Name: evaluation of synapse density in hippocampal rodent brain slices
Uploaded: 2017-10-06T14:00:00
Duration: 7 min 44 s
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이 작품은 MRC, EU FP7, ARUK, Wellcome 신뢰, 그리고 파 킨 슨 병의 영국에 의해 지원 되었다. 우리는 또한 양 요한 나 Buchler 공초점 이미지의 그녀의 공헌과 원고와 방법론에 그들의 건설적인 입력에 대 한 연구소의 구성원에 대 한 감사 하 고 싶습니다.

모든 실험 쥐 및 쥐를 사용 하 여 승인 하 고 일정 1 절차를 사용 하 여 실시 적용 홈 오피스 동물 (과학적인 절차) 행위 1986. 표 1에서 인공 척수 (실제) 제조 법을 찾을 수 있습니다.
 1. 급성 Hippocampal 슬라이스 준비 <ol><li>쥐의 뇌를 주걱을 사용 하 여 가능한 한 빨리 제거 하 고 날카로운가 위로 잘라 두개골, 그리고 얼음에, 산소 (95% O 2, 5% CO 2), 높은 자당 실제 (~ 100 mL).</li>
	<li>마우스 뇌 페 트리 접시에 놓고 소 뇌와 뇌의 중간 아래로 hemisecting 전에 메스와 담당의 작은 부분을 제거.</li>
	<li>그냥 컷은 측면에 두 개의 반구를 놓고 접착제는 vibratome의 단계에 각 반구.</li>
	<li>는 200-300 µ m 두께 부분의 완전 한 관심 영역을 잘라. 반구 당 약 3-4 조각, 해 마의 경우 취득 해야.</li>
	<li>챔버 산소 (95% O 2, 5% CO 2)에 잠긴 조각 전송 플라스틱 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 실제. 30 분에 대 한 34 ° C에서 유지 
	참고: 재조합 Dkk1 단백질 등 활성 약리 에이전트와 함께 조각의 치료에서 수행할 수 있습니다이 단계 슬라이스 챔버에 에이전트를 추가 하 여.</li>
	<li>그림 붓을 사용 하 여 상공에서 슬라이스를 제거, 24-잘 접시에 그들을 배치 그리고 4 %paraformaldehyde 1 시간 20 분 수정 (실 온 (RT)에서 PFA)/4% 자당. 
	주의: PFA는 독성, 적절 한 보호 착용.</li>
	<li>씻어 슬라이스 1 X PBS (각 10 분)에 세 번. 
	참고: 프로토콜 일시 중지할 수 있습니다 여기 1-2 일 동안으로 슬라이스 1 X PBS에 4 ° C에 보관 됩니다.</li>
</ol> 2. 시 냅 스 표식에 대 한 면역 형광 참고: 표 2에서 사용 하는 모든 버퍼의 요리법을 찾을 수 있습니다.
<ol><li>슬라이스 우물에서 차단/permeabilizing 버퍼 (표 2)와 함께 PBS를 대체 하 고 4-6 헤에 대 한 RT에서 품 어</li>
	<li>차단/permeabilization 버퍼에 1:2,000 희석에 vGlut1에 대 한 기니 돼지 polyclonal 항 체 희석. 
	참고: vGlut1은 미리 시 냅 스의 흥분 성의 터미널 시각화에 대 한 마커입니다. 동일한 솔루션에 PSD-95와 희석 1: 500에 대하여 polyclonal 항 체 포스트 시 냅 시스 흥분 성의 냅 식별을 위해 사용. 각 우물에서 300 µ L의 최소 볼륨을 사용 합니다. 해 마의 해 부 위치를 식별, 또한 MAP2 등 Tubulin 신경 구조를 식별할 수 있는 항 체를 사용 합니다. 운동 선택 (사전 및 사후 시 냅 스)의 시 냅 스 표식에 대 한 모든 기본 항 체의 정확한 농도 신선한 차단/permeabilizing 버퍼에 희석.</li>
	<li>4에서 하룻밤 (또는 1-2 일에 대 한) 기본 항 체 솔루션에 슬라이스를 품 어 ° C. 사용 활발 한 움직임으로 떨고 플랫폼.</li>
	<li>PBS (각 10 분)에서 조각 세 번 씻어.</li>
	<li>희석 블로킹 버퍼에서 적절 한 2 차 항 체 1: 500. 예를 들어 vGlut1 기니 돼지 항 체를 사용 하면 인식 하는 기니 피그 구성 요소 (예: 당나귀 안티-guinea-돼지) 특정 fluorophore에 활용 된 이차 항 체를 적용 합니다. PSD-95 토끼 항 체를 사용 하 여, 이차 항 체는 토끼 구성 요소 (예: 당나귀 안티 토끼) 다른 특정 fluorophore에 활용 된 인식 적용.</li>
