Name: dissection and immunofluorescent staining of mushroom body and photoreceptor neurons in adult drosophila melanogaster brains
Uploaded: 2017-11-06T16:45:00
Duration: 10 min 13 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains at JoVE.com

Vi vil gerne takke Changhui Pak og Olafs Vrailas Mortimer for i første omgang undervisning SMK hjernen dissektion teknik. Vi takker også medlemmerne af Ken Moberg lab gruppe, især Chris runder, for kritisk læsning af manuskript. Antistoffer anerkende Fas2 (1 d 4) og chaoptin (24B10) stammer fra den udviklingsmæssige undersøgelser hybridom Bank. Antistof 24B10 blev indsat på DSHB af Seymour Benzer og Nansi Colley24,60,61, antistof 1 d 4 blev indsat på DSHB af Corey Goodman 22,23,56. Flyve bestande blev indhentet fra Bloomington Stock Center. Vi ønsker også at takke Ohio landbrugsforskning og udvikling Center (OARDC) MCIC Imaging Center for brug af en Konfokal mikroskop billede hjerner i figur 4A og B. SMK understøttes af et tilskud fra NICHD (1 R15 HD084241-01A1).

1. drosophila melanogaster genetik og valgfri Heat Shock procedurer
<ol><li>Engang fluer har overskredet og F1 afkom er klækket, opnå hunner og/eller mænd med passende genotypen. Afhængigt af det område af hjernen undersøges, fluer bør indsamles dagligt og adskilt af sex, således at aldersbetinget og/eller seksuelt dimorfe mønstre af hjernen connectivity kan skelnes lettere. 
	Bemærk: Valgfri: Hvis fluer bliver brugt til mosaik analyse med en Repressible celle markør (MARCM) analyse 12 , 47, embryoner, larver eller pupper bør være varme chokeret ved 37 ° C i 30-45 min til fremkalde mitotiske rekombination. For at målrette specifikke regioner champignon organer for MARCM analyse, bør heat shock blive timet planmæssigt bestemmes af 12 og skitseret i figur 5 B. Hvis du bruger MARCM til at undersøge hjerneregioner end de champignon organer, skal pilot forsøg udføres for at bestemme den optimale fase at være varme-chokeret. Mens nedenstående trin er skrevet med hensyn til eclosed flyver, pharate voksne kan også blive dissekeret ved hjælp af disse trin, når den puppe sag er blevet fjernet.</li>
</ol> 2. Dissektion Station forberedelse <ol><li>holdning stereomikroskopet og lys kilde med knyttet fiber optic goosenecks på en stor benchtop. At fremme stabil håndbevægelser og reducere hånd &#34; ryste &#34; mens dissekere, det er vigtigt, at tilstrækkelig plads til resten af hånd og arm er tilgængelige omkring mikroskop. Sikre, at der er ca 8-10 inches på hver side af mikroskopet og 4-6 inches mellem bunden af mikroskop og kanten af bænken.</li>
	<li>Fyld 2 eller 3 wells af et glas 9-godt eller 3-godt parabol med 1,0 mL af PTN buffer (0,1 M natriumfosfat Buffer pH 7,2, 0,1% nonionisk overfladeaktivt stof, se materialer tabel for komplet buffer komponenter) og placere den dissekere ligger på is. Nyligt dissekeret hjerner vil blive overført til denne parabol og opbevares indtil trinnet fiksering.
	<ol><li>Note: Hvis live imaging er påkrævet, dissektion buffer bør være 1 x phosphat bufferet saltvand (PBS) eller HL3 buffer 48. Hvis intracellulære proteiner lokalisering er påkrævet, kan PBS også bruges som en alternativ buffer for dissektion og fiksering. Efter fiksation, permeabilization af cellemembraner bør derefter udføres ved hjælp af PTN vasker som indeholder 0,1% eller 0,3% nonionisk detergent.</li>
		<li>Hvis PBS bruges til dissektioner og fiksering, pipette tips bør skylles mindst én gang med et vaskemiddel, der indeholder buffer (f.eks PTN) at forhindre hjerner klistrer til plast pipette tips under overførslen til microcentrifuge rør.</li>
	</ol></li> <li>Ved hjælp af en tomme 35 mm glas eller plastik petriskål, konstruere en dissektion parabol indeholdende en silikoneelastomer. Kort, bland elastomer komponenter ifølge producentens &#39; s retninger, hæld i 35 mm retter, og lad det polymerisere natten på en flad overflade. Elastomer indeholdende dissektion retter skal bruges til at beskytte de fine tips af dissekere pincet, der kan nemt blive beskadiget, hvis kontaktpersonen er lavet mellem pincet og en hårdere overflade, såsom en glasskål. Vi køber også regelmæssigt kommercielt tilgængelige silikone belagt retter fra online-forhandlere. For at øge kontrasten under dissektioner, silikoneelastomer dissektion retter indeholdende inaktiveret trækul (og dermed farvet sort) er især nyttige.</li>
</ol> 3. Voksen hjerne dissektion Procedure <ol><li>Anesthetize 3-5 dages gamle voksen D. melanogaster med CO 2 eller ved hjælp af is. Hvis du bruger is, sted hætteglasset indeholdende flyver op og ned (stik enden ned) i en isspand for ~ 5 min. placere hætteglasset i ice hovedet forhindrer flyver fra at blive indgivet i maden. Når fluer har været bedøvede, placere fluer på en kold metal pad eller petriskål sidder i ice eller på et CO 2 udsender flyve pad. Hvis dissekere hjerner til at analysere neurodegeneration, ældre fluer kan også anvendes.</li>
	<li>Placerer en lille mængde (150-200 µL) af PTN i midten af dissektion fadet ved hjælp af en overførsel pipette eller p200 pipette til at oprette en &#34; bubble &#34; af PTN. Placer dissektion fadet under stereomikroskopet og justere belysning og fokusere så at boble af PTN fylder synsfeltet og er ensartet belyst.</li>
	<li>Manipulere fluer, så de er &#34; bugen op &#34; (dvs., ventrale side op) mens liggende på metal eller CO 2 pad.</li>
	<li>Ved hjælp af et par af #5 pincet, forstå i maven af en flue til at blive dissekeret, og helt at holde fat i flyve, dykke det i PTN på dissektion parabol. 
	Bemærk: For den resterende del af protokollen, alle trin skal udføres, mens hovedet er neddykket i PTN.</li>
	<li>Bruger et andet par af #5 pincet, tag fat i bunden af den flyve Snabel og træk de to par af pincet fra hinanden til at frigøre flyve hovedet fra kroppen. Kassér maven og brystkassen. Under dette trin er det kritisk at hovedet ikke er udgivet og lov til at flyde på overfladen af PTN. Når hovedet flydende, det kan være meget svært at forstå igen uden knusning hjernen. 
