Name: evaluation of synapse density in hippocampal rodent brain slices
Uploaded: 2017-10-06T14:00:00
Duration: 7 min 44 s
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इस काम MRC, यूरोपीय संघ FP7, ARUK, वेलकम ट्रस्ट, और पार्किंसंस ब्रिटेन द्वारा समर्थित किया गया था । हम भी अपनी पांडुलिपि और पद्धति पर रचनात्मक इनपुट के लिए फोकल छवियों और प्रयोगशाला के सदस्यों के उसके योगदान के लिए सुश्री Johanna Buchler शुक्रिया अदा करना चाहूंगा ।

<ol>
	<li>Malenka, R. C., Bear, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LTP+and+LTD:+an+embarrassment+of+riches.">LTP and LTD: an embarrassment of riches.</a> Neuron. 44 (1), 5-21 (2004).</li><li>Arendt, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+degeneration+in+Alzheimer's+disease.">Synaptic degeneration in Alzheimer's disease.</a> Acta Neuropathol. 118 (1), 167-179 (2009).</li><li>Missler, M., Sudhof, T. C., Biederer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+cell+adhesion.">Synaptic cell adhesion.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 4 (4), a005694 (2012).</li><li>Chua, J. 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C., Varela-Nallar, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+signalling+in+neuronal+differentiation+and+development.">Wnt signalling in neuronal differentiation and development.</a> Cell Tissue Res. 359 (1), 215-223 (2015).</li><li>Galli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deficient+Wnt+signalling+triggers+striatal+synaptic+degeneration+and+impaired+motor+behaviour+in+adult+mice.">Deficient Wnt signalling triggers striatal synaptic degeneration and impaired motor behaviour in adult mice.</a> Nat Commun. 5, 4992 (2014).</li></ol>

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

synapse संख्या का सटीक मूल्यांकन तंत्रिका विज्ञान के क्षेत्र के लिए आवश्यक है । यहां, हम कैसे एक मॉडल प्रणाली के रूप में हिप्पोकैम्पस स्लाइस की CA1 परत radiatum क्षेत्र में synapses के घनत्व का मूल्यांकन करने के लिए दिखाते हैं । मौजूदा तरीकों के संबंध में महत्व के साथ हिप्पोकैंपस में Wnt की कमी के प्रभाव पर हमारे हाल ही में अनुसंधान लेख में प्रदर्शन किया है और जहां हम भी एकल द्वारा synapse संख्या-खंड EM10मूल्यांकन । synapse नुकसान की भयावहता एकल अनुभाग EM और मस्तिष्क टुकड़ा विधि के बीच समान है यहां वर्णित10। इस प्रकार, इस खोज सटीकता और तकनीक की विश्वसनीयता को दर्शाता है ।
महत्वपूर्ण बात, दोनों एकल धारा EM और immunostaining synapses की एक सीमा, के रूप में यहां प्रस्तुत किया है, के लिए सही एक विशिष्ट मस्तिष्क क्षेत्र के लिए निरपेक्ष synapse संख्या का अनुमान अक्षमता है । दरअसल, यह महत्वपूर्ण है किसी भी वैश्विक रूपात्मक परिवर्तन की पहचान, के रूप में कुल मात्रा में परिवर्तन synaptic संख्या को प्रभावित कर सकता है । एक और सीमा है कि कुछ एंटीबॉडी बरकरार मस्तिष्क क्षेत्रों धुंधला पर कम कुशल हैं, आंशिक रूप से synaptic कनेक्शन के चरम घनत्व के कारण । हम vGlut1 और gephyrin के इस स्लाइस तैयार करने और बाद में पीएफए निर्धारण का उपयोग कर के उच्च गुणवत्ता वाले धुंधला अनुभव पीएफए में पूरे मस्तिष्क के तत्काल निर्धारण की तुलना में 1 एच की एक अधिकतम के लिए, (चित्रा 2c) । बाद में, ऊतक में छेद के साथ झुरमुट synaptic धुंधला करने के लिए नेतृत्व किया । बहरहाल, vGlut1 एंटीबॉडी प्रवेश अभी भी दोनों तरीकों (माइक्रोन के दसियों के एक जोड़े) में प्रतिबंधित है । हम इस सीमा को दूर नहीं किया, यहां तक कि वृद्धि हुई एंटीबॉडी गर्मी के साथ, लेकिन एंटीबॉडी प्रवेश प्रदान कुल गहराई है कि छवि है से अधिक है, अंतिम परिणाम पर कोई प्रभाव नहीं होना चाहिए । इसके अलावा, विशेष देखभाल सुनिश्चित करने के लिए कि धुंधला भी पूरे अधिग्रहीत ढेर भर में है लिया जाना चाहिए ।
