Name: evaluation of synapse density in hippocampal rodent brain slices
Uploaded: 2017-10-06T14:00:00
Duration: 7 min 44 s
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Este trabalho foi apoiado pelo MRC, UE FP7, PHELIPE, Wellcome Trust e Parkinson UK. Também gostaríamos de agradecer a Sra. Johanna Buchler por sua contribuição de imagens confocal e os membros do laboratório para a sua entrada construtivo sobre o manuscrito e metodologia.

todos os experimentos utilizando ratos e ratos foram aprovados e realizados utilizando programação 1 procedimentos cobertos ao abrigo da lei do escritório Home animais (procedimentos científicos) 1986. A receita de fluido cerebrospinal artificial (ACSF) pode ser encontrada na tabela 1.
 1. preparação de fatias Hippocampal aguda <ol><li>remover o cérebro de rato tão rapidamente quanto possível, usando uma espátula e afiadas tesouras para cortar o crânio e coloque-o na gelada, oxigenado (95% O 2, 5% CO 2), ACSF alta-sacarose (~ 100 mL).</li>
	<li>Coloque o cérebro do rato sobre uma placa de Petri e remover o cerebelo e uma pequena parte do córtex frontal com um bisturi antes hemisecting para baixo da linha média do cérebro.</li>
	<li>Posicione os dois hemisférios do lado que foi apenas corte e cole cada Hemisfério para o palco de um vibratome.</li>
	<li>Cortar seções de 200-300 µm de espessura da região completa de interesse. No caso do hipocampo, aproximadamente 3 a 4 fatias por hemisfério devem ser obtidas.</li>
	<li>Com uma pipeta Pasteur plástica, transfira as fatias para uma câmara submersa no oxigenado (95% O 2, 5% CO 2) ACSF. Manter a 34 ° C por 30 min. 
	Nota: O tratamento de fatias com agentes farmacológicos ativos, tais como proteínas recombinantes Dkk1, pode ser executado nesta fase, adicionando os agentes para a câmara de fatia.</li>
	<li>Remover as fatias da câmara usando um pincel, coloque-os em uma placa de 24 e corrigir por 20 min a 1 h em paraformaldeído 4% (sacarose PFA)/4% à temperatura ambiente (RT). 
	Cuidado: PFA é tóxica, use proteção adequada.</li>
	<li>Lavar as fatias três vezes em 1X PBS (10 min cada). 
	Nota: O protocolo pode ser pausado aqui por 1-2 dias, enquanto as fatias são mantidas a 4 ° C em 1X PBS.</li>
</ol> 2. Imunofluorescência para marcadores sinápticos Nota: as receitas de todos os buffers usados podem ser encontradas na tabela 2.
<ol><li>Substituir a PBS com buffer de bloqueio/permeabilizing (tabela 2) em poços de fatia e incubar a RT para 4-6 h.</li>
	<li>Diluir o anticorpo policlonal cobaia contra vGlut1 a uma diluição de 1:2,000 no buffer de bloqueio/permeabilizacao. 
	Nota: vGlut1 é um marcador para visualização de terminal excitatório pré-sinápticos. Para identificação de pós-sinápticos excitatórios sinapse, usar um anticorpo policlonal contra PSD-95 e diluído 1: 500 na mesma solução. Use um volume mínimo de 300 µ l em cada poço. Para identificar a localização anatômica do hipocampo, use um anticorpo que pode também identificar a estrutura neuronal, como MAP2 ou tubulina. Resolver as concentrações corretas de todos os anticorpos primários para os marcadores sinápticos de escolha (pré e pós sináptica) e diluir em buffer fresco de bloqueio/permeabilizing.</li>
	<li>Incubar as fatias na solução de anticorpo primário durante a noite (ou 1-2 dias), a 4 ° C. utilizar uma plataforma de agitação com movimento vigoroso.</li>
	<li>Lavar as fatias três vezes em PBS (10 min cada).</li>
	<li>Diluído a 1: 500 anticorpos secundários apropriados em tampão de bloqueio. Por exemplo, quando usando o anticorpo de cobaia vGlut1, aplica um anticorpo secundário que reconhece o componente de cobaia (por exemplo, burro anti-Guiné-porco) conjugado com um fluoróforo específico. Ao usar o anticorpo de coelho PSD-95, aplicar um anticorpo secundário que reconhece o componente de coelho (por exemplo, burro anticoelho), conjugado com um fluoróforo específico diferente.</li>
	<li>Incubar as fatias nesta solução por 2-3 h no RT. Certifique-se de que as fatias são protegidas contra a luz, como anticorpos secundários são sensíveis à luz.</li>
	<li>Lavar as fatias três vezes em PBS (10 min cada).</li>
	<li>, Com cuidado, retire as fatias da placa 24 usando um pincel e colocá-los uniformemente em lâminas de vidro previamente rotulados. Adicionar uma gota de meio de montagem em cima de cada fatia e em seguida, coloque delicadamente uma lamela de vidro em cima as fatias. Evite a formação de bolhas de ar. Tome cuidado para usar suficiente meio de montagem (300-400 µ l), como uma quantidade insuficiente pode levar a secar fatias.</li>
	<li>Deixar secar por um período mínimo de 1-2 dias no RT e manter os slides, protegidos da luz.</li>
	<li>Armazenar os slides a 4 ° C, a curto prazo, mas para armazenamento a longo prazo, mantê-los em -20 ° C.</li>
</ol> 3. Análise e aquisição de imagens confocal <ol><li>usando laser confocal, microscopia eletrônica de varredura de imagem.
