Name: dissection and immunofluorescent staining of mushroom body and photoreceptor neurons in adult drosophila melanogaster brains
Uploaded: 2017-11-06T16:45:00
Duration: 10 min 13 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains at JoVE.com

We zouden graag bedanken Changhui Pak en Alysia Vrailas Mortimer voor aanvankelijk onderwijs SMK de hersendissectie techniek. Wij danken ook leden van de Ken Moberg lab groep, met name Chris rondes, voor het kritisch lezen van het manuscript. Herkennen van Fas2 antilichamen (1 d 4) en chaoptin (24B10) werden verkregen uit de Developmental Studies Hybridoma Bank. Antilichaam 24B10 werd gestort op de DSHB door Seymour Benzer en Nansi Colley24,60,,61, antilichaam 1 d 4 werd gestort op de DSHB door Corey Goodman 22,23,56. Vliegen voorraden werden verkregen vanuit het midden van de voorraad Bloomington. Wij willen ook danken de Ohio landbouwkundig onderzoek en ontwikkeling Center (OARDC) MCIC Imaging Center voor gebruik van de confocal microscoop om het imago van de hersenen in figuur 4A en B. SMK wordt ondersteund door een subsidie van NICHD (1 R15 HD084241-01A1).

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

De dissectie en visualisatie hierboven beschreven methode kan worden gebruikt in een breed scala van immunokleuring en beeldbewerkingstoepassingen leven. Wij een algemene immunokleuring protocol heb geschetst en hebben gewezen op een manier waarin MARCM kan worden gebruikt voor het visualiseren van axonale morfologie van individuele paddestoel lichaam neuronen. Bovendien, deze algemene procedures kunnen ook worden gebruikt voor andere hersengebieden in vaste imaging of vers ontleed volwassene hersenen48,65. Levende imaging voorschrijven een efficiëntere aanpak bij het analyseren van expressiepatronen enhancer vallen, of reporter genen, MiMIC lijnen66, bijvoorbeeld. Om te voorkomen dat artefacten van celdood tijdens live beeldvorming van GFP in nietgefixeerde weefsel vastleggen, hersenen moeten worden ontleed in 1 x fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) of HL3 media48, gemonteerd op brug dia's in 1 x PBS (of HL3) en beeld in minder dan 15-20 min. Zorg moet ook worden genomen om het verwijderen van zoveel luchtpijp mogelijk van de ontleed hersenen vóór imaging, aangezien het met de visualisatie van GFP fluorescentie interfereren kan.
Terwijl kleuring voorwaarden voor de beoordeling van de morfologie van de paddestoel lichaam en fotoreceptor neuronen relatief gevestigde24,61,67, de lokalisatie van een specifieke proteïne van belang in deze cel zijn typen kunnen vereisen uitgebreide probleemoplossing en optimalisatie. Verschillende kritische stappen, met inbegrip van antilichaam verdunning, blokkerende buffer component concentratie en fixatie, moeten met name worden geoptimaliseerd voor het genereren van de meest reproduceerbaar en betrouwbare resultaten. Ten eerste, de optimale concentratie van primair antilichaam moet worden bepaald. Hoewel verkrijgbare antilichamen vaak een voorgestelde verdunning hebben (en we vaak in eerste instantie beginnen met behulp van die concentratie), wordt deze waarden worden zelden empirisch bepaald op Drosophila weefsels. Dus, het testen van een reeks verdunningen van primair antilichaam dat bereik boven en onder de fabrikant startende suggestie vaak in meer specifieke kleuring resulteert. Terwijl verdunning van het primaire antilichaam kan een significant effect hebben op kleuring van nauwkeurigheid en nauwkeurig moet worden bepaald, de hersenen van de tijd worden geïncubeerd in primair antilichaam bevattende kunnen oplossingen aanzienlijk variëren met weinig effect op het eindresultaat. Bijvoorbeeld, hebben we vergelijkbare resultaten waargenomen wanneer het broeden ontleed hersenen met de Fas2 antilichaam primair antilichaam voor twee, drie of zelfs vier dagen bij 4 ° C. Hoewel we ten minste twee nachten aanraden, hebben wij ook hersenen in primair antilichaam oplossing voor een enkele nacht geïncubeerd en verkregen reproduceerbare kleuring. Nog belangrijker is, helpt beperking van de hoeveelheid tijd hersenen worden geïncubeerd in het secundaire antilichaam tot 3 uur op kamertemperatuur (of één nacht bij 4 ° C) limiet niet-specifieke binding van secundaire antilichamen aan hersenweefsel.
Ten tweede, kan het nodig met extra "blokkeren" reagentia te elimineren van ongewenste achtergrond signaal zijn. Opties omvatten verhoging van de concentratie van NGS ~ 10%, 1-10% boviene serumalbumine (BSA) toe te voegen aan de blokkerende en primaire/secundaire antilichaam oplossingen, of pre adsorptie van primaire antilichamen 's nachts bij 4 ° C met Drosophila embryo's (Zie verwijst naar68, punt 2.9, stap 3).
Terwijl we het bovenstaande protocol gebruikt PTN als de voorgestelde buffer voor alle fixatie hebben geschreven, wassen, en antilichaam-incubatie stappen, weefsel fixatie in andere buffers (zoals PLP en PEM, vermeld in de Materialen tabel) kan leiden tot diepgaande verschillen in de sterkte van het signaal. Bijvoorbeeld, hebben vorige studies aangetoond dat cycline E niet detecteerbaar in larvale imaginaire schijven is wanneer weefsels worden opgelost in traditionele 4% paraformaldehyde verdund in PBS, maar duidelijk zichtbaar is wanneer weefsels worden opgelost in PLP buffer (Ken Moberg, persoonlijke communicatie en verwijzing69). Naast wijzigingen in buffer componenten, wijziging van de tijd en temperatuur voor weefsel fixatie ook aanzienlijk immunefluorescentie beïnvloeden kan kleuring en empirisch kan worden bepaald indien nodig. In het algemeen, fixatie tijd moet lang genoeg om te voorzien in voldoende crosslinking van cellulaire componenten en onderhoud op lange termijn van algemene cellulaire morfologie terwijl ze beperkt genoeg om te voorkomen dat over-crosslinking en "begraven" van eiwit epitopes. Daarom, wanneer aanvankelijk optimaliseren kleuring voorwaarden voor een nieuw verworven primair antilichaam, we meestal beperken fixatie tijd aan ongeveer 20 min en koudere temperaturen vaak weefsels zal vaststellen.