हमारे अध्ययन में, हम निरोधात्मक synapses से उत्तेजक भेद करना चाहता था । नतीजतन, हम vGlut1/PSD-95 और vGAT/gephyrin, क्रमशः चुना, के रूप में इन प्रोटीन अत्यधिक वयस्क माउस हिप्पोकैंपस में व्यक्त कर रहे है और प्रत्येक synapse उपप्रकार4,5के लिए विशिष्ट हैं । अंय उत्तेजक और निरोधात्मक synaptic मार्करों synapse एनएमडीए के लिए AMPA और उत्तेजक रिसेप्टर्स के लिए GABAA और निरोधात्मक रिसेप्टर्स सहित प्रत्येक synapses, पर समृद्ध रिसेप्टर्स के रूप में प्रत्येक संबंधित synapse, की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । अंय न्यूरोट्रांसमीटर या neuromodulators भी हमारे प्रोटोकॉल के साथ की पहचान की जा सकती है, सुनिश्चित करना है कि विशिष्ट एंटीबॉडी उपलब्ध हैं, के रूप में striatum22में dopaminergic synapses के लिए दिखाया गया । इसके अलावा, प्रत्येक स्लाइस की मोटाई को कम करने के लिए १२० µm आंशिक रूप से तीव्र स्लाइस के साथ प्राप्त नमूनों की कम मात्रा को दूर कर सकते हैं, जो इस तरह के प्रमस्तिष्कखंड के रूप में छोटे मस्तिष्क संरचनाओं में अध्ययन के लिए अनिवार्य है.
हमारे प्रोटोकॉल के भविष्य के अनुप्रयोगों के विभिंन मस्तिष्क क्षेत्रों और विकारों के अध्ययन में लागू किया जा सकता है । उदाहरण के लिए, striatum में (पार्किंसंस रोग के साथ जुड़े मस्तिष्क के एक क्षेत्र), vGlut2/psd-95 या vGlut1/psd-95 का एक संयोजन synapses या afferents से आने वाले प्रांतस्था से उत्तेजक thalamus के बीच अंतर करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, क्रमशः२२.
अंत में, हम एक विश्वसनीय विधि पूर्व का उपयोग मस्तिष्क के ऊतकों में synapses की संख्या की जांच करने के लिए और पोस्ट-synaptic मार्करों एक synapse को परिभाषित करने के लिए पता चला है । महत्वपूर्ण कदम अच्छी हिप्पोकैम्पस स्लाइस, पीएफए में 1 ज तक का एक निर्धारण समय, पर्याप्त बढ़ते माध्यम के आवेदन, विश्वसनीय एंटीबॉडी, उचित छवि अधिग्रहण सेटिंग्स का उपयोग करें, और कड़े synaptic puncta का पता लगाने की तैयारी शामिल हैं । अंततः, इस विधि अपेक्षाकृत जल्दी है और आसानी से किसी भी प्रयोगशालाओं कि एक फोकल माइक्रोस्कोप के लिए उपयोग किया है द्वारा प्रतिलिपि है ।

मानव मस्तिष्क लगभग 1014 synapses से बना है । Synapse संख्या कसकर विकास और केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) के परिपक्वता के दौरान विनियमित है । विकास के दौरान, synapse संख्या synaptogenesis और कार्यात्मक ंयूरॉंस नेटवर्क के रूप में छंटाई द्वारा संग्राहक है । सीखने और स्मृति synapse संख्या और शक्ति, एक synaptic potentiation और अवसाद के रूप में जाना जाता प्रक्रिया के विनियमन द्वारा समर्थित है1। महत्वपूर्ण बात, परिपक्व synapses के स्थिरीकरण ंयूरॉंस नेटवर्क कनेक्शन को बनाए रखने के लिए आवश्यक है । इसके अलावा, synapse घनत्व में घाटा neurodegenerative स्थितियों जैसे अल्जाइमर रोग (AD)2की प्रारंभिक अवस्था में सूचित किया गया है । इसलिए, synapse संख्या सही पहचान और मूल्यांकन करने की क्षमता मस्तिष्क शरीर क्रिया विज्ञान और विकृति विज्ञान के आकलन के लिए मौलिक है ।
