Name: dissection and immunofluorescent staining of mushroom body and photoreceptor neurons in adult drosophila melanogaster brains
Uploaded: 2017-11-06T16:45:00
Duration: 10 min 13 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains at JoVE.com

نود أن نشكر باك تشانغوي واليسيا فريلاس مورتيمر للتدريس في البداية SMK تقنية تشريح الدماغ. كما نشكر أعضاء فريق مختبر كين موبيرغ، لا سيما "جولات كريس"، للغاية قراءة المخطوطة. الأجسام المضادة للاعتراف Fas2 (4 1) وتشاوبتين (24B10) تم الحصول عليها من البنك هيبريدوما الدراسات الإنمائية. 24B10 جسم أودع دشب واسطة Benzer سيمور ونانسي كوليي24،،من6061، أودع جسم 4 1 دشب واسطة كوري جودمان 22،،من2356. وتم الحصول على الأرصدة يطير من مركز الأسهم بلومينغتون. نود أيضا أن نشكر أوهايو البحوث الزراعية ومركز تصوير مسيك مركز التنمية (أواردك) لاستخدام المجهر [كنفوكل] صورة العقل المدبر في الشكل 4A ومعتمد SMK باء بمنحه من NICHD (HD084241 R15 1-01A1).

الكتاب يعلن أن لديهم لا تضارب المصالح المالية.