	<ol><li>Identificar a região do hipocampo para criação da imagem (por exemplo, o cornu ammonis 1 e 3 (CA1, CA3) ou o giro denteado (DG)) através de 10x ou 20x objetivo.</li>
		<li>Mudança para um 40 x ou x 63 objectivo de imersão de óleo para garantir que a anatomia da fatia está intacta, identificando neuritos contínuos e organizada estrutura. Use um marcador neuronal, como MAP2, como referência ( figura 1A).</li>
		<li>, Posteriormente, mudar para um 60 x objetivo de óleo-imersão (nd = ~1.3 - 1,4) e ajustar as configurações de cada canal para obter sinal ideal e contraste. Definir a intensidade de cada laser para evitar a saturação de qualquer pixels usando uma opção de alto / baixo contraste. 
		Nota: Estas configuração vai depender o microscópio usado, mas referir-se a Tabela de materiais para as configurações de energia do laser usado na Figura 2, Figura 3, e Figura 4. Para melhores resultados, use uma resolução de 1024 x 1024 pixels. As configurações devem permanecer constantes em todas as condições diferentes da mesma experiência. Zoom adicional pode ser aplicado, se necessário.</li>
		<li>Avaliar a profundidade onde a mancha é mesmo e adquirir pilhas de imagem de pelo menos 8 equidistantes (250 nm) aviões. Em seguida, tomar 3 pilhas adjacentes imagens representativas da mesma área de interesse por fatia. 
		Nota: A profundidade pode variar de uma fatia para outro, mas sempre deve ser aproximadamente 2-5 µm da superfície da fatia.</li>
		<li>Repetir a aquisição em pelo menos 3 fatias por condição e de 6 a 8 animais por grupo de tratamento.</li>
	</ol></li> <li>Análise de imagem. 
	Nota: Use um software de análise de imagem automático (consulte a Tabela de materiais). Observe que alguns sistemas requerem uma licença, enquanto outros estão livres, tais como ImageJ. O software utilizado deve analisar as imagens em 3D, tendo em conta todos os aviões da pilha fotografada. Consulte a Tabela de materiais para os detalhes do software utilizado na análise da imagem ( Figura 1).
	<ol><li>Uso um protocolo de limiar de intensidade custom-baseada para identificar todos os partitura sináptica e marcadores neuronais, que são otimizados manualmente e selecionados dentro do software [ver Tabela de materiais para o software específico utilizado neste protocolo]. 
		Nota: O software identifica uma intensidade mínima e máxima para cada fluoróforo e associa um percentual de intensidade para cada objeto reconhecido. Note-se que o percentual de intensidade variará de acordo com o fluoróforo usado e o anticorpo contra o marcador sináptico.</li>
		<li>Para marcadores sinápticos, certifique-se de que o tamanho filtra (&#62; 0.1µm 3 e &#60; 0.8µm 3) são selecionados dentro do software e aplicado à imagem. Ajuste os parâmetros para garantir que os objetos selecionados não se sobrepõem. Excluir qualquer objeto que são muito grande ou muito pequeno para ser considerado partitura sináptica (ver Figura 2B). 