synapses के चरम घनत्व और कॉंपैक्ट प्रकृति यह बरकरार मस्तिष्क क्षेत्रों में उनकी सटीक संख्या का अनुमान लगाने के लिए चुनौतीपूर्ण बनाते हैं । सीएनएस में रासायनिक synapses करीब apposition में दो न्यूरॉन्स के बने होते हैं, एक synaptic फांक3से अलग. पूर्व synaptic टर्मिनल, या synaptic bouton, एक axon से उभर और संचित बुलबुले होते हैं, जो न्यूरोट्रांसमीटर होते हैं जो एक synapse की विशिष्टता को परिभाषित करते हैं — अर्थात्, ग्लूटामेट और गामा-aminobutyric अम्ल (गाबा) उत्तेजक के लिए और क्रमशः निरोधात्मक synapses । बुलबुले के झिल्ली प्रत्येक न्यूरोट्रांसमीटर के लिए विशिष्ट vesicular ट्रांसपोर्टरों होते हैं: गाबा के लिए vesicular ग्लूटामेट ट्रांसपोर्टर (vGlut) ग्लूटामेट और vesicular गाबा ट्रांसपोर्टर (vGAT) के लिए । पोस्ट-synaptic टर्मिनल एक अत्यधिक सघन संरचना, रिसेप्टर्स, आसंजन अणुओं, और पाड़ प्रोटीन सहित कई प्रोटीन से बना है । उत्तेजक synapses में, पोस्ट-synaptic घनत्व-९५ प्रोटीन (PSD-९५) सबसे प्रचुर मात्रा में पाड़ प्रोटीन है4, मॉडुलन उत्तेजक एन मिथाइल-D-aspartate (एनएमडीए-) और α-एमिनो-3-hydroxy-5-मिथाइल-4-isoxazolepropionic एसिड (AMPA-) रिसेप्टर समारोह, जबकि gephyrin लंगर निरोधात्मक रिसेप्टर्स निरोधात्मक पोस्ट करने के लिए-synaptic टर्मिनल5। कुल मिलाकर, प्रोटीन की विशिष्टता पूर्व और बाद synaptic अंतर और synapse उपप्रकारों की पहचान में सहायता डिब्बों ।
synapse संख्या का मूल्यांकन विभिन्न तकनीकों के साथ किया जा सकता है. सबसे आम इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (EM) का उपयोग है, जो उच्च आवर्धन और संकल्प के साथ कॉंपैक्ट और बरकरार मस्तिष्क क्षेत्रों में synapse के विश्लेषण में सक्षम बनाता है । हालांकि, इस तकनीक बहुत महंगा है, जटिल नमूना तैयारी की आवश्यकता है, और बहुत समय लगता है । अंय तकनीकों सरणी टोमोग्राफी6, जो कि यह विशेष और महंगे उपकरणों के लिए विश्लेषण करने की आवश्यकता है में एक प्रमुख नुकसान है के उपयोग में शामिल हैं । इसके अलावा, ट्रांसजेनिक विशिष्ट synaptic मार्करों व्यक्त लाइनों synapse संख्या7मूल्यांकन में उपयोगी होते हैं, लेकिन नई लाइनों की पीढ़ी प्रतिबंधात्मक और महंगा हो सकता है, और प्रोटीन के व्यक्त अवांछनीय बंद लक्ष्य में परिणाम हो सकता है phenotypes ।
इन सीमाओं के कारण और सादगी के लिए, कई शोधकर्ताओं ने कुल synaptic प्रोटीन के स्तर का परीक्षण करके synapse संख्या का मूल्यांकन । हालांकि, synapse नुकसान प्रोटीन में पर्याप्त परिवर्तन से पहले देखा जा सकता है, के रूप में संरचनात्मक synaptic के फैलाव में परिणाम पूर्व या पोस्ट-synaptic apposition, synaptic प्रोटीन की कोई गिरावट के साथ । इसके अलावा, विज्ञापन में, synaptic प्रोटीन के स्तर को कम कर रहे है synapse अध कि या ंयूरॉन मौत8,9के बाद । कुल स्तरों के ठहराव इस अंतर को सक्षम नहीं करता है । इस प्रकार, मस्तिष्क में synapse संख्या के मूल्यांकन के लिए एक विश्वसनीय, सुलभ, और सटीक विधि विकसित करने की आवश्यकता है ।
इस अनुच्छेद में, हम वर्णन कैसे अच्छी तरह से पहचान करने के लिए और हिप्पोकैम्पस कुतर मस्तिष्क स्लाइस में इम्यूनोफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर synapses की संख्या का निर्धारण । synapses पूर्व के colocalization द्वारा परिभाषित कर रहे है और पोस्ट synaptic मार्करों जो एक कबरा वितरण में दिखाई देते हैं । हम मस्तिष्क में Wnt सिग्नलिंग के अध्ययन के माध्यम से इस तकनीक की वैधता का प्रदर्शन करते हैं । Wnts गठन, उंमूलन, और synapses के रखरखाव के लिए महत्वपूर्ण प्रोटीन स्रावित कर रहे हैं । Wnt झरना, Dickkopf-1 (Dkk1) के एक गुप्त प्रतिपक्ष के vivo में प्रेरण, synaptic निरोधात्मक के संरक्षण के दौरान उत्तेजक synapses हानि की ओर जाता है10. हम पहचान और हिप्पोकैम्पस स्लाइस में उत्तेजक और निरोधात्मक synapses की गिनती एक वयस्क माउस से Dkk1 व्यक्त करने और इस तकनीक के ऊतकों के अंय प्रकार के लिए हस्तांतरण पर प्रकाश डाला/