Meerdere besturingselementen moeten worden opgenomen in eventuele immunofluorescentie experiment te onderzoeken van de specificiteit van de primaire en secundaire antilichamen en het effect van transgenen/genetische achtergrond op het waargenomen fenotype. Om na te gaan of het primaire antilichaam specifiek wordt gebruikt de proteïne van belang herkent, moet weefsel van vliegen ontbreekt deze eiwitten en/of weefsel overexpressing het eiwit worden opgenomen als besturingselementen. De toevoeging van overtollige gezuiverd antigeen eiwit kan ook worden opgenomen om te bepalen of het primaire antilichaam andere epitopes in de vlieg hersenen herkent. Tot slot, elke fluorescent signaal aanwezig bij de primaire antilichamen worden weggelaten vertegenwoordigt het niveau van niet-specifieke binding door de geselecteerde secundaire antilichamen.
Verschillende belangrijke besturingselementen moeten ook worden opgenomen voor de beoordeling van de bijdrage van genetische achtergrond of de aanwezigheid van transgenen kleuring intensiteit of neuronale morfologie. Bijvoorbeeld, het vliegen gebruikt in het experiment van de MARCM in Figuur 5 bevatten meerdere transgenen (hsFLP, UAS-CD8-GFP, FRT82B, Bad &#62; GAL80 en OK107-GAL4), die elk afzonderlijk moet worden geanalyseerd voor effecten op de morfologie van de paddestoel lichaam. Op een zeer minimale, paddestoel lichaam morfologie van vliegen moet met zowel OK107-GAL4 en UAS-CD8-GFP worden geanalyseerd. Het kan ook zijn nodig om te beoordelen van het effect van warmte schok en Flp recombinase productie door het analyseren van ontwikkelingssamenwerking paddestoel lichaam vliegt die zowel hsFLP als FRT82B bevatten. Hoewel MARCM significante inzicht of een bepaald eiwit autonoom axonale begeleiding bieden kan bepaalt, kunnen het aantal controles nodig zijn om nauwkeurig deze conclusie een kleine beperking van deze techniek. Soortgelijke besturingselementen zijn in minder ingewikkeld experimenten, ook van toepassing. Bijvoorbeeld, neem een experiment waarin het GAL4/UAS -systeem wordt gebruikt in combinatie met een RNAi transgenic tot vechtpartij uitdrukking van een proteïne van belang in alle neuronen. In dit experiment, zullen ten minste twee transgenen aanwezig zijn: een pan-neuronale GAL4 stuurprogramma, zoals elav-GAL4, en de UAS-RNAi transgenic. De morfologie van de paddestoel lichaam neuronen in vliegen met elk van deze transgenen alleen moet naast de experimentele conditie waar vliegen beide transgenen in de dezelfde Vlieg haven worden onderzocht.
Tot slot, om te bepalen of de proteïne van belang wordt uitgedrukt in champignon lichaam neuronen er meestal moet mede vlek hersenen met antilichamen tegen Fas2. Als alternatief, fluorescente proteïnen zoals GFP, RFP of het membraan gebonden CD8-GFP kunnen ook worden uitgedrukt met behulp van de GAL4/UAS -systeem en gebruikt in combinatie met antistoffen herkennen van de proteïne van belang. Fas2 herkent alleen de fasciculated axonen die de paddestoel lichaam α en β lobben vormen, is het gebruik van GAL4-gedreven, membraan-gebonden CD8-GFP sinds vooral handig voor het markeren van de paddestoel lichaam neuronen.
Defecten in axonale begeleiding zijn vaak niet 100% penetrant en zelfs hersenen dezelfde genotype mei uiterlijk vertoon sommige variabiliteit. Daarom, wanneer analyseren nieuw gegenereerd mutant allelen voor gebreken in champignon lichaam of fotoreceptor vastloper, een combinatie van verschillende allelen en benaderingen moet worden benut. De meeste studies in de literatuur gebruiken verscheidene verschillende benaderingen om te onderzoeken of een eiwit een cel-autonome rol speelt in de controle van axonale begeleiding: ik) analyse van vastloper gebreken in homozygoot null vliegen (bij voorkeur met behulp van verschillende null allelen), ii) analyse van vastloper gebreken in vliegen ontbreekt de proteïne van belang alleen in neuronen (meestal via RNAi), iii) MARCM analyse van vastloper gebreken, en iv) redden experimenten waar het gen opnieuw uitgedrukt in de neuronen van homozygoot null is vliegen. Verscheidene dozijn hersenen per genotype moeten idealiter worden geanalyseerd voor gebreken in neuronale morfologie.
Hoewel het protocol hier voornamelijk richt zich op immunefluorescentie lokalisatie van eiwitten binnen vaste weefsel beschreven, worden verschillende toekomstige toepassingen van deze techniek ontwikkeld naar afbeelding live hersenweefsel. Zodra de hersenen worden ontleed (meestal in cel voedingsbodems), kunnen zij vervolgens worden gekweekt voor meerdere dagen bij 25 ° C. Deze ex vivo kweken methoden worden ontwikkeld om te onderzoeken van een breed scala aan biologische processen, zoals de activiteit van het eiwit die axon regeneratie na letsel70,71, intracellulaire bevordert signalering dynamics72en73van de neuronale ontwikkeling.