	Bemærk: Ved hjælp af denne metode, er forbindelser mellem hjernen og ventrale nerve ledningen afskåret. Hvis intakt forbindelser mellem disse regioner i CNS er påkrævet, bør en alternativ dissektion protokol, som 49 , 50, følges. Hvis Snabel frigøres fra den flyve hoved før hovedet er fjernet, bliver der et hul, hvor Snabel var. I dette tilfælde gribe flyve hovedet på kanten af hullet i nærheden af det ene øje. Derefter fjerne hovedet ved hjælp af en moderat mængde af kraft, mens du trækker de to par af pincet bortset fra hinanden. Lejlighedsvis, når hovedet er fjernet fra kroppen, gut og/eller ventrale nerve ledningen forbliver knyttet til hovedet og skal fjernes, før du fortsætter dissektion.</li>
	<li>, Mens et par pincet griber Snabel, det andet par bør forstå den mediale kant af lige flyve øjet. Langsomt, træk pincet bortset fra hinanden. Dette trin skal udføres med en lille mængde af stabil lateral kraft. Som pincet langsomt bevæge sig ud over hinanden, skal Snabel trække væk fra hovedet og oprette et centralt hul i hovedet neglebånd. Kassér Snabel med det første par pincet uden at slippe den mediale del af det højre øje fra det andet par. 
	Bemærk: Voksen D. melanogaster hjerne er i den caudale (dvs., bageste/bag) region af flyve hovedet. Således bør gribe denne region af hovedet undgås. Ideelt, kun den rostralt (dvs., front) del af hovedet nær mediale nethinden bør udnyttes direkte af pincet. Hjernen og tilknyttede luftrøret bør nu være synlig gennem den centrale hul i hårstrået. På dette tidspunkt, enhver hvid trævlet tråde af luftrøret stikker frem fra hullet kan fjernes og kasseres.</li>
	<li>Med det andet par pincet, forstå den mediale kant af venstre nethinden (på kanten af den centrale hul i hovedet neglebånd). Hvis du vil fjerne nethinder og tilknyttede neglebånd, langsomt trække pincet fra hinanden på en vinkel på 180 °. Som nethinden tager fra den underliggende optik lap, bør du føle et lille fald i spændingen. Gå langsomt til at forhindre, at rive den optiske lap. 
	Bemærk: Adskille pincet for hurtigt under dette trin kan resultere i rivning af the optik lap eller afbrydelse af champignon organ strukturer. Lejlighedsvis, neglebånd fjernes men stykker af nethinden forbliver knyttet til den optiske lap. Hvis imaging champignon organer, er det ikke helt nødvendigt for at fjerne hele nethinden. Analyse af andre områder af hjernen (såsom retinal neuron innervation af fiberoptiske hjerne lapper) kan dog kræve nethinden til at blive helt fjernet som beskrevet af 48 , 51. 
	Bemærk: Som nethinden er langsomt adskilt fra den underliggende optik lap af hjernen, optik lap bør kan iagttages som en uigennemsigtig hvid struktur dækket med hvide, trævlet luftrøret. Når en nethinden er blevet fjernet, kan det kasseres. Når du analyserer pathfinding retinal neuroner, bør særlig omhu tages under dette trin at undgå at skade den optiske lap. En tillægsprotokol fokuseret på dissektion og live imaging fotoreceptor neuroner er også tilgængelige 48.</li>
	<li>Nu, forsigtigt fjerne så meget af den synlige luftrør som muligt. Luftrør kan allerede indeholde eller senere fyldes med luft, forårsager hjernen til at flyde og potentielt, mistes under senere immunfarvning trin. Hvis du vil fjerne luftrøret, vælge det off hjernen ved hjælp af en meget skarp #5 pincet.</li>
	<li>Fjerne de resterende nethinden og omkringliggende neglebånd ved hjælp af begge par af pincet til at forstå den mediale region i den venstre flyve nethinden. Forsigtigt rive nethinden i halvdelen til at fjerne stykker af nethinden og neglebånd. I nogle tilfælde, at fjerne de resterende neglebånd uden knusning hjernen viser sig specielt udfordrende. I disse tilfælde, har vi fundet, at de resterende dele af den ventrale nerve ledningen i stedet blive forstået af et par pincet, mens de andre par pincet bruges til fjern forsigtigt sidst af neglebånd.</li>
	<li>Ved hjælp af en p200 pipette, flytte dissekeret hjerner til et godt af 9 - eller 3-godt parabol indeholdende PTN. Hjerner af den samme genotype bør samles sammen i den samme godt og opbevares på is. Hjernevæv bør fastsættes inden for en time af dissektion. Hjerner kan fast i små partier og samles om et større antal hjerner er påkrævet. I de fleste tilfælde, en erfaren forsker kan normalt dissekere en hjerne og overføre det til samling glasskål i ca 3-5 min.</li>
</ol> 4. Fiksering og immunfluorescent farvning Procedure <ol><li>bruger p200 pipette, overføre dissekeret hjerner fra 9-godt parabol til en 0,5 mL microcentrifuge rør fyldt med 0,5 mL 4% PARAFORMALDEHYD opløses i PTN. Mindst 10-15 hjerner af den samme genotype kan kombineres ind i et microcentrifuge rør. Alle resterende trin (indtil montering af hjerner på dias) udført i 0,5 ml microcentrifuge rør. 
	Forsigtig: PARAFORMALDEHYD (PFA) skal håndteres i et stinkskab. PFA affald skal gemmes og bortskaffes korrekt. 20% PARAFORMALDEHYD købt i glas ampuller kan være aliquoted i microcentrifuge rør og opbevares ved-20 ° C indtil behov.</li>
	<li>Inde i et stinkskab, inkuberes hjerner i 4% PARAFORMALDEHYD i 20 min. med langsom hastighed vuggende stuetemperatur.</li>
	<li>Efter fiksation, tillade hjerner til at bilægge til bunden af microcentrifuge rør ved hjælp af tyngdekraften. 
	Bemærk: Lejlighedsvis, hjerner kan holde til siden af microcentrifuge rør. Hvis dette sker, det er normalt nyttigt sideværts rotere rør mellem pegefinger og tommelfinger eller meget forsigtigt tryk røret på bænken til fremme af forliset af hjerner.</li>
	<li>Fjern fiksativ ved hjælp af en p1000 afpipetteres og udfører to &#34; hurtig &#34; vasker med 500 µL af PTN, tillader hjerner til at bilægge til bunden af microcentrifuge rør mellem vasker. Under disse hurtig vasker, når alle hjerner har afgjort ved hjælp af tyngdekraften til bunden af microcentrifuge rør, kan PTN omgående veksles til frisk buffer; der kræves ingen ekstra vask tid. 
	Bemærk: Typisk, forlader ekstra buffer i røret er at foretrække frem for at risikere hjernen fjernelse. Omhyggelig undersøgelse af pipette tip er ofte nødvendigt at sikre, at ingen hjerner er blevet fejlagtigt fjernet fra røret. Hvis hjerner har været tilfældigt pipetted i spidsen, undvære dem tilbage i microcentrifuge rør, vente på hjerner til at bosætte sig og derefter fortsætte med at fjerne eventuelle ekstra PTN, der forbliver.</li>
	<li>Efter den sidste hurtige vask, bruge p1000 pipette til at udføre tre &#34; lange &#34; vasker: tilføje 500 µL af PTN og vask i 20 min. ved stuetemperatur på en rocker/nutator. Alle fremtidige &#34; lange &#34; vasker bør være op til 20 mins. 