		Nota: Uma vez otimizado, os mesmos valores de limiar são então aplicados a todas as imagens dentro de um determinado experimento.</li>
		<li>Quantificar o número médio, intensidade e volume de partitura sináptica individual (pré ou pós-sinápticos) usando os protocolos otimizados limiar selecionados dentro do software. Normalize o número de partitura para o volume do campo de imagem (mais ou menos 16.928 µm 3 no sistema usado aqui). Normalizar a intensidade sináptica partitura para a intensidade do marcador neuronal referência. 
		Nota: As sinapses são definidas como a localização co entre marcadores pré e pós-sináptica. Uma vez os protocolos de limiar para pré e pós sináptica partitura have foi estabelecida, o software deve identificar a localização co de partitura sináptica como a sobreposição de 1 pixel ou mais em um único plano. 
		Nota: Para a análise estatística, confirme que todos os conjuntos de amostras seguem normalidade e homogeneidade de variância, conforme determinado pelo Lilliefords e testes χ2, respectivamente. Amostras, mostrando uma distribuição normal e a homogeneidade da variância devem ser analisadas com testes paramétricos, conforme descrito abaixo. Por exemplo, análise de partitura sinápticos excitatórios deve ser realizada uma ANOVA One-Way com bloqueio e replicação. Cada experimento individual deve ser considerado como um bloco; Normalmente, existem três experimentos independentes, cada um com 1-3 ratos de cada condição.</li>
	</ol></li></ol> <img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56153/56153fig1.jpg" /> Figura 1: análise de partitura sináptica através da análise de imagem software. (A) Screenshot da personalização de protocolo de limiar de intensidade. O exemplo dado é para o PSD-95, em que a partitura selecionada tem um tamanho definido de &#62; 0.1 µm 3 e &#60; 0,8 µm 3 e presentes minimizados objetos sobrepostos. Observe que a imagem mostrada é para um avião confocal permitir a fácil visualização de partitura sináptica e seleção do parâmetro exato. (B) Screenshot da análise de saída a partir do software (após a seleção do protocolo otimizado). Um exemplo de partitura sináptica cru números medições com base no volume. Esses valores são então exportados para um software de planilha eletrônica. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56153/56153fig1large.jpg" target="_blank"> clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
 <img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56153/56153fig2.jpg" /> Figura 2: verificação da qualidade das configurações de fatia e parâmetro para partitura sináptica. (A) representante imagens confocal (objetiva de 40 x) da região de interesse: o CA1 stratum radiatum (sr) e estrato oriens (assim) de uma fatia hippocampal são identificados pela coloração MAP2. Barra de escala = 2 µm. (B) imagens Confocal (60 x objetivo e um adicional 1.3 X ampliação do software de aquisição) do CA1 stratum radiatum, com marcadores excitatórios-vGlut1 (verde) e PSD-95 (vermelho)-de fatias hippocampal. Observe a identificação de partitura claro pré e pós-sináptica. Maior do que 0,8 µm 3 partitura excluem-se da quantificação (setas brancas). Barra de escala = 2 µm (C) Confocal imagens (60 x objetivo e um adicional 1.3 X ampliação do software de aquisição) do CA1 stratum radiatum, com marcadores excitatórios-vGlut1 (verde)-do criostato-corte hippocampal seções do cérebro inteiro fixa-se no programa de acção. Observe a presença de grandes buracos e manchas irregulares, agrupados vGlut1. Barra de escala = 2 µm. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56153/56153fig2large.jpg" target="_blank"> clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Os autores não têm nada para divulgar.

A avaliação precisa do número da sinapse é essencial para o campo da neurociência. Aqui, nós mostramos como avaliar a densidade das sinapses região CA1 stratum radiatum de fatias hippocampal como um sistema modelo. O significado no que diz respeito a métodos existentes é demonstrado em nosso recente artigo de pesquisa sobre o efeito da deficiência de Wnt no hipocampo, e onde também foram avaliados o número sinapse por single-seção EM10. A magnitude da perda de sinapse são semelhantes entre EM single-seção e o cérebro-fatia método descrito aqui10. Assim, esta constatação demonstra a precisão e a confiabilidade da técnica.