Hoewel het zenuwstelsel Drosophila kleiner dan die van de mens en knaagdieren is, biedt de complexiteit ervan een krachtige, aanspreekbaar model om beter te begrijpen zijn gewervelde tegenhangers. In veel gevallen coderen het genoom van de gewervelde dieren en vliegen zeer vergelijkbaar eiwitten die de mechanismen van ontwikkeling van het zenuwstelsel dicteren. In feite, nodig veel van de genen voor neuronale ontwikkeling in gewervelde dieren orthologs in vliegen, met inbegrip van die betrokken zijn bij signaalroutes dat controle patronen, neurogenese en axonale begeleiding1,2,3 ,4,5. Netrin is bijvoorbeeld een ligand die nodig zijn voor de oriëntatie van de axonale in zoogdieren en D. melanogaster6,7,8. Terwijl netrin oorspronkelijk geïsoleerd van embryonale chick hersenen weefsel6 was, latere studies is gebleken dat netrin een geconserveerde rol speelt tijdens de ontwikkeling van de embryonale centrale zenuwstelsel (CNS) in Drosophila8. Andere studies hebben genetische schermen waarmee in de embryonale Drosophila CNS geconserveerde liganden en receptoren vereist voor vastloper in zowel Drosophila en gewervelde dieren9aangeduid.
Terwijl de embryonale vlieg CNS heeft uitgebreid in het verleden is gebruikt als aanduiding van liganden, receptoren en intracellulaire signalering eiwitten nodig voor axonale begeleiding8,9, heeft recent werk waar velen van de manieren onderzocht deze eiwitten ook bepalen vastloper besluiten tijdens de latere stadia van ontwikkeling. In het bijzonder heeft onderzoek van paddestoel lichaam (MB) en de retinale fotoreceptor neuron ontwikkeling (Figuur 1) verstrekt inzicht in de mechanismen die controle vastloper, synaps formatie, axon snoeien en verschillende andere aspecten van neuronale ontwikkeling10,11,12,13,14,15,16,17. Fotoreceptor neuronen het vliegen netvlies verbinden met regio's van de volwassen hersenen genaamd de lamina en medulla en zijn essentieel voor het doorgeven van visuele informatie naar de hersenen (herzien door18,-19), terwijl de paddestoel lichaam neuronen zijn Centraal gelegen in de vlieg hersenen en zijn nodig voor leren en geheugen20,-21. Fotoreceptor neuronen zowel de intrinsieke neuronen van de paddestoel organen, Kenyon cellen, genaamd gebruiken evolutionair geconserveerde diffusible en contact-afhankelijke axonale begeleiding mechanismen om te zoeken naar hun post synaptic doelen. Naast het feit dat zichtbaar in volwassen vliegen, kunnen fotoreceptor en MB neuronen ook worden rechtstreeks gevisualiseerd in larven en poppen met antilichamen of verslaggever genen22,23,24,25. De mogelijkheid om gemakkelijk het visualiseren van deze twee sets van neuronen op verschillende ontwikkelings tijd punten heeft het gebruik ervan als prachtige modellen voor vele aspecten van neuronale ontwikkeling bevorderd.
Naast wordt gebruikt als een model om te begrijpen van de mechanismen van de normale zenuwstelsel ontwikkeling, hebben recente studies aangetoond dat vliegen ook als accurate modellen van een breed scala van ziekten bij de mens dienen kunnen, met inbegrip van fragiele X syndroom (FXS)26 , Intellectuele handicap (ID)27,28,29,30,31, e.a.32. Bijvoorbeeld om te bestuderen van de moleculaire functie van ZC3H14, een gen onlangs gekoppeld aan menselijke verstandelijke beperking, we vliegen heeft een model gemaakt van ID met behulp van een null-allel van de vlieg ZC3H14 ortholog, Nab230genoemd. Vliegen ontbreekt Nab2 hebben ernstige geheugen waardeverminderingen en uitgebreid poly(A) staarten, Recapitulerend wat is waargenomen in menselijke patiënten of patiënt afgeleid cel lijnen33,34. Bovenal weergeven vliegen ontbreekt Nab2 ook ernstige hersenen morfologie gebreken in hun volwassen paddestoel organen34, vergelijkbaar met wat is waargenomen in vliegen de FXS syndroom gen, FMR135ontbreekt. Vliegen kunnen dus dienen als een belangrijk model-organisme om te studeren zowel normale hersenontwikkeling en ziekten die verstoren.