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>VT1000S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB5905</td>
			<td>vGlut1 (1:2000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibody</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>MA1-046</td>
			<td>PSD-95 (1:500)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibody</td>
			<td>Synaptic Systems</td>
			<td>131 004</td>
			<td>vGAT (1:500)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibody</td>
			<td>Synaptic Systems</td>
			<td>147011</td>
			<td>Gephyrin (1:500)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab5392</td>
			<td>MAP2 (1:10000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibody</td>
			<td>Jackson Laboratories</td>
			<td>706-545-148</td>
			<td>Donkey Anti-Guinea Pig Alexa Fluor 488 (1:600)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab175470</td>
			<td>Donkey Anti-Rabbit Alexa Fluor 568 (1:600)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting medium</td>
			<td>SouthernBiotech</td>
			<td>00-4958-02</td>
			<td>Fluoromount-G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>NA</td>
			<td>FV1000 confocal microscope using a 60x 1.35 numerical aperture (NA) oil objective. For vGlut1, use a 488 laser with a percentage power of 14%. For PSD-95 use a 559 laser with a percentage power of 20%.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analysis software</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>NA</td>
			<td>Volocity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>Swann-Morton</td>
			<td>203</td>
			<td>No 11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super Glue</td>
			<td>Loctite</td>
			<td>1446875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>95% O2, 5% CO2</td>
			<td>BOC</td>
			<td>NA</td>
			<td>Cylinder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>7107</td>
			<td>08-1.0mm thick</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iDkk1 mice</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Mice were obtained by crossing tetO Dkk1 transgenic mice with CaMKII&#945; rtTA2 transgenic mice. TetO Dkk1 transgenic mice and CaMKII&#945; rtTA2 were crossed in a heterozygous state. Both mouse lines were bred in a C57BL/6J background. Single transgenic and WT littermate were used as controls.