طريقة التشريح والتصور الوارد وصفها أعلاه يمكن استخدامها في مجموعة متنوعة واسعة من إيمونوستينينج، ويعيش تطبيقات التصوير. نحن أوجزت بروتوكول إيمونوستينينج عامة، وقد سلطت الضوء على إحدى الطرق التي يمكن استخدامها ماركم لتصور محواري مورفولوجيا الخلايا العصبية الفردية فطر الجسم. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أيضا أن تستخدم هذه الإجراءات العامة لتصوير مناطق الدماغ الأخرى الثابتة أو الكبار طازجة تشريح العقول48،65. تصوير الحية قد توفر نهجاً أكثر فعالية عند تحليل أنماط التعبير من الفخاخ محسن، مراسل الجينات أو تقليد خطوط66، على سبيل المثال. لمنع التقاط القطع الأثرية من موت الخلايا أثناء التصوير الحي للتجارة والنقل في الأنسجة غير المثبتة، العقول ينبغي تشريح في 1 × الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) أو HL3 وسائل الإعلام48، التي شنت على شرائح الجسر في 1 x برنامج تلفزيوني (أو HL3)، وتصويرها في أقل من 15-20 دقيقة الرعاية ينبغي أيضا لإزالة قدر القصبة الهوائية قدر الإمكان من تشريح الدماغ قبل التصوير، نظراً لأنها يمكن أن تتداخل مع التصور للأسفار التجارة والنقل.
حين تكون الشروط المصبوغة لتقييم مورفولوجيا الخلايا العصبية الجسم ومستقبله الفطر الراسخة نسبيا24،61،67، إضفاء الطابع المحلي على بروتين معين من الفائدة في هذه الخلية قد تتطلب أنواع واسعة استكشاف الأخطاء وإصلاحها والتحسين. على وجه الخصوص، ينبغي أن يكون الأمثل العديد من الخطوات الحاسمة، بما في ذلك التخفيف جسم وحظر تركيز العنصر المخزن المؤقت، والتثبيت، لتوليد نتائج آخر استنساخه وموثوق بها. أولاً، ينبغي تحديد تركيز الأمثل لجسم الأولية. على الرغم من أن الأجسام المضادة المتاحة تجارياً غالباً ما يكون إضعاف مقترح (وغالباً في البداية نبدأ باستخدام هذا التركيز)، ونادراً ما تحدد هذه القيم تجريبيا على أنسجة المورفولوجية . ولذلك، اختبار سلسلة من تخفيف جسم الابتدائي مجموعة فوق وتحت انطلاق اقتراح الشركة المصنعة غالباً ما ينتج في تلطيخ أكثر تحديداً. بينما تمييع جسم الابتدائي يمكن أن يكون لها تأثير كبير على تلطيخ الدقة والتحديد تحدد، هي المحتضنة أدمغة الوقت في جسم الأولية التي تحتوي على الحلول يمكن أن تختلف مع تأثير يذكر على النتيجة الإجمالية. على سبيل المثال، أننا لاحظنا نتائج مماثلة عندما تفرخ تشريح أدمغة مع جسم Fas2 جسم الابتدائي لمدة سنتين، ثلاثة، أو حتى أربعة أيام في 4 درجات مئوية. على الرغم من أن نوصي بليلتين على الأقل، لدينا أيضا المحتضنة العقول في حل جسم الأولية لليلة واحدة وحصل على تلطيخ استنساخه. الأهم من ذلك، يحد من مقدار الوقت هي المحتضنة العقول في جسم الثانوية إلى 3 ساعات في درجة حرارة الغرفة (أو ليلة واحدة في 4 درجات مئوية) يساعد على حد غير محددة ملزمة للأجسام المضادة الثانوية لانسجة المخ.
ثانيا، قد يكون من الضروري استخدام الكواشف "حظر" إضافية للقضاء على خلفية غير المرغوب فيه إشارة. وتشمل خيارات زيادة تركيز خ ع ~ 10%، مضيفاً ألبومين المصل البقري 1-10% (BSA) إلى حظر والابتدائي/الثانوي حلول جسم أو الامتزاز قبل الأجسام الأولية بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية مع المورفولوجية الأجنة (انظر مرجع68، القسم 2.9، الخطوة 3).
في حين أننا قد كتبت البروتوكول أعلاه باستخدام PTN كالمخزن المؤقت المقترح لتثبيت كافة، المياه والصرف الصحي، وجسم حضانة الخطوات، تثبيت الأنسجة في مخازن أخرى (مثل حزب العمال التقدمي ويم، المدرجة في الجدول المواد) قد ينتج عن الاختلافات العميقة في قوة الإشارة. على سبيل المثال، أظهرت الدراسات السابقة أن ه Cyclin قابل للكشف في أقراص imaginal اليرقات عندما يتم إصلاح الأنسجة في التقليدية بارافورمالدهيد 4% المخفف في برنامج تلفزيوني، ولكن يظهر بشكل واضح عندما يتم إصلاح الأنسجة في المخزن المؤقت لحزب العمال التقدمي (كين موبيرغ، شخصية الاتصالات، ومرجع69). بالإضافة إلى التغييرات في المخزن المؤقت لتلطيخ المكونات، تغيير الوقت ودرجة الحرارة لتثبيت الأنسجة أيضا بدرجة كبيرة يمكن أن تؤثر على إيمونوفلوريسسينت ويمكن تحديده من الناحية العملية إذا لزم الأمر. عموما، وقت التثبيت ينبغي أن تكون طويلة بما يكفي للسماح ل crosslinking كافية من المكونات الخلوية والصيانة على المدى الطويل من مورفولوجيا الخلوية الشاملة بينما يجري محدودة ما يكفي لمنع crosslinking أكثر و "دفن" من البروتين [ابيتوبس]. ولذلك عند البداية تحسين ظروف المصبوغة لجسم الأولية مكتسبة حديثا، عادة ما تحد من وقت التثبيت لحوالي 20 دقيقة وغالباً ما سيتم إصلاح الأنسجة في درجات حرارة أكثر برودة.