	<li>이차 항 체는 빛에 민감한 조각, 빛에서 보호 되는 실시간 확인에서 2-3 시간이 솔루션에서 분할 영역을 품 어.</li>
	<li>PBS (각 10 분)에서 조각 세 번 씻어.</li>
	<li>신중 하 게 그림 붓을 사용 하 여 24-잘 접시에서 슬라이스를 제거 하 고 균등 하 게 사전 이라는 유리 슬라이드에 그들을 배치. 각 조각 위에 장착 매체의 한 방울을 추가 하 고 부드럽게 조각 위에 유리 coverslip 장소. 기포의 형성을 하지 마십시오. 부족 한 금액 조각 건조으로 이어질 수 있습니다 하는 충분 한 설치 매체 (300-400 µ L)을 사용 하 여 돌.</li>
	<li>를 최소 1-2 일 RT에 대 한 건조 하 고 빛 으로부터 보호 하는 슬라이드를 계속 두고.</li>
	<li>장기 저장을 위한 단기에 4 ° C에서 슬라이드를 저장,-20에서 그들을 계속 ° c.</li>
</ol> 3. 공초점 이미지 수집 및 분석 <ol><li>confocal 레이저 스캐닝 현미경 검사 법을 사용 하 여 이미징.
	<ol><li>이미지 수를 해 마의 영역을 식별 (예: 1 고 3 (CA1, CA3) 뿔 ammonis 또는 (DG)가 뇌) 10 배 또는 20 배 목표.</li>
		<li>변경 40 x 또는 63 x 기름 침수 목적 확인 슬라이스 해부학 그대로 연속 neurites 식별 하 여 조직 구조를. MAP2, 같은 신경 마커를 사용 하 여 참조 ( 그림 1A)로.</li>
		<li>이후에, 기름 침수 목표 x 60으로 전환 (NA ~1.3-1.4 =) 및 각 채널에 대 한 최적의 신호 및 대비 설정을 조정 합니다. 높은 / 낮은 콘트라스트 옵션을 사용 하 여 픽셀의 채도 피하기 위해 각 레이저의 강도 설정. 
		참고: 이러한 설정을 사용 하 고, 현미경에 의존 하지만 그림 2, 그림 3에서 사용 되는 레이저 전원 설정에 대 한 테이블의 자료를 참조 하 고 그림 4. 최상의 결과 얻으려면 1024 x 1024 픽셀의 해상도 사용 합니다. 설정을 통해 같은 실험의 다른 조건을 일정 유지 됩니다. 필요한 경우 추가 확대 적용 될 수 있다.</li>
		<li>깊이가 얼룩을 평가 하 고 적어도 8 등거리의 이미지 스택을 취득 (250 nm) 비행기. 3 인접 한 대표 이미지 스택을 슬라이스 당 관심의 동일한 지역에서 걸릴. 
		참고: 깊이 한 조각에서 다른 다를 수 있습니다 있지만 항상 조각의 표면에서 약 2-5 µ m 이어야 한다.</li>
		<li>상태 및 치료 그룹 당 6-8 동물에서 적어도 3 조각에 수집을 반복.</li>
	</ol></li> <li>이미지 분석. 
	참고: 사용 하는 자동된 이미지 분석 소프트웨어 (재료의 표 참조). 반면 다른 사람 자유롭다, ImageJ 같은 일부 시스템 라이센스를 필요로 하는 참고. 사용 하는 소프트웨어 스택 몇 군데의 모든 비행기를 고려 하 여 3d에서 이미지를 분석 해야 합니다. 이미지 분석 ( 그림 1)에서 사용 하는 소프트웨어의 세부 사항에 대 한 테이블의 자료를 참조 하십시오.
	<ol><li>사용자 정의 기반 강도 임계값 프로토콜을 사용 하 여 모든 시 냅 스 puncta와 신경 마커는 수동으로 최적화 된 소프트웨어 내에서 선택 된 식별 하 [이 사용 하는 특정 소프트웨어에 대 한 재료의 표 참조 프로토콜]. 
		참고: 소프트웨어 각 fluorophore에 대 한 최소 및 최대 강도 식별 하 고 각 인식된 개체에 대 한 강도의 비율 연결. 강도의 비율 fluorophore 사용에 따라 달라 집니다와 시 냅 스 표식에 대 한 항 체.</li>
		<li>시냅틱 표식 크기 필터 확인 (&#62; 0.1µm 3와 &#60; 0.8µm 3) 소프트웨어에서 선택 되 고 이미지에 적용. 선택한 개체 중복 하지는 보장 하기 위해 매개 변수를 조정 합니다. 너무 크거나 너무 작은 시 냅 스 puncta 간주 하는 모든 개체를 제외 ( 그림 2B 참조). 
		참고: 최적화, 일단 같은 임계값 값 다음 이미지에 적용 됩니다 모든 주어진된 실험 내.</li>