	Bemærk: Efter disse vasker, fast hjerner kan opbevares natten over ved 4 ° C i PTN.</li>
	<li>Fjerne den sidste vask ved hjælp af en p1000 pipette og inkuberes hjerner på en rocker eller nutator ved stuetemperatur i 0,5 mL blokerende løsning [PTN + 5% normal ged serum (NGS)] i mindst 30 min ved stuetemperatur.
	<ol><li>Ged sekundære antistoffer vil blive anvendt i efterfølgende protokol trin. Hvis sekundære antistoffer fra en anden art vil blive brugt, normal serum fra at arter (i stedet for NGS) bør anvendes i løsningerne, der blokerer og antistof.</li>
	</ol></li> <li>Bruger p1000 pipette, fjerne blokering løsning og tilføje de primære antistof fortyndet i PTN (PTN + 5% NGS + fortyndet primære antistof). Når du bruger en primær antistof for første gang, den optimale fortynding af at antistof bør fastlægges empirisk. 
	Bemærk: Til at visualisere champignon krop neuroner, antistoffer anerkende Fas2 er typisk bruges. Disse antistoffer er tilgængelige fra udviklingsmæssige undersøgelser hybridom Bank (DSHB) som antistof 1 d 4 og bør være fortyndet 1:20 i PTN + 5% NGS. 
	Bemærk: Til at visualisere fotoreceptor neuroner, antistoffer anerkende chaoptin er typisk bruges. Chaoptin antistoffer er tilgængelige fra DSHB som antistof 24B10 og bør være fortyndet 1:20 i PTN + 5% NGS. 
	Bemærk: Fiksering processen typisk eliminerer fluorescens fra fluorescerende proteiner såsom grøn fluorescerende proteiner (NGL). Derfor, når du bruger MARCM til at analysere cytoskeletale vejledning af individuelle MB neuroner, bruge et antistof anerkende NGL.</li>
	<li>Inkuberes hjerner i primære antistof løsning på en rocker/nutator i 2-3 nætter på 4 ° C.</li>
	<li>Efter inkubation med primære antistoffer, tillade hjerner til at bilægge til bunden af microcentrifuge rør og derefter fjerne den primære antistof løsning.</li>
	<li>Ved hjælp af en p1000 pipette, udføre 2 &#34; hurtig &#34; vasker og 3 &#34; lange &#34; 20 min vasker med 0,5 mL af PTN som beskrevet ovenfor i trin 4.4 og 4.5, omhyggeligt at tillade hjerne for at udligne ved hjælp af tyngdekraften til bunden af microcentrifuge rør mellem hver Wash</li>
	<li>Incubate hjerner i 3 timer ved stuetemperatur med passende fluorescently mærket sekundære antistoffer. Sekundære antistoffer er normalt fortyndet i 0,5 mL af PTN + 5% NGS på en koncentration af 1:200. 
	Bemærk: Når fluorescerende sekundære antistoffer er blevet tilføjet, hjerner bør holdes i mørke i resten af eksperimentet. 
	Bemærk: I tilfælde resterende normal god landbrugspraksis fluorescens resterne, når du udfører MARCM analyse er det tilrådeligt at bruge en sekundær antistof mærket med en fluorophore at have lignende excitation/emission bølgelængder som normal god landbrugspraksis (f.eks. Fluoroscein isothyocyanate (FITC) eller Alexa488).</li>
	<li>Efter sekundær antistof inkubation, tillade hjerner til at bilægge til bunden af microcentrifuge rør og fjerne sekundær antistof løsning.</li>
	<li>Udføre 2 &#34; hurtig &#34; vasker og 3 &#34; lange &#34; 20 min vasker med 0,5 mL af PTN som beskrevet ovenfor i trin 4.4 og 4.5, omhyggeligt at tillade hjerne for at bilægge til bunden af microcentrifuge rør mellem hver Wash</li>
	<li>Efter tredje &#34; lange &#34; 20 min vask, brug p200 pipette til at fjerne så meget buffer som muligt.</li>
	<li>Tilføje 75 µL af fluorescerende anti-fade montering medium til hjernen. Pipette hjerner og montering medium ind i pipette spidsen en gang at blande. Ikke invertere røret da hjerner kan blive hængende på den fælles landbrugspolitik eller sider af microcentrifuge rør. 
	Bemærk: Efter suspensionen af hjerner i montering medium, rør kan være pakket ind i aluminiumsfolie for langsom fluorophore dæmper og opbevares ved 4 ° C natten over. Hvis nødvendigt, hjerner kan opbevares i flere dage ved 4 ° C, men bør ideelt set være monteret på dias snarest.</li>
</ol> 5. Montering voksen D. melanogaster hjerner på mikroskop Slides og Imaging <ol><li>bygge en &#34; bro &#34; dias. Placer to &#34; base &#34; coverslips ca 1 cm fra hinanden på en positivt ladede dias. Sikre, at de positivt ladede side af diaset vender opad. Overholde coverslips til dias med Fingernegl polish, som vist i fig. 3 A. Det er normalt nyttigt at forsegle de tre ydre kanter af hvert base dække slip med Fingernegl polish at sikre montering medier ikke væge under disse base dæksel glider. Lad Fingernegl polish tørre helt (10-15 min), før du fortsætter.</li>
	<li>Placer slide under stereomikroskopet og afpipetteres montering media løsning indeholdende dissekeret hjerner i rummet mellem de to coverslips. For at give mere kontrast, er det nyttigt at manøvrere svanehals lys, således at de er parallelle med bænk toppen.</li>
	<li>Fjern ekstra montering medier fra dias ved hjælp af en pipette, være omhyggelig med ikke at afpipetteres hjerner væk fra diaset.</li>
	<li>Vægen væk ekstra montering medier. Dette vil tillade hjerner skal placeres mere præcist i løbet af de næste skridt.</li>
	<li>Brug et par pincet og stereomikroskopet, placere hjerner på dias i et gittermønster med antennal fliger vender op</li>
	<li>Placer et cover slip (den &#34; bro &#34;) over hjerner ( fig. 3 A). Bruge Fingernegl polish for at forsegle siderne af broen dække slip hvor de kontakte den &#34; base &#34; dække underkjoler.</li>
	<li>Ved hjælp af en p200 pipette, langsomt fylde center hulrum under broen med friske montering medier ( fig. 3 B). Anbring en dråbe ad gangen på den åbne kant af center coverslip og tillade montering medierne til at væge under center bro coverslip. Fortsætte, indtil hele hulrummet er fyldt med montering medier, og derefter forsegle top og bund med klare Fingernegl polish.</li>
	<li>Når Fingernegl polish er tørt, billede dias umiddelbart eller gemme i en lystæt stram slide boks på -20 ° C.</li>
	<li>Inden for en uge, billede hjerner ved hjælp af en laser-scanning Konfokal mikroskop med excitation lasere og filtrere kuber passende til de valgte fluorescerende sekundære antistoffer. Z-stak billeder af champignon krop neuroner er typisk fremstillet ved hjælp af 20 X eller 40 X mål. Billeddannelse af retinale fotoreceptor neuroner kan kræve højere forstørrelse.</li>
</ol>