Importante, uma limitação tanto EM single-seção e imunocoloração sinapses, tal como apresentado aqui, é a incapacidade para estimar com precisão o número absoluto de sinapse para uma região específica do cérebro. Com efeito, é importante identificar quaisquer alterações morfológicas globais, como mudanças no volume total poderiam impactar número sináptico. Outra limitação é que certos anticorpos são menos eficientes na coloração de regiões do cérebro intacto, parcialmente devido à extrema densidade de conexões sinápticas. Nós experimentamos maior qualidade coloração de vGlut1 e gephyrin usando esta fatia preparação e fixação de PFA subsequente para um máximo de 1 h, comparado à fixação imediata do cérebro inteiro em PFA (Figura 2). Este último levou a coloração sináptica agrupados, com buracos no tecido. No entanto, a penetração de anticorpo vGlut1 ainda é restrito em ambos os métodos (um par de dezenas de mícrons). Nós não superar essa limitação, mesmo com aumento de anticorpos incubação, mas fornecendo a penetração de anticorpo é maior que a profundidade total que é fotografada, não deve haver nenhuma influência no resultado final. Além disso, especial deve ter cuidado para garantir que a mancha está mesmo em toda a pilha inteira adquirida.
Em nosso estudo, nós quisemos distinguir excitatórios de sinapses inibitórias. Consequentemente, nós escolhemos vGlut1/PSD-95 e vGAT/gephyrin, respectivamente, como estas proteínas são altamente expressa no hipocampo de rato adulto e são específicas para cada subtipo de sinapse4,5. Outros marcadores sinápticos excitatórios e inibitórios poderiam ter sido utilizados para identificar cada sinapse respectivo, tais como enriquecido em cada sinapse, incluindo receptores NMDA e Leandro para os receptores excitatórios e receptores GABAA para sinapses inibitórias. Outros neurotransmissores ou neuromodulators também podem ser identificados com nosso protocolo, garantindo que os anticorpos específicos estão disponíveis, como mostrado por sinapses dopaminérgicos no striatum22. Além disso, reduzindo a espessura de cada fatia de 120 µm pode parcialmente superar a baixa quantidade de amostras obtidas com fatias agudas, que é imperativo para estudos em estruturas do cérebro pequeno como a amígdala.
As aplicações futuras do nosso protocolo poderiam ser implementadas no estudo de áreas diferentes do cérebro e transtornos. Por exemplo, no corpo estriado (uma região do cérebro associada com a doença de Parkinson), uma combinação de vGlut2/PSD-95 ou vGlut1/PSD-95 pode ser usada para diferenciar entre as sinapses excitatórias de afferents provenientes do córtex ou tálamo, respectivamente22.
Em conclusão, temos mostrado um método confiável para examinar o número de sinapses nos tecidos do cérebro usando marcadores pré e pós-sináptica para definir uma sinapse. Passos críticos incluem a preparação de fatias hippocampal boas, um tempo de fixação de até 1 h em PFA, a aplicação de suficiente meio de montagem, o uso de anticorpos fiáveis, configurações de aquisição de imagem apropriada e a detecção de partitura sináptica rigorosas. Em última análise, este método é relativamente rápido e facilmente reproduzível por alguns laboratórios que têm acesso a um microscópio confocal.

O cérebro humano é composto de aproximadamente 1014 sinapses. Número de sinapse é fortemente regulamentado durante o desenvolvimento e maturação do sistema nervoso central (SNC). Durante todo o desenvolvimento, o número de sinapse é modulado por sinaptogênese e poda para formar redes neuronais funcionais. Aprendizagem e memória são suportados pelo Regulamento da sinapse número e força, um processo conhecido como potenciação sináptica e depressão1. Importante, a estabilização das sinapses maduras é essencial para manter as conexões de rede neuronal. Além disso, déficits na densidade de sinapse foram relatados nas fases iniciais das condições neurodegenerativas como a doença de Alzheimer (AD)2. Portanto, a capacidade de precisão de identificar e avaliar o número de sinapse é fundamental para a avaliação da patologia e fisiologia do cérebro.