		<li>계량 평균 개수, 강도, 및 개별 시 냅 스 puncta (전처리 또는 후 시 냅 스)의 볼륨 소프트웨어 내에서 선택 된 최적화 된 임계값 프로토콜을 사용 하 여. 이미지 필드 (대략 16,928 µ m 3에서 여기에서 사용 하는 시스템)의 볼륨을 puncta 번호를 정상화. 참조 신경 마커의 강도를 시 냅 스 puncta 강도 표준화. 
		참고: 시 냅 스는 사전 및 사후 시 냅 스 마커 사이 공동 지역화로 정의 됩니다. 일단 사전 및 포스트 시 냅 스 puncta h에 대 한 임계값 프로토콜ave 되었습니다 설립, 소프트웨어 1 픽셀의 또는 단일 면에서 더 오버랩으로 시 냅 스 puncta의 공동 지역화를 식별 한다. 
		참고: 통계 분석에 대 한 확인 샘플의 모든 세트 정상 및 분산의 동질성에 따라 각각 Lilliefords와 χ 2 테스트에 의해 결정 합니다. 아래와 같이 정규 분포 및 분산의 동질성을 보여주는 샘플 파라 메 트릭 테스트와 분석 되어야 합니다. 예를 들어 흥분 성의 시 냅 스 puncta 분석 차단 및 복제는 단방향 ANOVA를 사용 하 여 수행 되어야 한다. 각 개별 실험 블록;으로 고려 되어야 한다 일반적으로, 1-3 마우스 각 조건에서 각각 3 개의 독립적인 실험 있다.</li>
	</ol></li></ol> <img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56153/56153fig1.jpg" /> 그림 1: 이미지 분석을 사용 하 여 시 냅 스 puncta의 분석 소프트웨어. 강도 임계값 프로토콜 사용자 지정의 (A) 스크린샷. PSD-95, 선택 된 puncta의 정의 된 크기를가지고 있는 예는 &#62; 0.1 µ m 3와 &#60; 0.8 µ m 3와 현재 최소화 겹치는 개체. 참고 표시 된 이미지는 시 냅 스 puncta와 정확한 매개 변수 선택의 쉽게 시각화 수 있도록 한 confocal 비행기. (B) 소프트웨어 (최적화 된 프로토콜의 선택에 따라)에서 출력 하는 분석의 스크린샷. 볼륨에 따라 원시 시 냅 스 puncta 숫자 측정의 예입니다. 이러한 값은 스프레드시트 소프트웨어 다음 내보내집니다. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56153/56153fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
 <img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56153/56153fig2.jpg" /> 그림 2: 시 냅 스 puncta에 대 한 슬라이스 및 매개 변수 설정의 품질 확인. (A) 대표 confocal 이미지 (40 x 목표)의 관심 영역: CA1 지층 radiatum (sr) 및 지층 oriens (그래서) hippocampal 조각의 식별 됩니다 MAP2 얼룩에 의해. 눈금 막대 2 µ m. (B) 공초점 이미지 = (객관적이 고 추가 1.3 X x 60 확대 수집 소프트웨어에)의 CA1 지층 radiatum 흥분 성의 마커-vGlut1 (녹색)와 PSD-95 (레드)-hippocampal 조각에서. 분명 사전 및 포스트 시 냅 스 puncta의 식별 note 0.8 µ m 3 보다 큰 Puncta는 정량화 (흰색 화살표)에서 제외 됩니다. 눈금 막대 2 µ m (C) Confocal 이미지 = (객관적이 고 추가 1.3 X x 60 확대 수집 소프트웨어에) 흥분 성의 마커-vGlut1 (녹색)으로 CA1 지층 radiatum의-전체 두뇌에서 cryostat 컷 hippocampal 섹션에서 PFA에서 수정 되었습니다. 큰 구멍 및 불규칙 한, 이멀전의 vGlut1 얼룩이 지기의 존재 note 눈금 막대 = 2 µ m. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56153/56153fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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저자는 공개 없다.

