beta plaque size but not amyloid beta-mediated synapse loss in a novel mouse model of Alzheimer's disease.</a> Eur J Neurosci. 44 (12), 3056-3066 (2016).</li><li>Heck, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+automated+3D+detection+of+synaptic+contacts+reveals+the+formation+of+cortico-striatal+synapses+upon+cocaine+treatment+in+vivo.">A new automated 3D detection of synaptic contacts reveals the formation of cortico-striatal synapses upon cocaine treatment in vivo.</a> Brain Struct Funct. 220 (5), 2953-2966 (2015).</li><li>Sultana, R., Banks, W. A., Butterfield, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decreased+levels+of+PSD95+and+two+associated+proteins+and+increased+levels+of+BCl2+and+caspase+3+in+hippocampus+from+subjects+with+amnestic+mild+cognitive+impairment:+Insights+into+their+potential+roles+for+loss+of+synapses+and+memory,+accumulation+of+Abeta,+and+neurodegeneration+in+a+prodromal+stage+of+Alzheimer's+disease.">Decreased levels of PSD95 and two associated proteins and increased levels of BCl2 and caspase 3 in hippocampus from subjects with amnestic mild cognitive impairment: Insights into their potential roles for loss of synapses and memory, accumulation of Abeta, and neurodegeneration in a prodromal stage of Alzheimer's disease.</a> J Neurosci Res. 88 (3), 469-477 (2010).</li><li>Harwell, C. S., Coleman, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptophysin+depletion+and+intraneuronal+Abeta+in+organotypic+hippocampal+slice+cultures+from+huAPP+transgenic+mice.">Synaptophysin depletion and intraneuronal Abeta in organotypic hippocampal slice cultures from huAPP transgenic mice.</a> Mol Neurodegener. 11 (1), 44 (2016).</li><li>Marzo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversal+of+Synapse+Degeneration+by+Restoring+Wnt+Signaling+in+the+Adult+Hippocampus.">Reversal of Synapse Degeneration by Restoring Wnt Signaling in the Adult Hippocampus.</a> Curr Biol. 26 (19), 2551-2561 (2016).</li><li>Zoghbi, H. Y., Bear, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+dysfunction+in+neurodevelopmental+disorders+associated+with+autism+and+intellectual+disabilities.">Synaptic dysfunction in neurodevelopmental disorders associated with autism and intellectual disabilities.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 4 (3), (2012).</li><li>Janezic, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deficits+in+dopaminergic+transmission+precede+neuron+loss+and+dysfunction+in+a+new+Parkinson+model.">Deficits in dopaminergic transmission precede neuron loss and dysfunction in a new Parkinson model.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (42), E4016-E4025 (2013).</li><li>Caricasole, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+Dickkopf-1,+a+negative+modulator+of+the+Wnt+pathway,+is+associated+with+neuronal+degeneration+in+Alzheimer's+brain.">Induction of Dickkopf-1, a negative modulator of the Wnt pathway, is associated with neuronal degeneration in Alzheimer's brain.</a> J Neurosci. 24 (26), 6021-6027 (2004).</li><li>De Ferrari, G. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Common+genetic+variation+within+the+low-density+lipoprotein+receptor-related+protein+6+and+late-onset+Alzheimer's+disease.">Common genetic variation within the low-density lipoprotein receptor-related protein 6 and late-onset Alzheimer's disease.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (22), 9434-9439 (2007).</li><li>Liu, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deficiency+in+LRP6-mediated+Wnt+signaling+contributes+to+synaptic+abnormalities+and+amyloid+pathology+in+Alzheimer's+disease.">Deficiency in LRP6-mediated Wnt signaling contributes to synaptic abnormalities and amyloid pathology in Alzheimer's disease.</a> Neuron. 84 (1), 63-77 (2014).</li><li>Purro, S. A., Dickins, E. M., Salinas, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Secreted+Wnt+Antagonist+Dickkopf-1+Is+Required+for+Amyloid+beta-Mediated+Synaptic+Loss.">The Secreted Wnt Antagonist Dickkopf-1 Is Required for Amyloid beta-Mediated Synaptic Loss.</a> J Neurosci. 32 (10), 3492-3498 (2012).</li><li>Rosi, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+Dickkopf-1+expression+in+transgenic+mouse+models+of+neurodegenerative+disease.">Increased Dickkopf-1 expression in transgenic mouse models of neurodegenerative disease.</a> J Neurochem. 112 (6), 1539-1551 (2010).</li><li>Budnik, V., Salinas, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+signaling+during+synaptic+development+and+plasticity.">Wnt signaling during synaptic development and plasticity.</a> Curr Opin Neurobiol. 21 (1), 151-159 (2011).</li><li>Ciani, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+signalling+tunes+neurotransmitter+release+by+directly+targeting+Synaptotagmin-1.">Wnt signalling tunes neurotransmitter release by directly targeting Synaptotagmin-1.</a> Nat Commun. 6, 8302 (2015).</li><li>Dickins, E. M., Salinas, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnts+in+action:+from+synapse+formation+to+synaptic+maintenance.">Wnts in action: from synapse formation to synaptic maintenance.</a> Front Cell Neurosci. 7, 162 (2013).</li><li>Inestrosa, N. C., Varela-Nallar, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+signalling+in+neuronal+differentiation+and+development.">Wnt signalling in neuronal differentiation and development.</a> Cell Tissue Res. 359 (1), 215-223 (2015).</li><li>Galli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deficient+Wnt+signalling+triggers+striatal+synaptic+degeneration+and+impaired+motor+behaviour+in+adult+mice.">Deficient Wnt signalling triggers striatal synaptic degeneration and impaired motor behaviour in adult mice.</a> Nat Commun. 5, 4992 (2014).</li></ol>