A extrema densidade e natureza compacta de sinapses tornam desafiadora para estimar seu número exacto em áreas do cérebro intacto. Sinapses químicas no SNC são feitas de dois neurônios em aposição perto, separados por uma fissura sináptica3. O terminal pré-sináptica, ou bouton sináptica, emerge de um axônio e consiste de vesículas acumuladas, que contêm os neurotransmissores que definem a especificidade de uma sinapse — ou seja, glutamato e ácido gama - aminobutírico (GABA) para excitatórios e inibitório sinapses, respectivamente. As membranas das vesículas contêm vesiculares transportadores específicos para cada neurotransmissor: transporte vesicular glutamato (vGlut) para glutamato e transportador vesicular de GABA (vGAT) para GABA. O terminal pós-sináptica é uma estrutura altamente densa composta de várias proteínas, incluindo moléculas de adesão, receptores e proteínas de andaime. Nas sinapses excitatórias, proteína pós-sináptica de densidade-95 (PSD-95) é o mais abundante andaime proteína4, modulando excitatórios N-methyl-D-aspartate(NMDA-) e receptor de ácido α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic (Leandro) função, Considerando que gephyrin Ancora receptores inibitórios para o terminal pós-sináptica inibitória5. Total, a especificidade das proteínas para compartimentos pré e pós-sináptica auxílio na diferenciação e identificação dos subtipos de sinapse.
A avaliação do número de sinapse pode ser realizada com diferentes técnicas. O mais comum é o uso da microscopia de elétron (EM), que permite a análise da sinapse em áreas do cérebro intacto e compacto com alta ampliação e resolução. No entanto, esta técnica é muito cara, exige a preparação da amostra complicado e é muito demorada. Outras técnicas incluem o uso de matriz tomografia computadorizada6, que tem uma grande desvantagem em que requer equipamento especializado e caro para realizar a análise. Além disso, linhas transgênicas expressando marcadores sinápticos específicos são úteis na avaliação de sinapse número7, mas a geração de novas linhas pode ser restritivas e caro, e a superexpressão de proteínas pode resultar em indesejável fora do alvo fenótipos.
Devido a essas limitações e para manter a simplicidade, muitos pesquisadores avaliam número de sinapse, examinando os níveis de proteína total sináptica. No entanto, perda de sinapse pode ser observada antes de alterações substanciais em proteína, como resultados de remodelação sinápticos estruturais na dispersão de aposição de pré ou pós-sináptica, com nenhuma degradação de proteínas sinápticas. Além disso, no anúncio, os níveis de proteína sináptica são seguir reduzida sinapse degeneração ou morte neuronal8,9. A quantificação dos níveis totais não permite que esta distinção. Assim, há uma necessidade de desenvolver um método confiável, acessível e preciso para a avaliação do número de sinapses no cérebro.
Neste artigo, descrevemos como completamente identificar e determinar o número de sinapses usando microscopia de imunofluorescência em fatias hippocampal cérebro de roedor. As sinapses são definidas pelo colocalization de marcadores pré e pós-sináptica, que aparecem em uma distribuição punctate. Vamos demonstrar a validade desta técnica através do estudo da Wnt sinalização no cérebro. Wnts são secretadas proteínas importantes para a formação, eliminação e manutenção das sinapses. A indução na vivo de um antagonista secretada da cascata da Wnt, Dickkopf-1 (Dkk1), leva à perda sináptica excitatória preservando sinapses inibitórias no hipocampo10. Podemos ilustrar a identificação e contagem das sinapses excitatórias e inibitórias em fatias hippocampal de um rato adulto expressar Dkk1 e destacar a possibilidade de transferência desta técnica a outros tipos de preparações de cultura do tecido.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>VT1000S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB5905</td>
			<td>vGlut1 (1:2000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibody</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>MA1-046</td>
			<td>PSD-95 (1:500)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibody</td>
			<td>Synaptic Systems</td>
			<td>131 004</td>
			<td>vGAT (1:500)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibody</td>
			<td>Synaptic Systems</td>
			<td>147011</td>
			<td>Gephyrin (1:500)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab5392</td>
			<td>MAP2 (1:10000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibody</td>
			<td>Jackson Laboratories</td>
			<td>706-545-148</td>
			<td>Donkey Anti-Guinea Pig Alexa Fluor 488 (1:600)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab175470</td>
			<td>Donkey Anti-Rabbit Alexa Fluor 568 (1:600)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting medium</td>
			<td>SouthernBiotech</td>
			<td>00-4958-02</td>
			<td>Fluoromount-G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>NA</td>
			<td>FV1000 confocal microscope using a 60x 1.35 numerical aperture (NA) oil objective. For vGlut1, use a 488 laser with a percentage power of 14%. For PSD-95 use a 559 laser with a percentage power of 20%.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analysis software</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>NA</td>
			<td>Volocity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>Swann-Morton</td>
			<td>203</td>