시 냅 스 숫자의 정확한 평가 신경 과학의 분야에 필수적 이다. 여기, 우리는 모델 시스템으로 hippocampal 조각의 CA1 지층 radiatum 지역에서 시 냅 스의 밀도 평가 하는 방법을 보여 줍니다. 기존의 방법에 관하여 의미는 단일 섹션 안에10여 Wnt 결핍 해 마에서 고 우리는 또한 시 냅 스 수를 평가의 효과에 우리의 최근 연구 기사에 보여 줍니다. 시 냅 스 손실의 크기는 단일 섹션 안에 두뇌 슬라이스 유사 방법 설명10. 따라서,이 정확성과 기술의 신뢰성을 보여 줍니다.
중요 한 것은, 단일 섹션 EM 및 immunostaining 시 냅 스, 여기에 제시의 한계 특정 뇌 영역에 대 한 절대 시 냅 스 수를 정확 하 게 예측 하는 무 능력 이다. 실제로, 그것은 중요 하다 어떤 글로벌 형태학 상 변화를 식별 하 총 볼륨에서 변경 시 냅 스 수 영향을 미칠 수입니다. 또 다른 한계는 특정 항 체는 얼룩이 그대로 뇌 영역, 부분적으로 시 냅 스 연결의 극단적인 조밀도 때문에 비효율적입니다. 우리는 높은 품질의 vGlut1 및 gephyrin 1 h, PFA (그림 2C)에 전체 뇌의 즉시 고정에 비해 최대이 슬라이스 준비와 후속 PFA 고정을 사용 하 여 얼룩을 경험 했다. 후자의 이멀전의 시 냅 스 얼룩, 조직에 있는 구멍으로 이끌어 냈다. 그럼에도 불구 하 고, vGlut1 항 체 침투는 여전히 두 방법 (몇 수십 미크론)에 제한 됩니다. 우리가이 한계를 극복 하지 않았다, 심지어 증가 항 체 외피, 하지만 항 체 침투를 제공 하는 몇 군데는 총 깊이 보다 큰, 최종 결과에 아무런 영향을 주지 해야한다. 또한, 특별 한 주의 얼룩을 전체 인수 스택을 통해도 취해야 한다.
우리의 연구에서 우리 싶 구별 억제 시 냅 스에서 흥분 성의. 따라서, 우리는 선택 vGlut1/PSD-95 및 vGAT/gephyrin, 각각이 단백질 높은 성인 마우스 해 마로 표현 하 고 각 시 냅 스 하위4,5에. 다른 흥분 성의 억제 시 냅 스 마커 각 각 시 냅 스, 대 한 AMPA와 NMDA 수용 체를 포함 하 여, 각 시 냅 스에 농축 하는 수용 체 등을 식별 하기 위해 사용 되었을 수 흥분 성의 및 GABAA 수용 체 억제 시 냅 스에 대 한. 다른 신경 전달 물질 또는 neuromodulators 또한 dopaminergic 시 냅 스가22대와 같이 특정 항 체를 사용할 수는 확인 우리의 프로토콜을 확인할 수 있습니다. 또한, 각 슬라이스 120 μ m의 두께 감소는 편도 같은 작은 뇌 구조에서 연구에 대 한 긴급 급성 조각으로 얻은 샘플의 낮은 수량 부분적으로 극복할 수 있다.
우리의 프로토콜의 미래 응용 프로그램 서로 다른 뇌 영역 및 장애의 연구에서 구현 될 수 있습니다. 예를 들어가 (파 킨 슨 병 관련 된 뇌의 영역)에서 vGlut2/PSD-95 또는 vGlut1/PSD-95의 조합을 사용할 수 피 질 또는 시상에서 오는 afferents에서 흥분 성의 시 냅 스를 각각22.
결론적으로, 우리 정의 시 냅 스를 사전 및 포스트 시 냅 스 마커를 사용 하 여 뇌 조직에 시 냅 스의 수를 검사 하는 신뢰할 수 있는 방법으로 나타났습니다. 중요 한 단계는 PFA, 충분 한 설치 매체의 응용 프로그램, 믿을 수 있는 항 체, 적절 한 이미지 수집 설정 및 엄격한 시 냅 스 puncta 검색을 사용 하 여 최대 1 h의 고정 시간 좋은 hippocampal 조각의 준비를 포함합니다. 궁극적으로,이 메서드는 상대적으로 빠른 이며 confocal 현미경에 액세스할 모든 실험실에 의해 쉽게 재현할 수입니다.