Tot slot, de toegankelijkheid van hoge-doorvoer methoden om te controleren van gedrag, gecombineerd met het enorme aantal beschikbare genetische hulpmiddelen, zorg Drosophila een modelorganisme van keuze voor het identificeren van de hersengebieden waarmee complexe gedrag, zoals leren en geheugen, slaap, verkering, dorst en anderen36,37,38,39. Een bijzonder nuttig instrument dat in het midden van een vlieg geneticus "gereedschapskist" is de GAL4/UAS-systeem (Figuur 2). Dit systeem40,41 gebruikt de specifieke expressie weefsel van de transcriptionele activator van Gal4 om de expressie van genen of transgenen stroomafwaarts van een Upstream activeren sequentie (UAS). Wijzigingen van dit systeem zijn toegestaan onderzoekers, bijvoorbeeld, exact bepalen de prikkelbaarheid van specifieke neuronen42,43, overexpress of knock-down specifieke genen van belang44, 45, real-time calcium dynamiek in vivo46analyseren en express reporter genen ter gelegenheid van de neuronale lineages41. De combinatie van het GAL4/UAS-systeem met Mitotische recombinatie ook toegestaan voor de oprichting van het mozaïek-analyse met een Repressible cel Marker (MARCM) systeem12,47. MARCM is gebruikt uitgebreid in enkel neuron tracering om de cellulaire signalering onderdelen vereist voor axonale begeleiding12,47te identificeren. Hoewel deze en andere technieken een aantal waardevolle inzichten over de cellulaire mechanismen die nodig zijn voor de functie van het zenuwstelsel verschaft hebben, de meeste vereisen dat de hersenen van Drosophila eerst worden ontleed; zorgvuldige verwijdering van de hersenen is verplicht te houden juiste hersenen morfologie en verbinding patronen tussen hersengebieden. Het volgende protocol gebruikt paddestoel lichaam en fotoreceptor neuronen alsvoorbeeld neuronale populaties als het begeleidt u doorheen de dissectie en immunefluorescentie kleuring van volwassene Drosophila hersenen.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Microdissection forceps/tweezers</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>505-NM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard dishes</td>
			<td>Living Systems Instrumentation</td>
			<td>DD-50-S-BLK</td>
			<td>Available from amazon.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fas2 Antibody</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>1D4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chaoptin Antibody</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>24B10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP Antibody</td>
			<td>Aves Lab</td>
			<td>GFP-1010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa488 goat anti-mouse secondary antibody</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A-11001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa488 goat anti-chicken secondary antibody</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A-11039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa647 goat anti-mouse secondary antibody</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A-21236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20% paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscope Services</td>
			<td>RT15713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VectaShield</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>H-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperFrost Plus Slides</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>99-910-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12-553-454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na Phosphate Buffer monobasic</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S3139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na phosphate Buffer dibasic</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S3264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X 100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>X100-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fingernail polish</td>
			<td>Electron Microscope Services (EMS)</td>
			<td>72180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stereomicroscope</td>
			<td>Leica S6D with KL300 LED light source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9-well dish (spot plate)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89090-482</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nutator/rocker</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>22-363-152 or 88-861-041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35mm dish</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>32-103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>50-366-794</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipe</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>06-666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potential