ينبغي إدراج عناصر تحكم متعددة في أي تجربة الفلورة للتحقيق في خصوصية أضداد، الابتدائي والثانوي وكذلك تأثير الخلفية المتسلسلات والوراثية على النمط الظاهري الملاحظ. للتأكد عما إذا كان جسم الأولية المستخدمة على وجه التحديد تسلم بروتين الفائدة، ينبغي إدراجها كعناصر تحكم الأنسجة من الذباب التي تفتقر إلى هذا البروتين و/أو الأنسجة overexpressing البروتين. كما يمكن تضمين إضافة البروتين الزائد مستضد المنقي لتحديد ما إذا كان جسم الابتدائي يتعرف الأخرى [ابيتوبس] في الدماغ يطير. أخيرا، أي إشارة الفلورسنت الحالية عندما يتم حذف الأجسام المضادة الأساسي يمثل مستوى الربط غير محددة بالأجسام المضادة الثانوية المحددة.
ينبغي أيضا إدراج عدة عناصر هامة لتقييم مساهمة الخلفية الجينية أو وجود المتسلسلات لكثافة المصبوغة أو مورفولوجيا الخلايا العصبية. على سبيل المثال، تتضمن الذباب استخدمت في التجربة ماركم في الشكل 5 المتسلسلات متعددة (هسفلب، UAS-CD8-التجارة والنقل، FRT82B، وحوض &#62; GAL80، و OK107-GAL4)، ينبغي تحليل كل منها على حدة للآثار على هيئة فطر مورفولوجيا. في مورفولوجية هيئة الحد الأدنى للغاية، والفطر الذباب ينبغي تحليله الذي يحتوي على OK107-GAL4 و UAS-CD8-التجارة والنقل على حد سواء. كما قد يكون من الضروري لتقييم تأثير صدمة الحرارة وحزب العمل الفيجي recombinase إنتاج الفطر هيئة التنمية من خلال تحليل الذباب الذي يحتوي على هسفلب و FRT82B. على الرغم من أن يمكن أن توفر ماركم ثاقبة كبيرة عما إذا كان بروتين معين يتحكم في صورة مستقلة التوجيه محواري، العدد الضوابط اللازمة لجعل دقة هذا الاستنتاج يمكن أن يكون قيداً طفيفة لهذا الأسلوب. في تجارب أقل تعقيداً، ضوابط مماثلة تنطبق أيضا. على سبيل المثال، تأخذ تجربة حيث يتم استخدام نظام GAL4/UAS في تركيبة مع التحوير [رني] ضربة قاضية في التعبير عن البروتين من الاهتمام في جميع الخلايا العصبية. في هذه التجربة، سيكون حاضرا المتسلسلات اثنين على الأقل: سائق GAL4 الخلايا العصبية القومية، مثل elav-GAL4، والتحوير UAS-[رني] . ينبغي التحقيق في مورفولوجيا الخلايا العصبية جسم الفطر في الذباب الذي يحتوي على كل من هذه المتسلسلات وحدها بالإضافة إلى الشرط التجريبي حيث تأوي الذباب كلا المتسلسلات في الطيران نفسه.
وأخيراً، لتحديد ما إذا كان بروتين الفائدة هو المعرب عنها في فطر الجسم من الخلايا العصبية من الضروري عادة العقول وصمة عار المشارك مع الأجسام المضادة إلى Fas2. وبدلاً من ذلك، يمكن أيضا أعرب البروتينات الفلورية مثل التجارة والنقل، وطلب تقديم العروض، أو الغشاء ملزمة CD8-التجارة والنقل باستخدام نظام GAL4/UAS وتستخدم بالاقتران مع الأجسام المضادة للاعتراف بالبروتين للفائدة. منذ Fas2 لا يعترف إلا بمحاور عصبية فاسسيكولاتيد التي تشكل هيئة فطر α و β الفصوص، تم استخدام يحركها GAL4 بغشاء زمني CD8-بروتينات فلورية خضراء مفيدة بشكل خاص لوضع علامات على هيئة فطر الخلايا العصبية.
عيوب في التوجيه محواري غالباً ما لا 100 ٪ الاختراق والعقول حتى من نفس النمط الوراثي قد تظهر بعض التغيرات. ولذلك، عند تحليل حديثا ولدت الآليلات متحولة عن عيوب في جسم الفطر أو اﻻستطﻻعية مستقبله، ينبغي أن تستخدم مزيجاً من الآليلات المختلفة والنهج. تستخدم معظم الدراسات في الأدب عدة نهج مختلفة للتحقيق في ما إذا كان بروتين يلعب دوراً خلية مستقلة في السيطرة على التوجيه محواري: أنا) تحليل اﻻستطﻻعية وجود عيوب في متماثل الذباب فارغة (يفضل استخدام نو مختلفةالآليلات ليرة لبنانية)، الثاني) تحليل اﻻستطﻻعية وجود عيوب في الذباب نقص البروتين للفائدة فقط في الخلايا العصبية (عادة عن طريق [رني])، ثالثا) ماركم تحليل العيوب اﻻستطﻻعية، ورابعاً) إنقاذ التجارب حيث الجينات إعادة المعرب عنها في الخلايا العصبية من متماثل فارغة (null) الذباب. ومن الناحية المثالية، يجب أن يتم تحليل أدمغة عدة عشرات في النمط الوراثي لعيوب في مورفولوجيا الخلايا العصبية.
على الرغم من أن وصف البروتوكول هنا يركز أساسا على الترجمة إيمونوفلوريسسينت للبروتينات داخل الأنسجة الثابتة، يجري تطوير العديد من التطبيقات المستقبلية لهذه التقنية لانسجة المخ يعيش الصورة. حالما يتم تشريح أدمغة (عادة في خلية ثقافة وسائل الإعلام)، ثم تكون مثقف لعدة أيام عند 25 درجة مئوية. ويجري هذه السابقين فيفو تثقيف الأساليب من أجل التحقيق في مجموعة متنوعة واسعة من العمليات البيولوجية، مثل نشاط البروتين التي تشجع التجديد إكسون عقب إصابة70،71، داخل الخلايا مما يشير إلى ديناميات72، وتنمية الخلايا العصبية73.