인간의 두뇌는 약 1014 시 냅 스로 구성 된다. 시 냅 스 수는 개발 및 중앙 신경 시스템 (CNS)의 성숙 동안 긴밀 하 게 통제 된다. 개발를 통해 시 냅 스 수는 변조 synaptogenesis 및 잘라내기 기능 신경 네트워크를 형성 하 여. 학습 및 메모리 시 냅 스 숫자와 강도, 시 냅 스 potentiation 및 우울증1이라는 프로세스의 규정에 의해 지원 됩니다. 중요 한 것은, 성숙한 시 냅 스의 안정화 신경 네트워크 연결을 유지 하기 위한 필수적입니다. 또한, 시 냅 스 밀도 적자 신경 조건 Alzheimer의 질병 (광고)2등의 초기 단계에서 보고 되었습니다. 따라서, 정확 하 게 파악 하 고 평가 하는 시 냅 스 수 능력은 두뇌 생리학과 병리학의 평가에 기본적 이다.
극단적인 밀도 시 냅 스의 소형 자연 그대로 뇌 영역에 그들의 정확한 수를 견적 하기 위하여 도전 합니다. CNS에 화학 시 냅 스는 가까운 apposition, 시 냅 스 갈라진된3으로 구분 된 두 개의 뉴런으로 이루어져 있습니다. 미리 시 냅 스 터미널 또는 시 냅 시스 bouton 축 삭에서 나온다 하 고 축적 된 소포 신경 전달 물질은 시 냅 스의 특이성을 정의 하는 포함 하는 구성 됩니다-즉, 조미료 및 감마-aminobutyric 산 (GABA)에 대 한 흥분 성의 고 금지 synapses, 각각. 소포 막 포함 각 신경 전달 물질에 기공을 전송기: 기공을 조미료 운송업 자 (vGlut) 조미료 및 GABA에 대 한 기공을 GABA 전송기 (vGAT). 시 냅 스 후 터미널 고집적 구조 수용 체, 접착 분자, 그리고 비 계 단백질을 포함 하 여 여러 단백질의 구성 이다. 흥분 성의 시 냅 스에서 시 냅 스 후 밀도 95 단백질 (PSD-95)는 가장 풍부한 비 계 단백질4, 흥분 성의 N-methyl-D-aspartate(NMDA-) 및 α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic 산 (AMPA-) 수용 체 변조 기능, 반면 gephyrin 고정 억제 시 냅 스 후 터미널5에 억제 수용 체. 전반적으로, 사전 및 사후 시 냅 스 구획에 단백질의 특이성 차별화 및 시 냅 스의 식별에 도움이.
시 냅 스 숫자의 평가 다른 기술을 수행할 수 있습니다. 가장 일반적인 전자 현미경 (EM), 높은 배율과 해상도 가진 콤팩트 하 고 그대로 두뇌 지역에서 시 냅 스의 분석을 가능 하 게의 사용 이다. 그러나,이 기술은 매우 비싼, 복잡 한 샘플 준비, 요구 하며 매우 시간이 소모 됩니다. 다른 기술은 배열 단층 촬영6, 특수 하 고 비싼 장비는 분석을 수행할 필요에 주요 불리는 사용을 포함 한다. 또한, 유전자 변형 라인 특정 시 냅 스 마커를 표현 냅 번호7을 평가에 유용 하지만 새로운 라인의 세대 수 제한 하 고 비용이 많이 드는, 그리고 단백질의 overexpression 대상에서 바람직하지 못한 될 수 있습니다. 고기입니다.
이러한 제한으로 인해, 편의상 많은 연구자 총 시 냅 스 단백질 수준을 검사 하 여 시 냅 스 수를 평가 합니다. 그러나, 냅 손실 시 냅 스 단백질의 저하 없이 전처리 또는 후 시 냅 스 apposition의 분산에 구조 시 냅 스 개장 결과로 단백질, 상당한 변경 전에 관찰할 수 있습니다. 또한, 광고, 시 냅 스 단백질 수준에 감소 다음 냅 변성 또는 신경 죽음8,9. 총 레벨의 정량화는이 구별을 사용 하지 않습니다. 따라서, 뇌의 시 냅 스 숫자의 평가 대 한 안정적이 고, 정확한 방법을 개발 하는 필요가 있다.
이 문서에서는, 우리는 철저 하 게 파악 하 고 hippocampal 설치류 두뇌 조각에서 면역 형광 검사 현미경 검사 법을 사용 하 여 시 냅 스의 수를 결정 하는 방법을 설명 합니다. 시 냅 스는 punctate 분포에 표시 되는 사전 및 사후 시 냅 스 마커의 colocalization에 의해 정의 됩니다. Wnt 신호는 뇌에서의 연구를 통해이 기술의 타당성을 설명 합니다. Wnts는 은닉 단백질의 형성, 제거, 및 시 냅 스의 유지 보수에 대 한 중요 한. Wnt 캐스케이드, Dickkopf-1 (Dkk1)의 secreted 적의 비보에 유도 마10억제 시 냅 스를 유지 하면서 흥분 성의 시 냅 스 손실에 지도 한다. 우리는 식별 및 Dkk1을 표현 하는 성인 마우스에서 hippocampal 조각에 흥분 성의 억제 시 냅 스의 수 하 고이 기술 조직/문화 준비의 다른 종류의 양도 강조.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>VT1000S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB5905</td>
			<td>vGlut1 (1:2000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibody</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>MA1-046</td>
			<td>PSD-95 (1:500)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibody</td>
			<td>Synaptic Systems</td>
			<td>131 004</td>
			<td>vGAT (1:500)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibody</td>
			<td>Synaptic Systems</td>
			<td>147011</td>
			<td>Gephyrin (1:500)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab5392</td>
			<td>MAP2 (1:10000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibody</td>
			<td>Jackson Laboratories</td>
			<td>706-545-148</td>
			<td>Donkey Anti-Guinea Pig Alexa Fluor 488 (1:600)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab175470</td>
			<td>Donkey Anti-Rabbit Alexa Fluor 568 (1:600)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting medium</td>
			<td>SouthernBiotech</td>
			<td>00-4958-02</td>
			<td>Fluoromount-G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>NA</td>
			<td>FV1000 confocal microscope using a 60x 1.35 numerical aperture (NA) oil objective. For vGlut1, use a 488 laser with a percentage power of 14%. For PSD-95 use a 559 laser with a percentage power of 20%.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analysis software</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>NA</td>
			<td>Volocity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>Swann-Morton</td>
			<td>203</td>
			<td>No 11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super Glue</td>
			<td>Loctite</td>
			<td>1446875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>95% O2, 5% CO2</td>
			<td>BOC</td>
			<td>NA</td>
			<td>Cylinder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>7107</td>
			<td>08-1.0mm thick</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iDkk1 mice</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Mice were obtained by crossing tetO Dkk1 transgenic mice with CaMKII&#945; rtTA2 transgenic mice. TetO Dkk1 transgenic mice and CaMKII&#945; rtTA2 were crossed in a heterozygous state. Both mouse lines were bred in a C57BL/6J background. Single transgenic and WT littermate were used as controls.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents for solutions:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>V800372</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>255793</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ca2Cl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>223506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mg2Cl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M9272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>71505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kynurenic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>K3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>107360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E6758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey Serum</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>S30-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of synapse density in hippocampal rodent brain slices