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Den præcise vurdering af synapse antallet er afgørende inden for neuroscience. Her viser vi hvordan du evaluere tæthed af synapser i regionen CA1 stratum radiatum af hippocampus skiver som et modelsystem. Betydning med hensyn til eksisterende metoder er demonstreret i vores seneste forskning artikel om effekten af Wnt mangel i hippocampus, og hvor vi også evalueret synapse antallet af single-afsnit EM10. Omfanget af synapse tab er ens mellem single-sektion EM og hjerne-skive metode beskrevet her10. Således, denne konstatering viser nøjagtigheden og pålideligheden af teknikken.
Vigtigere, er en begrænsning af både single-sektion EM og immunfarvning synapser, som præsenteres her, den manglende evne til at præcist skøn absolutte synapse antallet for en bestemt hjerne region. Ja, det er vigtigt at identificere globale morfologiske ændringer, som ændringer i samlede volumen kan påvirke synaptic nummer. En anden begrænsning er, at visse antistoffer er mindre effektive på farvning intakt hjerneregioner, delvist på grund af de ekstrem tæthed af synaptiske forbindelser. Vi har oplevet højere kvalitet farvning af vGlut1 og gephyrin ved hjælp af denne skive forberedelse og efterfølgende PFA fiksering til et maksimum på 1 h, i forhold til øjeblikkelig fiksering af hele hjernen i PFA (figur 2 c). Denne førte til klumpet synaptic farvning, med huller i vævet. VGlut1 antistof penetration er dog stadig begrænset i begge metoder (et par snese mikron). Vi overvinde ikke denne begrænsning, selv med øget antistof inkubation, men giver antistof penetration er større end den samlede dybde, der er afbildet, bør der ingen indflydelse på det endelige resultat. Endvidere bør særlige pleje tages til at sikre, at farvning er endda hele hele erhvervet stakken.
I vores undersøgelse ønskede vi at skelne excitatoriske fra hæmmende synapser. Derfor valgte vi vGlut1/PSD-95 og vGAT/gephyrin, henholdsvis, da disse proteiner er stærkt udtrykt i voksen mus hippocampus og er specifikke for hver synapse subtype4,5. Andre excitatoriske og hæmmende synaptic markører kunne have været brugt til at identificere hver respektive synapse, som receptorer beriget på hver synapse, herunder NMDA og AMPA-receptorer for excitatoriske og GABAA-receptorer for hæmmende synapser. Andre neurotransmittere eller neuromodulators kan også identificeres med vores protokol, sikrer, at specifikke antistoffer er tilgængelig, som vist for dopaminerge synapser i striatum22. Derudover kan at reducere tykkelsen af hver skive til 120 µm delvist overvinde det lave antal prøver med akut skiver, som er afgørende for studier i lille hjernestrukturer såsom amygdala.
Fremtidige anvendelser af vores protokollen kunne gennemføres i studiet af forskellige hjernen områder og lidelser. For eksempel i striatum (en region af hjernen er forbundet med Parkinsons sygdom), kan en kombination af vGlut2/PSD-95 eller vGlut1/PSD-95 bruges til at skelne mellem excitatoriske synapser fra afferenter fra cortex eller thalamus, henholdsvis22.
Afslutningsvis har vi vist en pålidelig metode til at undersøge antallet af synapser i hjernen væv ved hjælp af præ- og post synaptic markører til at definere en synapse. Kritiske trin omfatter forberedelse af god hippocampus skiver, gangen fiksering af op til 1 time i PFA, anvendelsen af nok montering medium, brugen af pålidelige antistoffer, passende billede erhvervelse indstillinger og strenge synaptic puncta påvisning. I sidste ende, denne metode er relativt hurtigt og er let at reproducere af alle laboratorier, der har adgang til en Konfokal mikroskop.