Forfatterne erklærer, at de har ingen konkurrerende finansielle interesser.

Den ovenfor beskrevne dissektion og visualisering metode kan anvendes i en bred vifte af immunfarvning og live billedbehandlingsprogrammer. Vi har skitseret en generel immunfarvning protokol og har understreget én måde, hvorpå MARCM kan bruges til at visualisere cytoskeletale morfologi af individuelle champignon krop neuroner. Derudover disse generelle procedurer kan også bruges til imaging andre områder af hjernen i fast eller frisk dissekeret voksen hjerne48,65. Live imaging kan yde en mere effektiv tilgang når analysere udtryk mønstre forstærker fælder, reporter gener eller efterligne linjer66, f.eks. At forhindre fanger artefakter fra celledød under live imaging af normal god landbrugspraksis i ikke optagne væv, hjerne bør være dissekeret i 1 x phosphat bufferet saltvand (PBS) eller HL3 media48, monteret på broen dias i 1 x PBS (eller HL3) og afbildet i mindre end 15-20 min. pleje bør også tages til at fjerne så meget luft som muligt fra dissekeret hjernen før billedbehandling, da det kan forstyrre visualisering af normal god landbrugspraksis fluorescens.
Mens farvning betingelserne for at vurdere morfologi af champignon krop og fotoreceptor neuroner er forholdsvis veletableret24,61,67, lokalisering af et specifikt protein af interesse i disse celle typer kan kræve omfattende fejlfinding og optimering. Navnlig skal flere kritiske trin, herunder antistof fortynding, blokerende buffer komponent koncentration og fiksering, optimeres for at generere de mest reproducerbare og pålidelige resultater. Først, den optimale koncentration af primære antistof bør fastlægges. Selv om kommercielt tilgængelige antistoffer ofte har en foreslået fortynding (og vi ofte først starte ved hjælp af denne koncentration), er disse værdier sjældent bestemt empirisk på Drosophila væv. Derfor tester en serie af primære antistof fortyndinger, der spænder over og under fabrikantens start forslag ofte resulterer i mere specifik farvning. Mens primære antistof fortynding kan have en betydelig indvirkning på farvning nøjagtighed og præcist fastsættes, tid hjerner er udruget i primære antistof der indeholder kan løsninger variere betydeligt med lille effekt på det samlede resultat. For eksempel, har vi observeret lignende resultater når inkubere dissekeret hjerner med Fas2 antistof primære antistof for to, tre eller endda fire dage ved 4 ° C. Selv om vi anbefaler mindst to nætter, har vi også inkuberes hjerner i primære antistof løsning for en enkelt nat og opnået reproducerbare farvning. Vigtigere, hjælper begrænser mængden tid hjerner er udruget i den sekundære antistof til 3 timer ved stuetemperatur (eller en nat ved 4 ° C) grænse ikke-specifik binding af sekundære antistoffer til hjernevæv.
Andet, kan det være nødvendigt at bruge yderligere "blokering" reagenser til at fjerne uønsket baggrund signal. Indstillinger omfatter øget koncentration af NGS ~ 10%, tilføje 1-10% bovint serumalbumin (BSA) til blokering og primær/sekundær antistof løsninger, eller før adsorption af primære antistoffer natten over ved 4 ° C med Drosophila embryoner (Se reference68, afsnit 2.9, trin 3).
Mens vi har skrevet ovenstående protokollen bruger PTN som den foreslåede buffer for alle fiksering, kan vask, og antistof inkubation trin, væv fiksering i andre buffere (såsom PLP og PEM, der er opført i Materialer tabel) resultere i dybe forskelle i signalstyrke. For eksempel, har tidligere undersøgelser vist at Cyclin E er ikke målbart i larve fantasiens diske når væv er fast i traditionelle 4% PARAFORMALDEHYD fortyndes i PBS, men er klart synlig, når væv er faste i PLP buffer (Ken Moberg, personlige kommunikation og reference69). Ud over ændringer i buffer komponenter, ændre tid og temperatur til vævet fiksering kan også væsentligt påvirke immunfluorescent farvning og empirisk kan bestemmes, hvis det er nødvendigt. Generelt, fiksering tid skal være lang nok til at give mulighed for tilstrækkelig crosslinking af cellulære komponenter og langsigtede vedligeholdelse af samlede cellulære morfologi samtidig være begrænset nok til at forhindre over-crosslinking og "begrave" af protein epitoper. Derfor, når i første omgang optimere farvning betingelser for en nyerhvervede primære antistof, vi normalt begrænse fiksering tid til ca 20 min og vil ofte løse væv på koldere temperaturer.
Flere kontrolelementer bør indgå i enhver immunofluorescens eksperiment for at undersøge specificiteten af primære og sekundære antistoffer samt effekten af transgener/genetiske baggrund på de observerede fænotype. For at fastslå, om den primære antistof anvendes specifikt genkender protein af interesse, skal væv fra fluer mangler dette protein og/eller væv overekspression af protein medtages som kontrol. Tilsætning af overskydende renset antigen protein kan også indgå for at afgøre, om den primære antistof genkender andre epitoper i flyve hjernen. Endelig repræsenterer nogen fluorescerende signal når primære antistoffer er udeladt niveauet af ikke-specifik binding af de udvalgte sekundære antistoffer.
Flere vigtige kontrol bør inddrages for at vurdere bidrag af genetiske baggrund eller tilstedeværelsen af transgener til farvning intensitet eller neuronal morfologi. For eksempel fluerne bruges i MARCM forsøget i figur 5 indeholder flere transgener (hsFLP, UAS-CD8-normal god landbrugspraksis, FRT82B, badekar &#62; GAL80, og OK107-GAL4), hvoraf hver bør analyseres separat for effekter på champignon krop morfologi. På et absolut minimum, champignon krop morfologi af fluer bør som indeholder både OK107-GAL4 og UAS-CD8-normal god landbrugspraksis være analyseret. Det kan også være nødvendigt at vurdere effekten af heat shock og Flp recombinase produktion på champignon organ udvikling ved at analysere fluer som indeholder både hsFLP og FRT82B. Selv om MARCM kan give betydelig indsigt i hvorvidt en given protein selvstændigt styrer cytoskeletale vejledning, kan antallet af Kontroller præcist foretage denne konklusion være en mindre begrænsning af denne teknik. Der gælder også ens kontrolelementer i mindre kompliceret eksperimenter. For eksempel, tage et eksperiment, hvor GAL4/UAS system bruges i kombination med et RNAi transgen til knockdown udtryk for et protein af interesse for alle neuroner. I dette eksperiment, mindst to transgener vil være til stede: en pan-neuronal GAL4 driver, såsom elav-GAL4, og UAS-RNAi transgenet. Morfologi af champignon krop neuroner i fluer der indeholder hver af disse transgener alene bør undersøges ud over den eksperimentelle tilstand hvor fluer harbor begge transgener i den samme flyve.
Endelig for at afgøre, om protein af interesse er udtrykt i champignon krop neuroner er det normalt nødvendigt at co pletten hjerner med antistoffer til Fas2. Fluorescerende proteiner som normal god landbrugspraksis, RFP eller membranen bundet CD8-normal god landbrugspraksis kan alternativt også udtrykkes ved hjælp af GAL4/UAS system og bruges i kombination med antistoffer anerkende protein af interesse. Da Fas2 kun anerkender fasciculated axoner, der danner champignon krop α og β lapper, har brug af GAL4-drevet, membran-bundet CD8-NGL været særlig nyttig for mærkning champignon krop neuroner.
Defekter i cytoskeletale vejledning er ofte ikke 100% penetrant og endda hjerner af den samme genotype kan vise nogle variation. Derfor, når analysere nyligt genererede mutante alleler for defekter i champignon krop eller fotoreceptor pathfinding, en kombination af forskellige alleler og tilgange bør udnyttes. De fleste undersøgelser i litteraturen bruge flere forskellige tilgange til at undersøge, om et protein spiller en celle-selvstændig rolle i at kontrollere cytoskeletale vejledning: Jeg) analyse af pathfinding defekter i homozygot null fluer (helst med forskellige null alleler), ii) analyse af pathfinding defekter i fluer mangler protein af interesse kun i neuroner (normalt via RNAi), iii) MARCM analyse af pathfinding defekter, og iv) redde eksperimenter hvor genet er re udtrykt i neuroner i homozygot null fluer. Ideelt set, flere dusin hjerner pr. genotype bør analyseres for defekter i neuronal morfologi.
Selv om protokollen beskrevet her primært fokuserer på immunfluorescent lokalisering af proteiner i faste væv, udvikles flere fremtidige anvendelser af denne teknik til billede live hjernevæv. Når hjerner er dissekeret (normalt i celle kultur medier), kan de så være kulturperler i flere dage ved 25 ° C. Disse ex vivo dyrkningsbaserede metoder er ved at blive udviklet for at undersøge en bred vifte af biologiske processer, såsom protein aktivitet, der fremmer axon regeneration efter skade70,71, intracellulære Signaling dynamics72, og neuronal udvikling73.