두뇌, 시 냅 스는 강도와 신경 신호의 확산을 결정 하는 뉴런 사이의 특수 접합. 시 냅 스의 수 개발 및 신경 성숙 하는 동안 엄격 하 게 통제 된다. 중요 한 것은, 시 냅 스 숫자에 적자 인지 기능 장애 발생할 수 있습니다. 따라서, 시 냅 스 숫자의 평가 신경 생물학의 중요 한 부분. 그러나, 시 냅 스는 그대로 뇌에 작고 매우 컴팩트한은, 절대 수의 평가 도전 이다. 이 프로토콜에는 쉽게 식별 하 고 hippocampal 설치류 조각 면역 형광 검사 현미경 검사 법을 사용 하 여 시 냅 스를 평가 하는 방법을 설명 합니다. Hippocampal 조각에 사전 및 postsynaptic 단백질의 공동 지역화를 분석 하 여 높은-품질 confocal 현미경 이미지에 시 냅 스를 평가 하는 3 단계 절차를 포함 합니다. 그것은 또한 어떻게 분석 수행 되 고 흥분 성의 억제 시 냅 스에서 대표적인 예제를 제공 합니다 설명 합니다. 이 프로토콜 시 냅 스의 분석에 대 한 견고한 기초를 제공 하 고 구조와 뇌의 기능을 조사 하 고 연구에 적용할 수 있습니다.