Den menneskelige hjerne består af ca 1014 synapser. Synapse antallet er stramt reguleret under udvikling og modning af det centrale nervesystem (CNS). I hele udvikling, synapse antallet moduleres af synaptogenesis og beskæring til at danne funktionelle neuronal netværk. Indlæring og hukommelse understøttes af reguleringen af synapse antallet og styrke, en proces kendt som synaptic potensering og depression1. Vigtigere, er stabilisering af modne synapser afgørende for at opretholde neuronal netværk slægtskaber. Endvidere er underskud i synapse tæthed blevet rapporteret i de tidlige faser af neurodegenerative sygdomme som Alzheimers sygdom (AD)2. Derfor er evne til præcist at identificere og evaluere synapse antallet fundamental for vurderingen af hjernens fysiologi og patologi.
Ekstrem tæthed og kompakte karakter af synapser gøre det udfordrende for at vurdere deres præcise tal i intakt hjernen områder. Kemiske synapser i CNS er lavet af to neuroner i tæt anbringelsen, adskilt af en synaptiske kløft3. Pre synaptic terminal, eller synaptic bouton, tappes fra en axon og består af akkumulerede blærer, der indeholder neurotransmittere, der definerer specificiteten af en synapse — nemlig glutamat og gamma - aminosmørsyre (GABA) for excitatoriske og hæmmende synapser, henholdsvis. Membraner i vesikler indeholder vesikulære transportvirksomheder specifikke for hver neurotransmitter: vesikulære glutamat transporter (vGlut) for glutamat og vesikulære GABA transporter (vGAT) til GABA. Den post synaptic terminal er en meget tæt struktur, der består af flere proteiner, herunder receptorer, adhæsionsmolekyler, og stillads proteiner. I ophidsende synapser er post synaptic tæthed-95 protein (PSD-95) den mest rigelige stillads protein4, modulerende excitatoriske N-methyl-D-aspartate(NMDA-) og α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic syre (AMPA-) receptor funktion, der henviser til, at gephyrin ankre hæmmende receptorer til den hæmmende post synaptic terminal5. Samlet set specificiteten af proteiner til præ- og post synaptic rum støtte i differentiering og identifikation af synapse undertyper.
Evaluering af synapse antallet kan udføres med forskellige teknikker. Den mest almindelige er anvendelsen af elektronmikroskopi (EM), som muliggør analysen af synapse i kompakt og intakt hjernen områder med høj forstørrelse og opløsning. Dog, denne teknik er meget dyrt, kræver kompliceret prøveforberedelse, og er meget tidskrævende. Andre teknikker omfatter brugen af array tomografi6, som har en stor ulempe i, at det kræver specialiserede og dyre udstyr til at udføre analysen. Derudover transgene linjer udtrykker specifikke synaptic markører er nyttig ved vurdering synapse nummer7, men generation af nye linjer kan være restriktive og dyre, og overekspression af proteiner kan resultere i uønskede off-mål fænotyper.
På grund af disse begrænsninger og enkelhed evaluere mange forskere synapse antallet ved at undersøge samlede synaptic protein niveauer. Men synapse tab kan konstateres før væsentlige ændringer i protein, som strukturelle synaptisk remodellering resultater i spredning af præ- eller post synaptic anbringelsen, med ingen forringelse af synaptic proteiner. Derudover i Annoncen er synaptic protein niveauer nedsat følgende synapse degeneration eller neuronal død8,9. Kvantificering af samlede niveauer giver ikke denne skelnen. Der er således behov for at udvikle en pålidelig, tilgængelig og præcis metode til evaluering af synapse antallet i hjernen.
I denne artikel vil beskrive vi sådan grundigt identificere og bestemme antallet af synapser med immunofluorescens mikroskopi i hippocampus gnaver hjernen skiver. Synapser er defineret af colocalization før og efter synaptic markører, der vises i en punktformet fordelingen. Vi påvise gyldigheden af denne teknik gennem studier af Wnt signalering i hjernen. Wnts er udskilles proteiner betydning for dannelse, fjernelse og vedligeholdelse af synapser. I vivo induktion af en udskilles antagonist af Wnt cascade, Dickkopf-1 (Dkk1), fører til excitatoriske synaptic tab samtidig bevare hæmmende synapser i hippocampus10. Vi illustrere identifikation og tælling af excitatoriske og hæmmende synapser i hippocampus skiver fra en voksen mus udtrykker Dkk1 og fremhæve overførsel af denne teknik til andre typer væv/kultur præparater.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>VT1000S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB5905</td>
			<td>vGlut1 (1:2000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibody</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>MA1-046</td>
			<td>PSD-95 (1:500)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibody</td>
			<td>Synaptic Systems</td>
			<td>131 004</td>
			<td>vGAT (1:500)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibody</td>
			<td>Synaptic Systems</td>
			<td>147011</td>
			<td>Gephyrin (1:500)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab5392</td>
			<td>MAP2 (1:10000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibody</td>
			<td>Jackson Laboratories</td>
			<td>706-545-148</td>
			<td>Donkey Anti-Guinea Pig Alexa Fluor 488 (1:600)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab175470</td>
			<td>Donkey Anti-Rabbit Alexa Fluor 568 (1:600)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting medium</td>
			<td>SouthernBiotech</td>
			<td>00-4958-02</td>
			<td>Fluoromount-G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>NA</td>
			<td>FV1000 confocal microscope using a 60x 1.35 numerical aperture (NA) oil objective. For vGlut1, use a 488 laser with a percentage power of 14%. For PSD-95 use a 559 laser with a percentage power of 20%.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analysis software</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>NA</td>
			<td>Volocity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>Swann-Morton</td>
			<td>203</td>
			<td>No 11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super Glue</td>
			<td>Loctite</td>
			<td>1446875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>95% O2, 5% CO2</td>
			<td>BOC</td>
			<td>NA</td>
			<td>Cylinder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>7107</td>
			<td>08-1.0mm thick</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iDkk1 mice</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Mice were obtained by crossing tetO Dkk1 transgenic mice with CaMKII&#945; rtTA2 transgenic mice. TetO Dkk1 transgenic mice and CaMKII&#945; rtTA2 were crossed in a heterozygous state. Both mouse lines were bred in a C57BL/6J background. Single transgenic and WT littermate were used as controls.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents for solutions:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>V800372</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>255793</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ca2Cl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>223506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mg2Cl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M9272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>71505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kynurenic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>K3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>107360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E6758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey Serum</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>S30-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of synapse density in hippocampal rodent brain slices