Selvom Drosophila nervesystemet er mindre end mennesker og gnavere, giver dens kompleksitet en kraftfuld, imødekommende model for bedre at forstå dens hvirveldyr modparter. I mange tilfælde indkode genomer af hvirveldyr og fluer meget lignende proteiner, der dikterer mekanismerne af nervesystemet udvikling. I virkeligheden, kræves mange af generne, der for neuronal udvikling i hvirveldyr har orthologs i fluer, herunder dem, der er involveret i signaling veje at kontrol mønstre, neurogenese og cytoskeletale vejledning1,2,3 ,4,5. For eksempel, er netrin en ligand kræves cytoskeletale vejledning i pattedyr og D. melanogaster6,7,8. Mens netrin blev oprindeligt isoleret fra embryonale chick hjernen væv6, har efterfølgende undersøgelser vist, at netrin spiller en bevaret rolle under udviklingen af embryonale centralnervesystemet (CNS) i Drosophila8. Andre undersøgelser har brugt genetiske skærme i den embryonale Drosophila CNS til at identificere bevarede ligander og receptorer kræves for pathfinding i både Drosophila og hvirveldyr9.
Mens den embryonale flyve CNS har været udbredt i fortiden for at identificere ligander, receptorer og intracellulær signalering proteiner kræves for cytoskeletale vejledning8,9, har seneste arbejde undersøgt måder, som mange af disse proteiner også styre pathfinding beslutninger under senere stadier af udvikling. Specielt, har undersøgelsen af champignon krop (MB) og retinal fotoreceptor neuron udvikling (figur 1) givet indblik i mekanismerne at kontrol pathfinding, synapse dannelse, axon beskæring og flere andre aspekter af neuronal udvikling10,11,12,13,14,15,16,17. Fotoreceptor neuroner tilsluttes regioner i den voksne hjerne kaldet lamina flyve nethinden og medulla og er kritisk for genudlægning visuel information til hjernen (anmeldt af18,19), mens champignon krop neuroner er centralt beliggende i flyve hjernen og er nødvendig for indlæring og hukommelse20,21. Både fotoreceptor neuroner og de iboende neuroner champignon organer, kaldet Kenyon celler, udnytte evolutionært bevarede diffusible og kontakt-afhængige cytoskeletale vejledning mekanismer for at finde deres post synaptic mål. Ud over at være synlig i voksne fluer, kan fotoreceptor og MB neuroner også direkte visualiseres i larver og pupper med antistoffer eller reporter gener22,23,24,25. Mulighed for at nemt visualisere disse to sæt af neuroner på forskellige udviklingsmæssige tiden point har fremmet deres brug som fantastiske modeller for mange aspekter af neuronal udvikling.
Ud over bliver brugt som en model til at forstå mekanismerne af normale nervesystem udvikling, har de seneste undersøgelser vist, at fluer kan også fungere som nøjagtige modeller af en bred vifte af sygdomme hos mennesker, herunder skrøbelige X syndrom (FXS)26 , Intellektuelle handicap (ID)27,28,29,30,31, og andre32. For eksempel, for at studere den molekylære funktion af ZC3H14, et gen for nylig forbundet med menneskets intellektuelle handicap, vi skabt en flyve model af ID'ET ved hjælp af en null allel af flue ZC3H14 ortholog, kaldet Nab230. Fluer mangler Nab2 har alvorlige hukommelse funktionshæmninger og udvidet poly(A) haler, recapitulating hvad er observeret i menneskelige patienter eller patienten afledt celle linjer33,34. Vigtigere, vise fluer mangler Nab2 også alvorlige hjerne morfologi defekter i deres voksne champignon organer34, svarende til hvad er observeret i fluer mangler FXS syndrom gen, FMR135. Således kan fluer tjene som en vigtig model organisme at studere både normal hjernens udvikling og sygdomme, der forstyrrer det.
Endelig, tilgængelighed af høj overførselshastighed metoder til at overvåge adfærd, kombineret med det enorme opbud af tilgængelige genetiske værktøjer, gøre Drosophila en model organisme valg for at identificere de områder af hjernen, der styre komplekse opførsel, som indlæring og hukommelse, søvn, frieri, tørst og andre36,37,38,39. En særlig nyttigt værktøj, der er på midten af en flyve genetiker "værktøjskasse" er GAL4/UAS system (figur 2). Dette system40,41 bruger væv specifikt udtryk for Gal4 transcriptional aktivator for at øge udtryk af gener eller transgener nedstrøms af en Upstream aktivering sekvens (UAS). Ændringer af dette system har tilladt forskere at, for eksempel, netop kontrol ophidselse af specifikke neuroner42,43, overexpress eller knock-down specifikke gener af interesse44, 45, analysere real-time calcium dynamics i vivo46, og express reporter gener til at markere neuronal lineages41. Kombinationen af GAL4/UAS system med mitotiske rekombination også tilladt for oprettelsen af mosaik analyse med en Repressible celle markør (MARCM) system12,47. MARCM har været udbredt i enkelt neuron sporing til at identificere de cellulær signalering komponenter, der kræves for cytoskeletale vejledning12,47. Selv om disse og andre teknikker har givet en række værdifulde indsigter om de cellulære mekanismer, der kræves for nervesystemet funktion, kræver de fleste at Drosophila -hjernen først blive dissekeret; omhyggelig fjernelse af hjernen er forpligtet til at opretholde korrekte hjernens morfologi og forbindelsen mønstre mellem hjerneregioner. Følgende protokol bruger champignon krop og fotoreceptor neuroner someksempel neuronal befolkninger som det guider dig gennem dissektion og immunfluorescent farvning af voksen Drosophila brains.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Microdissection forceps/tweezers</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>505-NM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard dishes</td>
			<td>Living Systems Instrumentation</td>
			<td>DD-50-S-BLK</td>
			<td>Available from amazon.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fas2 Antibody</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>1D4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chaoptin Antibody</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>24B10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP Antibody</td>
			<td>Aves Lab</td>
			<td>GFP-1010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa488 goat anti-mouse secondary antibody</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A-11001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa488 goat anti-chicken secondary antibody</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A-11039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa647 goat anti-mouse secondary antibody</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A-21236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20% paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscope Services</td>