냅 손실 발생 초기에 광고 같은 신경 퇴행 성 질환, 파 킨 슨 병2,,1112. 그러나, 이러한 적자를 기본 분자 메커니즘 제대로 이해 남아 있습니다. Wnt 신호 결함 광고13,14,15,,1617와 연결 되었습니다. Wnts glycoproteins 분 비 되며, 시 냅 스 형성 및 시 냅 스 전송18,19,,2021의 변조에서 필수적인 역할. 최근에, 우리는 성숙한 신 경계10,22에 시 냅 스 유지 보수의 주요 레 귤 레이 터로 Wnts 식별. Wnt 신호 유전자 변형된 쥐의 해 마에서 시 냅 스에 영향을 정확 하 게 공부 우리 뇌 슬라이스 준비와 confocal 현미경 검사 법 평가 시 냅 스 수에 변화를의 이용을 했다. 우리 건강 한 조각 구조 했다 잘 식별 (그림 2A)을 보존. 또한, 시 냅 스 puncta의 선택은 신중 하 게 정의 되었다, 아마 집계 된 단백질 (그림 2B)를 대표 하는 대형 스테인드 개체의 제외와 함께. 이 표준 같은 엄격한 분석 매개 변수가 모든 이미지에 적용 되었습니다.
우리 secreted Wnt 적 Dkk1 성인의 식을 유도 하는 유전자 변형 모델 시스템 사용 항생물질에서 마우스 (iDkk1) 제어 ( 재료의 표참조)10,22. 우리는 성인 해 마에서 Wnt 신호 봉쇄 CA1 지층 radiatum 지역 (그림 3)에서 특별히 흥분 성의 냅 손실 유발 시연 했다. 그림 3A 에서는 흥분 성의 사전 및 포스트 시 냅 스 마커의 대표 confocal 이미지 (vGlut1 및 PSD-95, 각각) 2 주, 뿐만 아니라 그들의 각각 컨트롤 Dkk1을 표현 하는 iDkk1 마우스 hippocampal 조각에서 인수. 우리 Volocity 소프트웨어를 사용 하 여 이러한 이미지를 분석 하 고 다음 iDkk1 쥐의 해 마의 CA1 영역의 vGlut1 및 PSD-95-표시 된 puncta의 공동 지역화 하 여 계량 하는 흥분 성의 시 냅 스의 수에 있는 뜻깊은 감소를 보여주었다는 2 주 동안 Dkk1의 유도 (그림 3B, * p &#60; 0.05; Kruskal-월리스 테스트; 6 마우스 유전자 당)입니다. CA1 지층 radiatum 1000 µ m3 당 흥분 성의 냅 puncta 수는 300 iDkk1 쥐에서 통제 쥐에 있는 500에서 감소 되었다. 반면, 유도 Dkk1 식 억제 시 냅 스 (됨으로 사전 및 포스트 시 냅 스 마커 vGAT와 gephyrin, 사이 공동 지역화로 각각), 그림 4A-B 에서처럼 수 미치지 않았다 (p &#62; 0.05; Kruskal-월리스 테스트; 3 쥐 유전자 당)입니다.
중요 한 것은, 우리는 조각 및 동물 이러한 강력한 결과 생성 하는 데 필요한 적절 한 수를 추정 하는 통계 전력 분석 수행. R를 사용 하 여, 조건 당 약 35 조각 필요 했다 계산 (3 이미지 x 3 조각 x 6 동물 = 36) 큰 효과 크기를 감지 하 (f = 0.4) 80% 신뢰와 (전력 = 0.8) 차단 및 복제 일방통행 ANOVA에 설명 된 대로 단계에서 3.2.6.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56153/56153fig3.jpg"> 
그림 3: iDkk1 쥐에서 hippocampal 조각에 흥분 성의 시 냅 스의 손실. (A)는 CA1 지층 radiatum 쇼 흥분 성의 시 냅 스, vGlut1 및 PSD-95 (흰색 화살표) 사이 공동 지역화 식별의 대표적인 confocal 이미지. 하단 패널은 강조 표시 된 사각형의 높은 확대를 나타냅니다. 스케일 바 = 2 µ m. (B) 제어 및 iDkk1 사이 흥분 성의 시 냅 스의 비율 테이블의 자료 에 언급 한 소프트웨어를 사용 하 여 계량 했다 (* p &#60; 0.05; Kruskal-월리스 테스트; 6 마우스 유전자 당)입니다. 데이터는 대표 ± SEM. 이 그림은 참조10에서 수정 되었습니다. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56153/56153fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56153/56153fig4.jpg"> 
그림 4: 억제 시 냅 스는 iDkk1 마우스에서 hippocampal 조각에서 변경 되지 않습니다. (A) vGAT와 gephyrin (흰색 화살표) 사이 공동 지역화로 식별 되는 억제 시 냅 스의 CA1 지층 radiatum의 대표 confocal 이미지. 하단 패널은 강조 표시 된 사각형의 높은 확대를 나타냅니다. 스케일 바 = 2 µ m. (B) 제어 및 iDkk1 마우스, Volocity 소프트웨어를 사용 하 여 정량으로 사이 억제 시 냅 스의 백분율 (p &#62; 0.05; Kruskal-월리스 테스트; 3 쥐 유전자 당)입니다. 데이터는 대표 ± SEM. 이 그림은 참조10에서 수정 되었습니다. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56153/56153fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>높은 자당 실제 구성 요소</td>
			<td>농도</td>
			<td>노트</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>75 m m</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>25 m m</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>2.5 m m</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2포4, 2 H2O</td>
			<td>1.25 m m</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kynurenic 산</td>
			<td>1.25 m m</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvic 산</td>
			<td>2 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>0.1 m m</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>1mm</td>
			<td>솔루션의 산소 후 추가</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>4 m m</td>
			<td>솔루션의 산소 후 추가</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-포도 당</td>
			<td>25 m m</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>자당</td>
			<td>100 m m</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>잠긴된 챔버 실제 구성 요소</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>125 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>25 m m</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>2.5 m m</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2포4, 2 H2O</td>
			<td>1.25 m m</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>1mm</td>
			<td>솔루션의 산소 후 추가</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
</tr></tbody></table>			<td>1mm</td>
			<td>솔루션의 산소 후 추가</td>
		