على الرغم من أن النظام العصبي المورفولوجية أقل من البشر والقوارض، تعقيدها نموذجا قوية، ودود فهم أفضل لنظرائه الفقاريات. في كثير من الحالات، ترميز الجينوم من الفقاريات والذباب مشابهة جداً من البروتينات التي تملي الآليات لتطوير الجهاز العصبي. والواقع أن العديد من الجينات المطلوبة لتنمية الخلايا العصبية في الفقاريات أورثولوجس في الذباب، بما في ذلك تلك التي أشركت في الممرات مما يشير إلى أن الزخرفة التحكم والخلايا والتوجيه محواري1،2،3 ،،من45. على سبيل المثال، نيترين يجند المطلوبة لتوجيه محواري في الثدييات و melanogaster دال-6،،من78. بينما نيترين كانت معزولة أصلاً من أنسجة الدماغ الجنينية فرخ6، قد كشفت الدراسات اللاحقة أن نيترين دوراً حفظت أثناء تطوير النظام العصبي المركزي (CNS) الجنينية في المورفولوجية8. استخدمت دراسات أخرى الشاشات الوراثية الجنينية المورفولوجية الجهاز العصبي المركزي لتحديد يغاندس المصانة والمستقبلات المطلوبة اﻻستطﻻعية في المورفولوجية والفقريات9.
بينما يطير الجنينية الجهاز العصبي المركزي قد استخدمت على نطاق واسع في الماضي لتحديد يغاندس والمستقبلات والبروتينات الإشارات داخل الخلايا المطلوبة لتوجيه محواري،من89، الأعمال الأخيرة حقق في الطرق التي العديد من هذه البروتينات أيضا التحكم في القرارات اﻻستطﻻعية خلال المراحل الأخيرة من التنمية. على وجه التحديد، قدمت التحقيق هيئة فطر (ميغابايت) ومستقبله الشبكية العصبية التنمية (الشكل 1) نظرة ثاقبة الآليات اﻻستطﻻعية عنصر التحكم هذا وتشكيل المشبك وتشذيب إكسون وجوانب عديدة أخرى من الخلايا العصبية التنمية10،11،،من1213،14،15،،من1617. علم الخلايا العصبية الاتصال الشبكية يطير إلى مناطق الدماغ الكبار تسمى الصفيحة ولب، وهي حاسمة بالنسبة لترحيل المعلومات البصرية إلى المخ (استعرضها18،19)، بينما فطر الجسم من الخلايا العصبية مركزياً يقع في الدماغ يطير ومطلوبة من أجل التعلم والذاكرة20،21. علم الخلايا العصبية والخلايا العصبية الذاتية الهيئات الفطر، وتسمى الخلايا كينيون، الاستفادة من آليات تقحم حفظت إرشادات محواري ديفوسيبلي وتعتمد على الاتصال للبحث عن أهدافها بعد متشابك. بالإضافة إلى كونها مرئية في الذباب الكبار، مستقبله والخلايا العصبية ميغابايت يمكن أيضا مباشرة تصور في اليرقات والخوادر مع الأجسام المضادة أو مراسل الجينات22،23،،من2425. عزز القدرة على تصور هاتين المجموعتين من الخلايا العصبية في نقاط زمنية مختلفة التنموية بسهولة استخدامها كنماذج رائعة للعديد من جوانب التنمية العصبية.
وبالإضافة إلى تستخدم كنموذج لفهم آليات تطوير الجهاز العصبي الطبيعي، وقد أثبتت الدراسات الأخيرة أن الذباب ويمكن أيضا بمثابة نماذج دقيقة لمجموعة واسعة من الأمراض التي تصيب الإنسان، بما في ذلك متلازمة X الهش (FXS)26 ، الإعاقة الفكرية (ID)27،،من2829،،من3031، والبعض الآخر32. على سبيل المثال، دراسة وظيفة ZC3H14 الجزيئية وجينات مؤخرا مرتبطة بالإعاقة الفكرية البشرية، أنشأنا نموذج يطير لمعرف باستخدام اليل فارغة ذبابة أورثولوج ZC3H14، تسمى Nab230. الذباب تفتقر إلى Nab2 ضعف الذاكرة الشديد وتمتد ذيول poly(A)، لخص ما لوحظ في المرضى الإنسان أو المريض المستمدة خلية خطوط33،34. الأهم من ذلك، عرض الذباب تفتقر إلى Nab2 أيضا عيوب مورفولوجية الدماغ الشديدة في تلك الهيئات فطر الكبار34، مماثلة لما لوحظ في الذباب تفتقر إلى الجين متلازمة FXS، FMR135. وهكذا، يمكن الذباب بمثابة كائن حي نموذجا هاما لدراسة كل من نمو الدماغ الطبيعي والأمراض التي تخل بذلك.
وأخيراً، جعل إمكانية الحصول على أساليب إنتاجية عالية لرصد السلوك، جنبا إلى جنب مع مجموعة واسعة من الأدوات الجينية المتاحة، المورفولوجية كائن نموذج المفضل لتحديد مناطق الدماغ التي تتحكم في سلوكيات معقدة، مثل التعلم والذاكرة والنوم، والخطوبة، والعطش وغيرها36،37،،من3839. واحد أداة مفيدة بشكل خاص في مركز "مربع الأدوات الوراثة يطير في" هو نظام GAL4/UAS (الشكل 2). يستخدم هذا النظام40،41 التعبير الأنسجة محددة المنشط النسخي Gal4 لزيادة التعبير عن الجينات أو المتسلسلات في اتجاه مجرى النهر من المنبع تنشيط تسلسل (UAS). إدخال تعديلات على هذا النظام قد سمح الباحثون على سبيل المثال، التحكم بدقة في استثارة الخلايا العصبية المحددة42،43أو أوفيريكسبريس أو تدق لأسفل جينات محددة لمصلحة44، 45، وتحليل ديناميات الكالسيوم في الوقت الحقيقي في فيفو46، والتعبير عن الجينات مراسل لوضع علامة الأنساب العصبية41. تركيبة النظام GAL4/UAS مع جزئ الانقسامية يسمح أيضا لإنشاء "تحليل فسيفساء" مع12،نظام علامة خلية ريبريسيبلي (ماركم)47. ماركم قد استخدمت على نطاق واسع في تتبع الخلايا العصبية وحيدة لتحديد مكونات إرسال الإشارات الخلوية اللازمة لتوجيه محواري12،47. على الرغم من أن هذه وغيرها من تقنيات قدمت عددا من الأفكار القيمة بشأن الآليات الخلوية اللازمة لوظيفة الجهاز العصبي، ومعظم تتطلب أولاً تشريح الدماغ المورفولوجية ؛ إزالة حذراً من الدماغ مطلوب للاحتفاظ بأنماط الدماغ الصحيح مورفولوجيا والاتصال بين مناطق الدماغ. يستخدم البروتوكول التالي الفطر العصبية الجسم ومستقبلهمثال السكان الخلايا العصبية كما أنه يرشدك خلال التشريح والعقول المورفولوجية إيمونوفلوريسسينت تلوين للكبار.