Fixation Buffers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTN Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.1M NaPhosphate, pH 7.2, 0.1% Triton-X-100, Typically make up 0.5 L of 0.1M NaPhosphate buffer and aliquote 50ml at a time as needed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PLP buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>2% paraformaldehyde, 0.01M NaI04, 0.075M Lysine, 0.037M NaPO4, pH 7.2, Dissolve 0.36 g lysine in 10 ml H2O + 7.5 ml 0.1 M NaH2PO4 pH 7.2 + 2.5 ml 0.1 M Na2HPO4 on ice. Immediately before use, mix 15 ml of this buffered lysine solution with 50 mg NaIO4 (sodium periodate) + 2ml of the 20% high grade paraformaldehyde (EMS) + 3ml H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEM buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.1M PIPES pH 7.0, 2mM MgS04, 1mM EGTA, This buffer can be conveniently made as a 2x stock and diluted with 8% paraformaldehyde (PFA) to give a final concentration of 4% PFA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fly Stocks available from Bloomington</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>elav (c155)-GAL4</td>
			<td></td>
			<td>BL458</td>
			<td>Pan-neuronal GAL4 driver</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>w*;;;OK107-GAL4</td>
			<td></td>
			<td>BL 854</td>
			<td>GAL4 driver for all mushroom body neurons (OK107-GAL4 insertion is on the 4th chromosome)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>y(1), w(67c23); c739-GAL4</td>
			<td></td>
			<td>BL 7362</td>
			<td>GAL4 driver for alpha and beta lobes (on 2nd chromosome)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>y(1), w(67c23); c739-GAL4, UAS-CD8-GFP</td>
			<td></td>
			<td>BL 64305</td>
			<td>GAL4 driver for alpha and beta lobes, also contains UAS-CD8-GFP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>w*; 201Y-GAL4</td>
			<td></td>
			<td>BL 4440</td>
			<td>GAL4 driver for primarily the gamma lobes of mushroom body (on 2nd chromosome)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>y(1), w(67c23); 201Y-GAL4, UAS-CD8-GFP</td>
			<td></td>
			<td>BL 64296</td>
			<td>GAL4 driver for mushroom body gamma lobes, also contains UAS-CD8-GFP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>w*, elav (c155)-GAL4, hsFLP; FRTG13, Tub&#62;Gal80/CyO</td>
			<td></td>
			<td>BL 5145</td>
			<td>MARCM stock, contains FRT site and GAL80 on 2nd chromosome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>w*, elav (c155)-GAL4, hsFLP, UAS-CD8-GFP</td>
			<td></td>
			<td>BL5146</td>
			<td>MARCM stock, contains hsFLP, pan-neuronal GAL4, and CD8-GFP on X chromosome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>y(1), w*, hsFLP, UAS-CD8-GFP;;FRT82B, Tub&#62;GAL80/TM3, Sb(1);OK107-GAL4</td>
			<td></td>
			<td>BL 44408</td>
			<td>MARCM stock for flipping 3rd chromosome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>y(1), w*, hsFLP, UAS-CD8-GFP;FRT40A, Tub&#62;GAL80;OK107-GAL4</td>
			<td></td>
			<td>BL44406</td>
			<td>MARCM stock for flipping 2nd chromosome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>w*, hsFLP, tub&#62;GAL80, FRT19A; UAS-CD8-GFP/CyO;;OK107-GAL4</td>
			<td></td>
			<td>BL 44407</td>
			<td>MARCM stock for flipping X chromosome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>y(1), w*; UAS-CD8-GFP/CyO</td>
			<td></td>
			<td>BL 5137</td>
			<td>GFP labels cell surface (CD8 is a transmembrane protein)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>y(1), w*; FRTG13, UAS-CD8-GFP</td>
			<td></td>
			<td>BL 5139</td>
			<td>MARCM stock, contains FRT site and CD8-GFP on 2nd chromosome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>y(1), w*, hsFLP, UAS-CD8-GFP; Pin(1)/CyO</td>
			<td></td>
			<td>BL 28832</td>
			<td>MARCM stock, contains hsFLP and CD8-GFP on X chromosome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>w*; FRTG13, Tub&#62;GAL80</td>
			<td></td>
			<td>BL 5140</td>
			<td>MARCM stock, contains FRT site and GAL80 on 2nd chromosome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>y(1), w*;; FRT82B, Tub&#62;GAL80</td>
			<td></td>
			<td>BL 5135</td>
			<td>MARCM stock, contains FRT site and GAL80 on 3rd chromosome</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dissection and immunofluorescent staining of mushroom body and photoreceptor neurons in adult drosophila melanogaster brains