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents for solutions:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>V800372</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>255793</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ca2Cl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>223506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mg2Cl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M9272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>71505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kynurenic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>K3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>107360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E6758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey Serum</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>S30-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of synapse density in hippocampal rodent brain slices

मस्तिष्क में, synapses न्यूरॉन्स के बीच विशेष जंक्शनों हैं, शक्ति का निर्धारण और न्यूरॉनिंग संकेतन के प्रसार. synapses की संख्या कसकर विकास और न्यूरॉन परिपक्वता के दौरान विनियमित है. महत्वपूर्ण बात, synapse संख्या में घाटा संज्ञानात्मक रोग के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । इसलिए synapse संख्या का मूल्यांकन तंत्रिका का अभिन्ना अंग है. हालांकि, के रूप में synapses बरकरार मस्तिष्क में छोटे और उच्च कॉंपैक्ट हैं, निरपेक्ष संख्या के आकलन को चुनौती दे रहा है । इस प्रोटोकॉल का वर्णन एक विधि को आसानी से पहचान करने के लिए और हिप्पोकैम्पस में synapses का मूल्यांकन कुतर इम्यूनोफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी का उपयोग । यह हिप्पोकैम्पस स्लाइस में पूर्व और postsynaptic प्रोटीन के सह स्थानीयकरण का विश्लेषण करके उच्च गुणवत्ता फोकल माइक्रोस्कोपी छवियों में synapses का मूल्यांकन करने के लिए एक तीन कदम प्रक्रिया भी शामिल है. यह भी बताते है कि विश्लेषण कैसे किया जाता है और उत्तेजक और निरोधात्मक synapses दोनों से प्रतिनिधि उदाहरण देता है । इस प्रोटोकॉल synapses के विश्लेषण के लिए एक ठोस आधार प्रदान करता है और किसी भी संरचना और मस्तिष्क के समारोह की जांच अनुसंधान के लिए लागू किया जा सकता है ।

Synapse हानि neurodegenerative रोगों में जल्दी होता है जैसे कि विज्ञापन और पार्किंसंस रोग2,11,12. हालांकि, इन घाटे अंतर्निहित आणविक तंत्र खराब समझ में रहते हैं । Wnt सिगनलिंग में कमियों को AD13,14,15,16,17के साथ संबद्ध किया गया है । Wnts में राज कर रहे हैं नच और synapse गठन में एक अनिवार्य भूमिका निभाते हैं और synaptic ट्रांसमिशन18,19,20,21के मॉडुलन । हाल ही में, हम परिपक्व तंत्रिका प्रणाली10,22में synaptic रखरखाव के प्रमुख नियामकों के रूप में Wnts की पहचान की । सही आनुवंशिक रूप से संशोधित चूहों के हिप्पोकैंपस में synapses पर संकेत Wnt के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए, हम एक मस्तिष्क टुकड़ा तैयारी और फोकल माइक्रोस्कोपी का लाभ लिया synapse संख्या में परिवर्तन का मूल्यांकन करने के लिए. हमने स्वस्थ स्लाइस की पहचान की जिसमें संरचना को अच्छी तरह से संरक्षित किया गया (चित्र 2a) । इसके अलावा, synaptic puncta के चयन को ध्यान से परिभाषित किया गया था, जो शायद एग्रीगेट प्रोटीन (चित्र बी. सी.) का प्रतिनिधित्व करने वाले बड़े दाग़ी ऑब्जेक्ट्स के बहिष्करण के साथ । यह कसौटी सभी छवियों के लिए लागू किया गया था, एक ही सख्त विश्लेषण मापदंडों के साथ ।