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Microdissection forceps/tweezers</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>505-NM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard dishes</td>
			<td>Living Systems Instrumentation</td>
			<td>DD-50-S-BLK</td>
			<td>Available from amazon.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fas2 Antibody</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>1D4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chaoptin Antibody</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>24B10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP Antibody</td>
			<td>Aves Lab</td>
			<td>GFP-1010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa488 goat anti-mouse secondary antibody</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A-11001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa488 goat anti-chicken secondary antibody</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A-11039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa647 goat anti-mouse secondary antibody</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A-21236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20% paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscope Services</td>
			<td>RT15713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VectaShield</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>H-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperFrost Plus Slides</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>99-910-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12-553-454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na Phosphate Buffer monobasic</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S3139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na phosphate Buffer dibasic</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S3264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X 100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>X100-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fingernail polish</td>
			<td>Electron Microscope Services (EMS)</td>
			<td>72180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stereomicroscope</td>
			<td>Leica S6D with KL300 LED light source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9-well dish (spot plate)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89090-482</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nutator/rocker</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>22-363-152 or 88-861-041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35mm dish</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>32-103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>50-366-794</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipe</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>06-666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potential Fixation Buffers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTN Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.1M NaPhosphate, pH 7.2, 0.1% Triton-X-100, Typically make up 0.5 L of 0.1M NaPhosphate buffer and aliquote 50ml at a time as needed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PLP buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>2% paraformaldehyde, 0.01M NaI04, 0.075M Lysine, 0.037M NaPO4, pH 7.2, Dissolve 