			<td>No 11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super Glue</td>
			<td>Loctite</td>
			<td>1446875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>95% O2, 5% CO2</td>
			<td>BOC</td>
			<td>NA</td>
			<td>Cylinder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>7107</td>
			<td>08-1.0mm thick</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iDkk1 mice</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Mice were obtained by crossing tetO Dkk1 transgenic mice with CaMKII&#945; rtTA2 transgenic mice. TetO Dkk1 transgenic mice and CaMKII&#945; rtTA2 were crossed in a heterozygous state. Both mouse lines were bred in a C57BL/6J background. Single transgenic and WT littermate were used as controls.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents for solutions:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>V800372</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>255793</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ca2Cl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>223506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mg2Cl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M9272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>71505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kynurenic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>K3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>107360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E6758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey Serum</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>S30-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of synapse density in hippocampal rodent brain slices

No cérebro, sinapses são junções especializadas entre os neurônios, determinar a força e a propagação da sinalização neuronal. O número de sinapses é fortemente regulamentado durante o desenvolvimento e maturação neuronal. Importante, os défices em número de sinapse podem levar a disfunção cognitiva. Portanto, a avaliação do número de sinapse é parte integrante da neurobiologia. No entanto, como as sinapses são pequenas e altamente compacta no cérebro intacto, a avaliação do número absoluto é um desafio. Este protocolo descreve um método para identificar e avaliar as sinapses em fatias hippocampal roedores, utilizando microscopia de imunofluorescência facilmente. Ele inclui um processo de três etapas para avaliar as sinapses em imagens de alta qualidade de microscopia confocal, analisando a localização co das proteínas pré e pós-sinápticas em fatias hippocampal. Ele também explica como a análise é realizada e dá exemplos representativos de sinapses excitatórios e inibitórios. Este protocolo fornece uma base sólida para a análise de sinapses e pode ser aplicado a qualquer pesquisa investigando a estrutura e função do cérebro.

Perda de sinapse ocorre no início de doenças neurodegenerativas, como AD e a doença de Parkinson2,11,12. No entanto, os mecanismos moleculares subjacentes a estes défices permanecem mal compreendidos. Deficiências na sinalização Wnt têm sido associadas com AD13,14,15,16,17. Wnts são glicoproteínas secretadas e desempenham um papel essencial na formação da sinapse e a modulação da transmissão sináptica18,19,20,21. Recentemente, nós identificamos Wnts como reguladores chaves da manutenção sináptica no sistema nervoso maduro,10,22. Para estudar com precisão o impacto de sinalização de Wnt em sinapses no hipocampo de camundongos geneticamente modificados, aproveitamos uma preparação de fatia do cérebro e microscopia confocal para avaliar as alterações no número de sinapse. Nós identificamos fatias saudáveis em que a estrutura era bem preservadas (Figura 2A). Além disso, a seleção de partitura sináptica cuidadosamente foi definida, com a exclusão de objetos grandes manchadas, provavelmente representando proteínas agregadas (Figura 2B). Este critério foi aplicado a todas as imagens, com os mesmos parâmetros de análise rigorosa.
Usamos um sistema de modelo transgênico que induz a expressão do antagonista de Wnt secretada Dkk1 em adultos (iDkk1) de ratos sob tetraciclina controlam (veja a Tabela de materiais)10,22. Demonstrámos que o bloqueio de sinalização de Wnt no hipocampo adulto provoca perda de sinapse excitatória, especificamente na região CA1 stratum radiatum (Figura 3). Figura 3A ilustra imagens confocal representante dos marcadores pré e pós-sinápticos excitatórios (vGlut1 e PSD-95, respectivamente) adquiridos de fatias hippocampal de ratos iDkk1 expressando Dkk1 para duas semanas, bem como seus respectivos controles. Analisamos estas imagens utilizando o software Volocity e demonstrou uma redução significativa do número de sinapses excitatórias, quantificada pela localização co do vGlut1 - e PSD-95-rotulado partitura na região CA1 do hipocampo de ratos iDkk1 seguindo o indução de Dkk1 por duas semanas (Figura 3B, * p &#60; 0,05; Teste de Kruskal-Wallis; 6 ratos por genótipo). No CA1 stratum radiatum, o número de partitura excitatório sinapse por 1.000 µm3 foi reduzido de 500 em ratos de controle para 300 em ratos iDkk1. Em contraste, induzida Dkk1 expressão não afetou o número de sinapses inibitórias (identificado pela localização co entre o pré e pós-sináptica marcadores vGAT e gephyrin, respectivamente), como mostrado na Figura 4A-B (p &#62; 0,05; Teste de Kruskal-Wallis; 3 ratos por genótipo).