हम टेट्रासाइक्लिन नियंत्रण के तहत वयस्क चूहों (iDkk1) में गुप्त Wnt विरोधी Dkk1 की अभिव्यक्ति लाती है कि एक ट्रांसजेनिक मॉडल प्रणाली का इस्तेमाल किया ( सामग्री की तालिकादेखें)10,22. हम प्रदर्शन किया है कि Wnt की नाकाबंदी वयस्क हिप्पोकैंपस में संकेतन उत्तेजक synapse नुकसान विशेष रूप से CA1 परत radiatum क्षेत्र में (चित्रा 3) । चित्रा 3 ए उत्तेजक पूर्व के प्रतिनिधि फोकल छवियों को दिखाता है और बाद synaptic मार्करों (vGlut1 और PSD-९५, क्रमशः) iDkk1 दो सप्ताह के लिए Dkk1 व्यक्त चूहों के हिप्पोकैम्पस स्लाइस से हासिल की, साथ ही उनके संबंधित नियंत्रण । हम Volocity सॉफ्टवेयर का उपयोग कर इन छवियों का विश्लेषण और उत्तेजक synapses की संख्या में एक महत्वपूर्ण कमी का प्रदर्शन किया, सह द्वारा मात्रा-vGlut1 के स्थानीयकरण-और PSD-९५-puncta चूहों के CA1 हिप्पोकैंपस क्षेत्र में iDkk1 के बाद लेबल दो सप्ताह के लिए Dkk1 की प्रेरण (चित्र बी, * पी & #60; ०.०५; Kruskal-वालिस test; जीनोटाइप प्रति 6 चूहों) । CA1 की परत radiatum में उत्तेजक synapse puncta संख्या प्रति १,००० µm3 को नियंत्रण चूहों में iDkk1 चूहों में ३०० से घटाकर ५०० कर दिया गया । इसके विपरीत, प्रेरित Dkk1 अभिव्यक्ति निरोधात्मक synapses की संख्या को प्रभावित नहीं किया (पूर्व और पोस्ट synaptic मार्करों vGAT और gephyrin के बीच सह स्थानीयकरण द्वारा की पहचान की, क्रमशः), के रूप में चित्र 4a-B (p & #62; ०.०५; Kruskal-वालिस test; जीनोटाइप प्रति 3 चूहों) ।
महत्वपूर्ण बात, हम स्लाइस और इन मजबूत परिणाम उत्पंन करने के लिए आवश्यक पशुओं की उचित संख्या का अनुमान करने के लिए एक सांख्यिकीय बिजली विश्लेषण प्रदर्शन किया । R का उपयोग कर, हम गणना कि लगभग ३५ स्लाइस प्रति शर्त (3 छवियां x 3 स्लाइस x 6 पशु = ३६) एक बड़े प्रभाव आकार का पता लगाने के लिए (f = ०.४) ८०% विश्वास (पावर = ०.८) के साथ एक-तरफ़ा ANOVA में ब्लॉकिंग और प्रतिकृति के साथ, जैसा चरण 3.2.6 में वर्णित है ।
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56153/56153fig3.jpg"> 
चित्रा 3: iDkk1 चूहों से हिप्पोकैम्पस स्लाइस में उत्तेजक synapses का झड़ना. (क) प्रतिनिधि CA1 परत radiatum शो उत्तेजक synapses, vGlut1 और PSD के बीच सह स्थानीयकरण द्वारा की पहचान की फोकल छवियां-९५ (सफेद तीर) । निचला फलक हाइलाइट किए गए आयत की उच्चतर आवर्धन का प्रतिनिधित्व करता है । स्केल पट्टियां = 2 µm. (B) नियंत्रण और iDkk1 के बीच उत्तेजक synapses का प्रतिशत, सामग्री की तालिका में उल्लेखित सॉफ़्टवेयर का उपयोग मात्रा था (* p & #60; ०.०५; Kruskal-वालिस test; जीनोटाइप प्रति 6 चूहों) । डेटा ± SEM प्रतिनिधित्व कर रहे हैं । यह आंकड़ा संदर्भ10से संशोधित किया गया है । <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56153/56153fig3large.jpg" target="_blank">कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56153/56153fig4.jpg"> 
चित्रा 4: iDkk1 चूहों से हिप्पोकैम्पस स्लाइस में निरोधात्मक synapses अपरिवर्तित हैं. (क) निरोधात्मक synapses की CA1 परत radiatum के प्रतिनिधि फोकल छवियों को vGAT और gephyrin (सफेद तीर) के बीच सह-स्थानीयकरण द्वारा पहचाना जाता है. निचला फलक हाइलाइट किए गए आयत की उच्चतर आवर्धन का प्रतिनिधित्व करता है । स्केल पट्टियां = 2 µm. (B) नियंत्रण और iDkk1 चूहों के बीच निरोधात्मक synapses का प्रतिशत, जैसे मात्रा उपयोग Volocity सॉफ्टवेयर (p & #62; ०.०५; Kruskal-वालिस test; जीनोटाइप प्रति 3 चूहों) । डेटा ± SEM प्रतिनिधित्व कर रहे हैं । यह आंकड़ा संदर्भ10से संशोधित किया गया है । <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56153/56153fig4large.jpg" target="_blank">कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>उच्च सुक्रोज ACSF अवयव</td>
			<td>एकाग्रता</td>
			<td>नोट्स</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nacl</td>
			<td>७५ एमएम</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>25 एमएम</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>kcl</td>