0.36 g lysine in 10 ml H2O + 7.5 ml 0.1 M NaH2PO4 pH 7.2 + 2.5 ml 0.1 M Na2HPO4 on ice. Immediately before use, mix 15 ml of this buffered lysine solution with 50 mg NaIO4 (sodium periodate) + 2ml of the 20% high grade paraformaldehyde (EMS) + 3ml H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEM buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.1M PIPES pH 7.0, 2mM MgS04, 1mM EGTA, This buffer can be conveniently made as a 2x stock and diluted with 8% paraformaldehyde (PFA) to give a final concentration of 4% PFA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fly Stocks available from Bloomington</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>elav (c155)-GAL4</td>
			<td></td>
			<td>BL458</td>
			<td>Pan-neuronal GAL4 driver</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>w*;;;OK107-GAL4</td>
			<td></td>
			<td>BL 854</td>
			<td>GAL4 driver for all mushroom body neurons (OK107-GAL4 insertion is on the 4th chromosome)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>y(1), w(67c23); c739-GAL4</td>
			<td></td>
			<td>BL 7362</td>
			<td>GAL4 driver for alpha and beta lobes (on 2nd chromosome)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>y(1), w(67c23); c739-GAL4, UAS-CD8-GFP</td>
			<td></td>
			<td>BL 64305</td>
			<td>GAL4 driver for alpha and beta lobes, also contains UAS-CD8-GFP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>w*; 201Y-GAL4</td>
			<td></td>
			<td>BL 4440</td>
			<td>GAL4 driver for primarily the gamma lobes of mushroom body (on 2nd chromosome)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>y(1), w(67c23); 201Y-GAL4, UAS-CD8-GFP</td>
			<td></td>
			<td>BL 64296</td>
			<td>GAL4 driver for mushroom body gamma lobes, also contains UAS-CD8-GFP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>w*, elav (c155)-GAL4, hsFLP; FRTG13, Tub&#62;Gal80/CyO</td>
			<td></td>
			<td>BL 5145</td>
			<td>MARCM stock, contains FRT site and GAL80 on 2nd chromosome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>w*, elav (c155)-GAL4, hsFLP, UAS-CD8-GFP</td>
			<td></td>
			<td>BL5146</td>
			<td>MARCM stock, contains hsFLP, pan-neuronal GAL4, and CD8-GFP on X chromosome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>y(1), w*, hsFLP, UAS-CD8-GFP;;FRT82B, Tub&#62;GAL80/TM3, Sb(1);OK107-GAL4</td>
			<td></td>
			<td>BL 44408</td>
			<td>MARCM stock for flipping 3rd chromosome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>y(1), w*, hsFLP, UAS-CD8-GFP;FRT40A, Tub&#62;GAL80;OK107-GAL4</td>
			<td></td>
			<td>BL44406</td>
			<td>MARCM stock for flipping 2nd chromosome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>w*, hsFLP, tub&#62;GAL80, FRT19A; UAS-CD8-GFP/CyO;;OK107-GAL4</td>
			<td></td>
			<td>BL 44407</td>
			<td>MARCM stock for flipping X chromosome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>y(1), w*; UAS-CD8-GFP/CyO</td>
			<td></td>
			<td>BL 5137</td>
			<td>GFP labels cell surface (CD8 is a transmembrane protein)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>y(1), w*; FRTG13, UAS-CD8-GFP</td>
			<td></td>
			<td>BL 5139</td>
			<td>MARCM stock, contains FRT site and CD8-GFP on 2nd chromosome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>y(1), w*, hsFLP, UAS-CD8-GFP; Pin(1)/CyO</td>
			<td></td>
			<td>BL 28832</td>
			<td>MARCM stock, contains hsFLP and CD8-GFP on X chromosome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>w*; FRTG13, Tub&#62;GAL80</td>
			<td></td>
			<td>BL 5140</td>
			<td>MARCM stock, contains FRT site and GAL80 on 2nd chromosome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>y(1), w*;; FRT82B, Tub&#62;GAL80</td>
			<td></td>
			<td>BL 5135</td>
			<td>MARCM stock, contains FRT site and GAL80 on 3rd chromosome</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dissection and immunofluorescent staining of mushroom body and photoreceptor neurons in adult drosophila melanogaster brains