I hjernen er synapser specialiserede kryds mellem neuroner, bestemmelse af styrke og spredning af neuronal signalering. Antallet af synapser er stramt reguleret under udvikling og neuronal modning. Vigtigere, kan underskud i synapse antallet føre til kognitiv dysfunktion. Derfor, evaluering af synapse nummer er en integreret del af neurobiologi. Men som synapser er lille og meget kompakt i intakt hjernen, vurdering af absolutte antal er udfordrende. Denne protokol beskriver en metode til nemt at identificere og evaluere synapser i hippocampus gnaver skiver bruger immunofluorescens mikroskopi. Det omfatter en tre-trins procedure for at evaluere synapser i høj kvalitet Konfokal mikroskopi billeder ved at analysere Co lokaliseringen af præ- og postsynaptiske proteiner i hippocampus skiver. Det forklarer også, hvordan analysen udføres og giver repræsentative eksempler fra både excitatoriske og hæmmende synapser. Denne protokol giver et solidt fundament for analyse af synapser og kan anvendes til forskning undersøger strukturen og funktionen af hjernen.

Synapse tab opstår tidligt i neurodegenerative sygdomme som AD og Parkinsons sygdom2,11,12. Men de molekylære mekanismer bag disse underskud forbliver dårligt forstået. Mangler i Wnt signalering har været forbundet med AD13,14,15,16,17. Wnts er udskilles glykoproteiner og spiller en vigtig rolle i synapse dannelse og graduering af synaptisk transmission18,19,20,21. For nylig har identificeret vi Wnts som centrale regulatorer af synaptic vedligeholdelse i den modne nervesystem10,22. Du kan præcist studere virkningen af Wnt signalering på synapser i hippocampus af genmodificerede mus, tog vi fordel af en hjerne skive forberedelse og konfokal mikroskopi til at vurdere ændringer i synapse nummer. Vi identificerede sund skiver, hvor strukturen var godt bevaret (figur 2A). Desuden var udvælgelse af synaptic puncta nøje defineret, med udelukkelse af store farvede objekter sandsynligvis repræsenterer aggregerede proteiner (figur 2B). Dette kriterium blev anvendt til alle billeder, med de samme strenge analyseparametre.
Vi brugte en transgene modelsystem, der inducerer udtryk af udskilles Wnt antagonist Dkk1 i voksen mus (iDkk1) under tetracyklin kontrol (Se Tabel af materialer)10,22. Vi viste, at blokaden af Wnt signalering i voksen hippocampus udløser excitatoriske synapse tab specifikt i CA1 stratum radiatum region (figur 3). Figur 3A illustrerer repræsentative Konfokal billeder af excitatoriske pre og post synaptic markører (vGlut1 og PSD-95, henholdsvis) erhvervet fra hippocampus skiver af iDkk1 mus udtrykker Dkk1 for to uger, samt deres respektive kontrol. Vi analyserede disse billeder ved hjælp af Volocity software og viste en betydelig reduktion i antallet af ophidsende synapser, kvantificeres ved fælles lokalisering af vGlut1 - og PSD-95-mærket puncta i regionen CA1 hippocampus af iDkk1 mus efter den Induktion af Dkk1 for to uger (figur 3B, * p &#60; 0,05; Kruskal-Wallis test; 6 mus pr. genotype). I CA1 stratum radiatum, blev excitatoriske synapse puncta antallet pr. 1.000 µm3 reduceret fra 500 i kontrol mus til 300 i iDkk1 mus. Derimod induceret Dkk1 udtryk påvirkede ikke antallet af hæmmende synapser (identificeret af co lokaliseringen mellem præ- og post synaptic markører vGAT og gephyrin, henholdsvis), som vist i figur 4A-B (p &#62; 0,05; Kruskal-Wallis test; 3 mus pr. genotype).