Zenuwstelsel ontwikkeling betekent een opeenvolgende reeks van gebeurtenissen die door verschillende signaalroutes en regulerende netwerken worden gecoördineerd. Veel van de eiwitten die betrokken zijn in deze trajecten zijn evolutionair bewaard tussen zoogdieren en andere eukaryoten, zoals de fruitvlieg Drosophila melanogaster, suggereren dat soortgelijke organiserende beginselen bestaan tijdens de ontwikkeling van deze genetisch gemodificeerde organismen. Bovenal is Drosophila gebruikt uitgebreid te identificeren van cellulaire en moleculaire mechanismen tot regeling van de processen die nodig zijn bij zoogdieren waaronder neurogenese, differentiatie, axonale begeleiding en synaptogenese. Vliegen zijn ook met succes gebruikt om het model van een scala van menselijke neurologische ziekten. Hier beschrijven we een protocol voor de stapsgewijze microdissection, fixatie en immunefluorescentie lokalisatie van eiwitten in de hersenen Drosophila volwassen. Dit protocol is gericht op twee voorbeeld neuronale populaties, paddestoel lichaam neuronen en netvlies researchdieren en bevat optionele stappen wilt traceren van individuele paddestoel lichaam neuronen mozaïek analyse met een Repressible cel Marker (MARCM)-techniek. Voorbeeldgegevens uit zowel wild-type en mutant hersenen worden getoond samen met een korte beschrijving van een scorende criteria voor axonale begeleiding gebreken. Terwijl dit protocol twee gevestigde antilichamen benadrukt voor het onderzoeken van de morfologie van de paddestoel lichaam en fotoreceptor neuronen, andere Drosophila hersengebieden en de lokalisatie van eiwitten binnen andere hersengebieden kan ook worden onderzocht met behulp van dit protocol.