		<tr>
			<td>D-포도 당</td>
			<td>25 m m</td>
			<td></td>
		</tr>
	

표 1: 실제 구성입니다.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>차단/permeabilizing 버퍼</td>
			<td>농도</td>
			<td>노트</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>당나귀 세럼</td>
			<td>10%</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>트리톤-X</td>
			<td>0.50%</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>1 x</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 x PBS</td>
			<td></td>
			<td>pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>1.37 M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>27 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2포4</td>
			<td>100 m m</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2포4</td>
			<td>18 m m</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 %PFA/4% 자당</td>
			<td></td>
			<td>pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>1 x</td>
			<td>10 배 희석</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFA</td>
			<td>1.33 M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>자당</td>
			<td>117 m m</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
표 2: 완충기 immunofluorescent 얼룩에 사용입니다.

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Evaluation of Synapse Density in Hippocampal Rodent Brain Slices

정확 하 게 파악 하 고 분석 hippocampal 조각 면역 형광을 사용 하 여 시 냅 스에 대 한 프로토콜은이 문서에 설명 되어.

시 냅 스 밀도 Hippocampal 설치류 두뇌 분할 영역에서의 평가

In the brain, synapses are specialized junctions between neurons, determining the strength and spread of neuronal signaling. The number of synapses is ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Preparation of Oligomeric &beta;-amyloid1-42 and Induction of Synaptic Plasticity Impairment on Hippocampal Slices

Preparation of Oligomeric ÃƒÅ½Ã‚Â²-amyloid1-42 and Induction of Synaptic Plasticity Impairment on Hippocampal Slices

β - 아밀로이드 Oligomeric의 준비 1-42</subHippocampal 조각에 시냅틱 소성 장애의>와 유도

Impairment of synaptic connections is likely to underlie the subtle amnesic changes occurring at the early stages of Alzheimer s Disease (AD). ...

연구

신경과학

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로던트에서 뉴런과 비 인간 메이트 뇌 조각의 DiOLISTIC 라벨링

DiOLISTIC staining uses the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons of brain slices (Gan et al., 2009; O'Brien and Lummis, 2007; ...

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Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of ...

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Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

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낮은 밀도 차 해마 신경 세포 문화

The ability to probe the structure and physiology of individual nerve cells in culture is crucial to the study of neurobiology, and allows for flexibility ...

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급성 Hippocampal 조각에 작은 볼륨 재활용-, 관류-침수 형 챔버 시스템 유지에 시 냅 스가 소성을 기록

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful ...

Recording and Modulation of Epileptiform Activity in Rodent Brain Slices Coupled to Microelectrode Arrays

녹음 및 Microelectrode 배열에 결합 하는 설치류 뇌 조각에 Epileptiform 활동의 변조

Temporal lobe epilepsy (TLE) is the most common partial complex epileptic syndrome and the least responsive to medications. Deep brain stimulation (DBS) ...

Assessment of Long-term Depression Induction in Adult Cerebellar Slices

성인 소뇌 슬라이스에 장기 우울증 유도의 평가

Synaptic plasticity provides a mechanism for learning and memory. For cerebellar motor learning, long-term depression (LTD) of synaptic transmissions from ...