ويشمل تطوير الجهاز العصبي سلسلة متتابعة من الأحداث التي ينسقها العديد من مسارات الإشارات والشبكات التنظيمية. كثير من البروتينات المشاركة في هذه المسارات هي تقحم المصانة بين الثدييات وحقيقيات النوى الأخرى، مثل ذبابة الفاكهة melanogaster المورفولوجية، مما يوحي بوجود مبادئ تنظيم مماثلة أثناء تطوير هذه الكائنات الحية. الأهم من ذلك، المورفولوجية وقد استخدمت على نطاق واسع لتحديد الآليات الخلوية والجزيئية التي تنظم العمليات المطلوبة في الثدييات بما في ذلك الخلايا والتمايز، والتوجيه محواري، سينابتوجينيسيس. الذباب أيضا قد استخدمت بنجاح نموذج مجموعة متنوعة من الأمراض العصبية النمائية البشرية. هنا يمكننا وصف بروتوكول ميكروديسيكشن خطوة بخطوة والتثبيت، وتعريب إيمونوفلوريسسينت للبروتينات داخل المخ المورفولوجية الكبار. هذا البروتوكول يركز على اثنين من السكان مثال الخلايا العصبية والخلايا العصبية جسم الفطر و photoreceptors الشبكية، ويتضمن الخطوات الاختيارية لتتبع الخلايا العصبية الجسم فطر الفردية باستخدام "تحليل فسيفساء" مع تقنية علامة خلية ريبريسيبلي (ماركم). وترد بيانات المثال من العقول متحولة والبرية من نوع جنبا إلى جنب مع وصفاً موجزاً لمعايير التهديف لعيوب الإرشاد محواري. وبينما هذا البروتوكول يبرز اثنين أجسام الراسخة للتحقيق مورفولوجية فطر الجسم ويمكن أيضا أن تكون الخلايا العصبية مستقبله ومناطق الدماغ المورفولوجية الأخرى وإضفاء الطابع المحلي على البروتينات داخل مناطق الدماغ الأخرى التحقيق في استخدام هذا البروتوكول.