Importante, realizamos uma análise do poder estatístico para estimar o número adequado de animais necessários para gerar estes resultados robustos e fatias. Usando R, calculamos que aproximadamente 35 fatias por condição eram necessários (animais de fatias x 6 de 3 imagens x 3 = 36) para detectar um efeito de grande tamanho (f = 0,4) com 80% de confiança (poder = 0,8) em uma ANOVA One-Way com bloqueio e replicação, conforme descrito na etapa 3.2.6.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56153/56153fig3.jpg"> 
Figura 3: perda de sinapses excitatórias em fatias hippocampal de ratos iDkk1. (A) imagens confocal representante de CA1 estrato radiatum mostrar excitatórios sinapses, identificados por localização co entre vGlut1 e PSD-95 (setas brancas). O painel inferior representa uma ampliação maior do retângulo realçada. Escala de barras = 2 µm. (B) a percentagem de sinapses excitatórias entre controle e iDkk1 foi quantificada utilizando o software mencionado na Tabela de materiais (* p &#60; 0,05; Teste de Kruskal-Wallis; 6 ratos por genótipo). Os dados são representados ± SEM. Esta figura foi modificada de referência10. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56153/56153fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56153/56153fig4.jpg"> 
Figura 4: sinapses inibitórias são inalteradas em fatias hippocampal de ratos iDkk1. (A) imagens confocal representante do CA1 stratum radiatum de sinapses inibitórias identificado pela localização co entre vGAT e gephyrin (setas brancas). O painel inferior representa uma ampliação maior do retângulo realçada. Escala de barras = 2 µm. (B) percentagem de sinapses inibitórias entre ratos controle e iDkk1, conforme quantificada utilizando o software Volocity (p &#62; 0,05; Teste de Kruskal-Wallis; 3 ratos por genótipo). Os dados são representados ± SEM. Esta figura foi modificada de referência10. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56153/56153fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alta sacarose ACSF componentes</td>
			<td>Concentração</td>
			<td>Notas</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>75 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>25 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>2,5 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4, 2h2O</td>
			<td>1,25 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ácido cinurênico</td>
			<td>1,25 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ácido pirúvico</td>
			<td>2 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>0,1 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>1 mM</td>
			<td>Adicionar após a oxigenação da solução</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>4 mM</td>
			<td>Adicionar após a oxigenação da solução</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glicose</td>
			<td>25 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sacarose</td>
			<td>100 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Câmara submersa ACSF componentes</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>125 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>25 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>2,5 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4, 2h2O</td>
			<td>1,25 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>1 mM</td>
			<td>Adicionar após a oxigenação da solução</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
</tr></tbody></table>			<td>1 mM</td>
			<td>Adicionar após a oxigenação da solução</td>
		
		<tr>
			<td>D-glicose</td>
			<td>25 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
	

Tabela 1: Composição de ACSF.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Buffer de bloqueio/permeabilizing</td>
			<td>Concentração</td>
			<td>Notas</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soro de burro</td>
			<td>10%</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X</td>
			<td>0,50%</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>1 x</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 x PBS</td>
			<td></td>
			<td>pH de 7,4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>1,37 M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>27 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>100 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>18 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% PFA/4% de sacarose</td>
			<td></td>
			<td>pH de 7,4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>1 x</td>
			<td>Diluir de 10 x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFA</td>
			<td>1,33 M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sacarose</td>
			<td>117 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 2: Buffers usados para coloração de imunofluorescência.

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Evaluation of Synapse Density in Hippocampal Rodent Brain Slices

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