			<td>२.५ एमएम</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>णः2पो4, 2H2O</td>
			<td>१.२५ एमएम</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kynurenic अम्ल</td>
			<td>१.२५ एमएम</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>पाइरुविक अम्ल</td>
			<td>2 मिमी</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>edta</td>
			<td>०.१ एमएम</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>1 मिमी</td>
			<td>समाधान की ऑक्सीजन के बाद जोड़ें</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>4 मिमी</td>
			<td>समाधान की ऑक्सीजन के बाद जोड़ें</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-ग्लूकोज</td>
			<td>25 एमएम</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>सुक्रोज</td>
			<td>१०० एमएम</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>जलमग्न चेम्बर ACSF अवयव</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nacl</td>
			<td>१२५ एमएम</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>25 एमएम</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>kcl</td>
			<td>२.५ एमएम</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>णः2पो4, 2H2O</td>
			<td>१.२५ एमएम</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>1 मिमी</td>
			<td>समाधान की ऑक्सीजन के बाद जोड़ें</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
</tr></tbody></table>			<td>1 मिमी</td>
			<td>समाधान की ऑक्सीजन के बाद जोड़ें</td>
		
		<tr>
			<td>D-ग्लूकोज</td>
			<td>25 एमएम</td>
			<td></td>
		</tr>
	

तालिका 1: ACSF संरचना ।
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>अवरुद्ध/permeabilizing बफ़र</td>
			<td>एकाग्रता</td>
			<td>नोट्स</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>गधा सीरम</td>
			<td>10%</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ट्राइटन-X</td>
			<td>०.५०%</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pbs</td>
			<td>1x</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x पंजाब</td>
			<td></td>
			<td>७.४ को पीएच</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nacl</td>
			<td>१.३७ मीटर</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>kcl</td>
			<td>27 एमएम</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>णः2पो4</td>
			<td>१०० एमएम</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2पो4</td>
			<td>18 एमएम</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% पीएफए/4% सुक्रोज</td>
			<td></td>
			<td>७.४ को पीएच</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pbs</td>
			<td>1x</td>
			<td>10x से पतला</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>पीएफए</td>
			<td>१.३३ मीटर</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>सुक्रोज</td>
			<td>११७ एमएम</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
तालिका 2: immunofluorescent धुंधला करने के लिए उपयोग किए गए बफ़र्स ।

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Evaluation of Synapse Density in Hippocampal Rodent Brain Slices

इम्यूनोफ्लोरेसेंस का उपयोग कर हिप्पोकैम्पस स्लाइस में synapses सही पहचान और विश्लेषण के लिए एक प्रोटोकॉल इस आलेख में उल्लिखित है ।

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