			<td>RT15713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VectaShield</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>H-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperFrost Plus Slides</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>99-910-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12-553-454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na Phosphate Buffer monobasic</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S3139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na phosphate Buffer dibasic</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S3264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X 100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>X100-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fingernail polish</td>
			<td>Electron Microscope Services (EMS)</td>
			<td>72180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stereomicroscope</td>
			<td>Leica S6D with KL300 LED light source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9-well dish (spot plate)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89090-482</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nutator/rocker</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>22-363-152 or 88-861-041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35mm dish</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>32-103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>50-366-794</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipe</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>06-666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potential Fixation Buffers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTN Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.1M NaPhosphate, pH 7.2, 0.1% Triton-X-100, Typically make up 0.5 L of 0.1M NaPhosphate buffer and aliquote 50ml at a time as needed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PLP buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>2% paraformaldehyde, 0.01M NaI04, 0.075M Lysine, 0.037M NaPO4, pH 7.2, Dissolve 0.36 g lysine in 10 ml H2O + 7.5 ml 0.1 M NaH2PO4 pH 7.2 + 2.5 ml 0.1 M Na2HPO4 on ice. Immediately before use, mix 15 ml of this buffered lysine solution with 50 mg NaIO4 (sodium periodate) + 2ml of the 20% high grade paraformaldehyde (EMS) + 3ml H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEM buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.1M PIPES pH 7.0, 2mM MgS04, 1mM EGTA, This buffer can be conveniently made as a 2x stock and diluted with 8% paraformaldehyde (PFA) to give a final concentration of 4% PFA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fly Stocks available from Bloomington</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>elav (c155)-GAL4</td>
			<td></td>
			<td>BL458</td>
			<td>Pan-neuronal GAL4 driver</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>w*;;;OK107-GAL4</td>
			<td></td>
			<td>BL 854</td>
			<td>GAL4 driver for all mushroom body neurons (OK107-GAL4 insertion is on the 4th chromosome)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>y(1), w(67c23); c739-GAL4</td>
			<td></td>
			<td>BL 7362</td>
			<td>GAL4 driver for alpha and beta lobes (on 2nd chromosome)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>y(1), w(67c23); c739-GAL4, UAS-CD8-GFP</td>
			<td></td>
			<td>BL 64305</td>
			<td>GAL4 driver for alpha and beta lobes, also contains UAS-CD8-GFP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>w*; 201Y-GAL4</td>
			<td></td>
			<td>BL 4440</td>
			<td>GAL4 driver for primarily the gamma lobes of mushroom body (on 2nd chromosome)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>y(1), w(67c23); 201Y-GAL4, UAS-CD8-GFP</td>
			<td></td>
			<td>BL 64296</td>
			<td>GAL4 driver for mushroom body gamma lobes, also contains UAS-CD8-GFP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>w*, elav (c155)-GAL4, hsFLP; FRTG13, Tub&#62;Gal80/CyO</td>
			<td></td>
			<td>BL 5145</td>
			<td>MARCM stock, contains FRT site and GAL80 on 2nd chromosome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>w*, elav (c155)-GAL4, hsFLP, UAS-CD8-GFP</td>
			<td></td>
			<td>BL5146</td>
			<td>MARCM stock, contains hsFLP, pan-neuronal GAL4, and CD8-GFP on X chromosome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>y(1), w*, hsFLP, UAS-CD8-GFP;;FRT82B, Tub&#62;GAL80/TM3, Sb(1);OK107-GAL4</td>
			<td></td>
			<td>BL 44408</td>
			<td>MARCM stock for flipping 3rd chromosome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>y(1), w*, hsFLP, UAS-CD8-GFP;FRT40A, Tub&#62;GAL80;OK107-GAL4</td>
			<td></td>
			<td>BL44406</td>
			<td>MARCM stock for flipping 2nd chromosome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>w*, hsFLP, tub&#62;GAL80, FRT19A; UAS-CD8-GFP/CyO;;OK107-GAL4</td>
			<td></td>
			<td>BL 44407</td>
			<td>MARCM stock for flipping X chromosome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>y(1), w*; UAS-CD8-GFP/CyO</td>
			<td></td>
			<td>BL 5137</td>
			<td>GFP labels cell surface (CD8 is a transmembrane protein)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>y(1), w*; FRTG13, UAS-CD8-GFP</td>
			<td></td>
			<td>BL 5139</td>
			<td>MARCM stock, contains FRT site and CD8-GFP on 2nd chromosome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>y(1), w*, hsFLP, UAS-CD8-GFP; Pin(1)/CyO</td>
			<td></td>
			<td>BL 28832</td>
			<td>MARCM stock, contains hsFLP and CD8-GFP on X chromosome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>w*; FRTG13, Tub&#62;GAL80</td>
			<td></td>
			<td>BL 5140</td>
			<td>MARCM stock, contains FRT site and GAL80 on 2nd chromosome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>y(1), w*;; FRT82B, Tub&#62;GAL80</td>
			<td></td>
			<td>BL 5135</td>
			<td>MARCM stock, contains FRT site and GAL80 on 3rd chromosome</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dissection and immunofluorescent staining of mushroom body and photoreceptor neurons in adult drosophila melanogaster brains