Vigtigere, udførte vi en statistisk power analyse for at beregne den passende antal skiver og dyr kræves for at generere disse robuste resultater. Ved hjælp af R vi beregnes at ca. 35 skiver pr. betingelse var nødvendigt (3 billeder x 3 skiver x 6 dyr = 36) til at registrere en stor effekt størrelse (f = 0,4) med 80% sikkerhed (power = 0,8) i en en-vejs ANOVA med blokering og replikation, som beskrevet i trin 3.2.6.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56153/56153fig3.jpg"> 
Figur 3: tab af ophidsende synapser i hippocampus udsnit fra iDkk1 mus. (A) repræsentative Konfokal billeder af CA1 stratum radiatum Vis ophidsende synapser, identificeres ved co lokalisering mellem vGlut1 og PSD-95 (hvide pile). Nederste panel repræsenterer en højere forstørrelse af det markerede rektangel. Skalere barer = 2 µm. (B) procentdelen af ophidsende synapser mellem kontrol og iDkk1 var kvantificeres ved hjælp af software nævnt i Tabel af materialer (* p &#60; 0,05; Kruskal-Wallis test; 6 mus pr. genotype). Dataene er repræsenteret ± SEM. Dette tal er blevet ændret fra reference10. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56153/56153fig3large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56153/56153fig4.jpg"> 
Figur 4: hæmmende synapser er uændret i hippocampus udsnit fra iDkk1 mus. (A) repræsentative Konfokal billeder af CA1 stratum radiatum i hæmmende synapser identificeres ved co lokalisering mellem vGAT og gephyrin (hvide pile). Nederste panel repræsenterer en højere forstørrelse af det markerede rektangel. Skalere barer = 2 µm. (B) procentdel af hæmmende synapser mellem kontrol og iDkk1 mus, som kvantificeres ved hjælp af Volocity software (p &#62; 0,05; Kruskal-Wallis test; 3 mus pr. genotype). Dataene er repræsenteret ± SEM. Dette tal er blevet ændret fra reference10. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56153/56153fig4large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>High saccharose ACSF komponenter</td>
			<td>Koncentration</td>
			<td>Noter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>75 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>25 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>2,5 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4, 2 H2O</td>
			<td>1,25 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kynurenic syre</td>
			<td>1,25 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrodruesyre syre</td>
			<td>2 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>0,1 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>1 mM</td>
			<td>Tilføje efter iltning af løsning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>4 mM</td>
			<td>Tilføje efter iltning af løsning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glukose</td>
			<td>25 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saccharose</td>
			<td>100 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Undersøiske kammer ACSF komponenter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>125 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>25 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>2,5 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4, 2 H2O</td>
			<td>1,25 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>1 mM</td>
			<td>Tilføje efter iltning af løsning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
</tr></tbody></table>			<td>1 mM</td>
			<td>Tilføje efter iltning af løsning</td>
		