Watch this Scientific Journal Video about Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains at JoVE.com

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dit protocol beschrijft de dissectie en immunokleuring van volwassen Drosophila melanogaster brain weefsels. Dit protocol benadrukt in het bijzonder het gebruik van Drosophila paddestoel lichaam en fotoreceptor neuronen als voorbeeld neuronale subsets kunt weergeven die nauwkeurig kunnen worden gebruikt voor het ontdekken van de algemene beginselen die ten grondslag liggen aan vele aspecten van neuronale ontwikkeling.

Dissectie en immunefluorescentie kleuring van Mushroom lichaam en fotoreceptor neuronen in de hersenen van de volwassen Drosophila melanogaster

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva

Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva

Testen Bloedcel Populaties van de<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Larva

In vertebrates, hematopoiesis is regulated by inductive microenvironments (niches). Likewise, in the invertebrate model organism&#160;Drosophila ...

Rearing the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions

Rearing the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions

Het grootbrengen de fruitvlieg<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Onder Axenische en gnotobiotische voorwaarden

The influence of microbes on myriad animal traits and behaviors has been increasingly recognized in recent years. The fruit fly Drosophila melanogaster is ...

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

Dissectie en kleuring van Drosophila pop eierstokken

Unlike adult Drosophila ovaries, pupal ovaries are relatively difficult to access and examine due to their small size, translucence, and encasing within a ...

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Ontdooien, kweken en Cryopreserving van Drosophila cellijnen

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the ...

Methods to Test Endocrine Disruption in Drosophila melanogaster

Methods to Test Endocrine Disruption in Drosophila melanogaster

Methoden voor het testen van endocriene verstoring in fruitvliegje melanogaster

In recent years there has been growing evidence that all organisms and the environment are exposed to hormone-like chemicals, known as endocrine disruptor ...

Assay for Blood-brain Barrier Integrity in Drosophila melanogaster

Assay for Blood-brain Barrier Integrity in Drosophila melanogaster

Test voor de integriteit van de bloed-hersen barrière in Drosophila melanogaster

Proper nervous system development includes the formation of the blood-brain barrier, the diffusion barrier that tightly regulates access to the nervous ...

Dissection and Live-Imaging of the Late Embryonic Drosophila Gonad

Dissection and Live-Imaging of the Late Embryonic Drosophila Gonad

Dissectie en live-imaging van de late embryonale drosophila gonad

The Drosophila melanogaster male embryonic gonad is an advantageous model to study various aspects of developmental biology including, but not limited to, ...

Imaging Live Brain Explants from Drosophila melanogaster Third Instar Larvae

Live-Cell Imaging of Drosophila melanogaster Third Instar Larval Brains

Investigating Asymmetric Cell Division Dynamics: A Protocol for Live-Imaging of Drosophila Larval Brain Explants (Video) | JoVE

Live-Cell Imaging van Drosophila melanogaster Derde Instar Larvale Hersenen

Drosophila neural stem cells (neuroblasts, NBs hereafter) undergo asymmetric divisions, regenerating the self-renewing neuroblast, while also forming a ...

Detection and Quantification of Single mRNA Molecules in Drosophila

Studying Muscle Transcriptional Dynamics at Single-molecule Scales in Drosophila

Investigating mRNA Spatial Distribution in Drosophila Muscle Tissue (Video) | JoVE

Studie van spiertranscriptionele dynamica op enkelvoudige molecuulschalen in Drosophila

Skeletal muscles are large syncytia made up of many bundled myofibers that produce forces and enable body motion. Drosophila is a classical model to study ...

﻿Staging and Collecting Drosophila melanogaster Third Instar Larvae

ï»¿Staging and Collecting Drosophila melanogaster Third Instar Larvae (Video) | JoVE 

Enscenering en verzameling van Drosophila melanogaster Derde Instar Larven