Nervesystemet udvikling indebærer en Sekventiel serie af begivenheder, der koordineres af flere signaling veje og regulerende net. Mange af de proteiner involveret i disse veje er evolutionært bevaret mellem pattedyr og andre eukaryoter, såsom bananfluen Drosophila melanogaster, tyder på, at lignende organisering principper findes under udviklingen af disse organismer. Vigtigere, har Drosophila været udbredt at identificere cellulære og molekylære mekanismer regulere processer, der kræves i pattedyr, herunder neurogenese, differentiering, cytoskeletale vejledning og synaptogenesis. Fluer har også været anvendt med succes til at modellere en række menneskelige udviklingsforstyrrelser sygdomme. Her beskriver vi en protokol for en trinvis microdissection, fiksering og immunfluorescent lokalisering af proteiner i voksen Drosophila hjernen. Denne protokol fokuserer på to eksempel neuronal populationer, champignon krop neuroner og retinal fotoreceptorer, og indeholder valgfrie trin for at spore individuelle champignon krop neuroner ved hjælp af Mosaic analyse med en teknik, Repressible celle markør (MARCM). Eksempeldata fra både vildtype og mutant hjerner er vist sammen med en kort beskrivelse af en scoring kriterier for cytoskeletale vejledning defekter. Mens denne protokol fremhæver to veletablerede antistoffer for at undersøge morfologi af champignon krop og fotoreceptor neuroner, andre Drosophila hjerneregioner og lokalisering af proteiner inden for andre områder af hjernen kan også være undersøgt ved hjælp af denne protokol.