		<tr>
			<td>D-glukose</td>
			<td>25 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
	

Tabel 1: ACSF sammensætning.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Blokerer/permeabilizing Buffer</td>
			<td>Koncentration</td>
			<td>Noter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Æsel serum</td>
			<td>10%</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X</td>
			<td>0,50%</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>1 x</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 x PBS</td>
			<td></td>
			<td>pH til 7,4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>1,37 M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>27 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>100 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>18 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% PFA/4% saccharose</td>
			<td></td>
			<td>pH til 7,4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>1 x</td>
			<td>Fortynd fra 10 x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFA</td>
			<td>1.33 M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saccharose</td>
			<td>117 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabel 2: Buffere anvendes til immunfluorescent farvning.

Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Synapse Density in Hippocampal Rodent Brain Slices at JoVE.com

Evaluation of Synapse Density in Hippocampal Rodent Brain Slices

En protokol til præcist at identificere og analysere synapser i hippocampus skiver bruger immunofluorescens er beskrevet i denne artikel.

Evaluering af Synapse tæthed i hippocampus gnaver hjernen skiver

In the brain, synapses are specialized junctions between neurons, determining the strength and spread of neuronal signaling. The number of synapses is ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Preparation of Oligomeric &beta;-amyloid1-42 and Induction of Synaptic Plasticity Impairment on Hippocampal Slices

Preparation of Oligomeric ÃƒÅ½Ã‚Â²-amyloid1-42 and Induction of Synaptic Plasticity Impairment on Hippocampal Slices

Impairment of synaptic connections is likely to underlie the subtle amnesic changes occurring at the early stages of Alzheimer s Disease (AD). ...

DiOLISTIC Labeling of Neurons from Rodent and Non-human Primate Brain Slices

DiOLISTIC staining uses the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons of brain slices (Gan et al., 2009; O'Brien and Lummis, 2007; ...

Vibrodissociation of Neurons from Rodent Brain Slices to Study Synaptic Transmission and Image Presynaptic Terminals

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Dobbelte Elektrofysiologiske Optagelser af synaptisk-evoked astrogliale og Neuronal respons i Akut hippocampusskiver

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

Paired Whole Cell Recordings in Organotypic Hippocampal Slices

Forbundne Helcelle optagelser i Organotypiske hippocampusskiver

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct ...

Low-Density Primary Hippocampal Neuron Culture

Low-Density Primær Hippocampal neuronkultur

The ability to probe the structure and physiology of individual nerve cells in culture is crucial to the study of neurobiology, and allows for flexibility ...

Recording Synaptic Plasticity in Acute Hippocampal Slices Maintained in a Small-volume Recycling-, Perfusion-, and Submersion-type Chamber System

Optagelse synaptisk plasticitet i akut hippocampus skiver vedligeholdes i en lille-volumen genanvendelse - Perfusion- og neddykning-type kammer System

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful ...

Recording and Modulation of Epileptiform Activity in Rodent Brain Slices Coupled to Microelectrode Arrays

Optagelse og graduering af Epileptiform aktivitet i gnavere hjernen skiver koblet til mikroelektrode Arrays

Temporal lobe epilepsy (TLE) is the most common partial complex epileptic syndrome and the least responsive to medications. Deep brain stimulation (DBS) ...

Assessment of Long-term Depression Induction in Adult Cerebellar Slices

Vurdering af langvarig depression induktion i voksne cerebellar skiver

Synaptic plasticity provides a mechanism for learning and memory. For cerebellar motor learning, long-term depression (LTD) of synaptic transmissions from ...