Watch this Scientific Journal Video about Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains at JoVE.com

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

يصف هذا البروتوكول بالتشريح وإيمونوستينينج من الكبار melanogaster المورفولوجية أنسجة الدماغ. على وجه التحديد، يبرز هذا البروتوكول استعمال المورفولوجية فطر الجسم وعلم الخلايا العصبية كمثال على مجموعات فرعية الخلايا العصبية التي يمكن استخدامها بدقة لكشف المبادئ العامة التي تقوم عليها العديد من جوانب التنمية العصبية.

تشريح وتلطيخ إيممونوفلوريسسينت للفطر الجسم وعلم الخلايا العصبية في أدمغة البالغين melanogaster المورفولوجية

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva

Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva

يعاير بالسكان خلية الدم لل<em&gt; ذبابة الفاكهة السوداء البطن</em&gt; اليرقة

In vertebrates, hematopoiesis is regulated by inductive microenvironments (niches). Likewise, in the invertebrate model organism&#160;Drosophila ...

Rearing the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions

Rearing the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions

تربية ذبابة الفاكهة<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; تحت ممحوضة ومعروف المعايشات شروط

The influence of microbes on myriad animal traits and behaviors has been increasingly recognized in recent years. The fruit fly Drosophila melanogaster is ...

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

تشريح وتلطيخ المبايض المورفولوجية الخوادر

Unlike adult Drosophila ovaries, pupal ovaries are relatively difficult to access and examine due to their small size, translucence, and encasing within a ...

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

ذوبان الجليد واستزراع كريوبريسيرفينج خطوط الخلايا المورفولوجية

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the ...

Methods to Test Endocrine Disruption in Drosophila melanogaster

Methods to Test Endocrine Disruption in Drosophila melanogaster

طرق لاختبار اضطراب الغدد الصماء في الميلانوجاستر Drosophila

In recent years there has been growing evidence that all organisms and the environment are exposed to hormone-like chemicals, known as endocrine disruptor ...

Assay for Blood-brain Barrier Integrity in Drosophila melanogaster

Assay for Blood-brain Barrier Integrity in Drosophila melanogaster

فحص لسلامة حاجز الدم في الدماغ في دروسوفيلا melanogaster

Proper nervous system development includes the formation of the blood-brain barrier, the diffusion barrier that tightly regulates access to the nervous ...

Dissection and Live-Imaging of the Late Embryonic Drosophila Gonad

Dissection and Live-Imaging of the Late Embryonic Drosophila Gonad

تشريح وتصوير حي للغدد التناسلية ذبابة الفاكهة الجنينية المتأخرة

The Drosophila melanogaster male embryonic gonad is an advantageous model to study various aspects of developmental biology including, but not limited to, ...

Imaging Live Brain Explants from Drosophila melanogaster Third Instar Larvae

Live-Cell Imaging of Drosophila melanogaster Third Instar Larval Brains

Investigating Asymmetric Cell Division Dynamics: A Protocol for Live-Imaging of Drosophila Larval Brain Explants (Video) | JoVE

تصوير الخلايا الحية لذبابة الفاكهة الميلانوجاستر أدمغة اليرقات الثالثة

Drosophila neural stem cells (neuroblasts, NBs hereafter) undergo asymmetric divisions, regenerating the self-renewing neuroblast, while also forming a ...

Detection and Quantification of Single mRNA Molecules in Drosophila

Studying Muscle Transcriptional Dynamics at Single-molecule Scales in Drosophila

Investigating mRNA Spatial Distribution in Drosophila Muscle Tissue (Video) | JoVE

دراسة ديناميكا نسخ العضلات على مقاييس أحادية الجزيء في ذبابة الفاكهة

Skeletal muscles are large syncytia made up of many bundled myofibers that produce forces and enable body motion. Drosophila is a classical model to study ...

﻿Staging and Collecting Drosophila melanogaster Third Instar Larvae

ï»¿Staging and Collecting Drosophila melanogaster Third Instar Larvae (Video) | JoVE 

التدريج وجمع ذبابة الفاكهة الميلانوجاستر يرقات Instar الثالثة