Watch this Scientific Journal Video about Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains at JoVE.com

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Denne protokol beskriver dissektion og immunfarvning af voksen Drosophila melanogaster hjernen væv. Specifikt, fremhæver denne protokol brugen af Drosophila champignon krop og fotoreceptor neuroner som eksempel neuronal delmængder, der præcist kan bruges til at afdække generelle principper ligger til grund for mange aspekter af neuronal udvikling.

Dissektion og immunfluorescent farvning af champignon krop og fotoreceptor neuroner i voksen Drosophila melanogaster hjerner

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva

Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva

Analyse blodlegemer befolkninger i<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Larver

In vertebrates, hematopoiesis is regulated by inductive microenvironments (niches). Likewise, in the invertebrate model organism&#160;Drosophila ...

Rearing the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions

Rearing the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions

Opdræt bananfluen<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Under Axeniske og gnotobiotiske Betingelser

The influence of microbes on myriad animal traits and behaviors has been increasingly recognized in recent years. The fruit fly Drosophila melanogaster is ...

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

Dissektion og farvning af Drosophila puppe æggestokke

Unlike adult Drosophila ovaries, pupal ovaries are relatively difficult to access and examine due to their small size, translucence, and encasing within a ...

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Optøning, dyrkning og Cryopreserving Drosophila cellelinjer

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the ...

Methods to Test Endocrine Disruption in Drosophila melanogaster

Methods to Test Endocrine Disruption in Drosophila melanogaster

Metoder til test endokrine forstyrrelser i Drosophila melanogaster

In recent years there has been growing evidence that all organisms and the environment are exposed to hormone-like chemicals, known as endocrine disruptor ...

Assay for Blood-brain Barrier Integrity in Drosophila melanogaster

Assay for Blood-brain Barrier Integrity in Drosophila melanogaster

Assay for blod-hjerne barriere integritet i Drosophila melanogaster

Proper nervous system development includes the formation of the blood-brain barrier, the diffusion barrier that tightly regulates access to the nervous ...

Dissection and Live-Imaging of the Late Embryonic Drosophila Gonad

Dissection and Live-Imaging of the Late Embryonic Drosophila Gonad

Dissektion og levende billeddannelse af den sene embryonale Drosophila Gonad

The Drosophila melanogaster male embryonic gonad is an advantageous model to study various aspects of developmental biology including, but not limited to, ...

Imaging Live Brain Explants from Drosophila melanogaster Third Instar Larvae

Live-Cell Imaging of Drosophila melanogaster Third Instar Larval Brains

Investigating Asymmetric Cell Division Dynamics: A Protocol for Live-Imaging of Drosophila Larval Brain Explants (Video) | JoVE

Live-celle billeddannelse af Drosophila melanogaster tredje stjerne larvehjerner

Drosophila neural stem cells (neuroblasts, NBs hereafter) undergo asymmetric divisions, regenerating the self-renewing neuroblast, while also forming a ...

Detection and Quantification of Single mRNA Molecules in Drosophila

Studying Muscle Transcriptional Dynamics at Single-molecule Scales in Drosophila

Investigating mRNA Spatial Distribution in Drosophila Muscle Tissue (Video) | JoVE

Undersøgelse af muskeltranskriptionsdynamik ved enkeltmolekyleskalaer i Drosophila

Skeletal muscles are large syncytia made up of many bundled myofibers that produce forces and enable body motion. Drosophila is a classical model to study ...

﻿Staging and Collecting Drosophila melanogaster Third Instar Larvae

ï»¿Staging and Collecting Drosophila melanogaster Third Instar Larvae (Video) | JoVE 

Iscenesættelse og indsamling af Drosophila melanogaster Tredje Instar larver