Name: dissection and immunofluorescent staining of mushroom body and photoreceptor neurons in adult drosophila melanogaster brains
Uploaded: 2017-11-06T16:45:00
Duration: 10 min 13 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains at JoVE.com

Nous tenons à remercier Changhui Pak et Alysia Vrailas Mortimer pour initialement enseigner SMK la technique de dissection du cerveau. Nous remercions également les membres du groupe de laboratoire de Ken Moberg, en particulier les tours de Chris, pour la lecture critique du manuscrit. Anticorps reconnaissant Fas2 (1, 4) et chaoptin (24B10) ont été extraites de la Banque d’hybridome études du développement. Anticorps 24B10 a été déposé à la DSHB par Seymour Benzer et Nansi Colley24,60,61, anticorps 1 4 a été déposé à la DSHB par Corey Goodman 22,23,56. Stocks de mouches ont été obtenues depuis le centre de Stock de Bloomington. Nous tenons également à remercier l’Ohio Agricultural Research et Development Center (OARDC) MCIC Imaging Center pour l’utilisation du microscope confocal à l’image du cerveau dans la Figure 4 a et B. SMK est soutenu par une subvention du NICHD (1 R15 HD084241-01 a 1).

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun intérêt financier concurrentes.

La méthode de dissection et visualisation décrite ci-dessus peut être utilisée dans une grande variété d’immunomarquage et vivre des applications d’imagerie. Nous ont esquissé un protocole général immunostaining et ont mis en évidence dans lequel MARCM peut être utilisé pour visualiser la morphologie axone des neurones individuels du corps aux champignons. En outre, ces procédures générales peuvent également être utilisés pour l’imagerie des autres régions du cerveau en fixe ou adulte fraîchement disséqué brains48,65. L’imagerie Live peut fournir une approche plus efficace lors de l’analyse des profils d’expression des pièges d’enhancer, gènes rapporteurs ou imitateur lignes66, par exemple. Pour prévenir la capture d’artefacts de la mort cellulaire en imagerie live de GFP dans les tissus non fixées, cerveau doit être disséqué en 1 x Saline tamponnée au Phosphate (PBS) ou HL3 médias48, montés sur des glissières de pont en 1 x PBS (ou HL3) et imagés dans moins de 15-20 min de soins devraient également être prises pour éliminer autant trachée possible du cerveau disséqué avant l’imagerie, puisqu’il peut interférer avec la visualisation de la fluorescence de la GFP.
Alors que les conditions de coloration pour l’évaluation de la morphologie des champignons neurones corps et photorécepteurs sont relativement bien établi24,61,67, la localisation d’une protéine spécifique d’intérêt dans ces cellules types peuvent exiger une vaste dépannage et optimisation. En particulier, plusieurs étapes critiques, y compris la dilution des anticorps, concentration de l’élément tampon bloquant et fixation, doivent être optimisés pour générer des résultats plus fiables et reproductibles. Tout d’abord, la concentration optimale d’anticorps primaire doit être déterminée. Bien que les anticorps disponibles dans le commerce ont souvent une dilution suggérée (et souvent au départ, nous commençons à l’aide de cette concentration), ces valeurs sont rarement déterminées empiriquement sur des tissus de drosophile . Par conséquent, à l’essai une série de dilutions de l’anticorps primaire qui gamme au-dessus et au-dessous de suggestion de départ du fabricant souvent se traduit par une coloration plus spécifiques. Alors que la dilution de l’anticorps primaire peut avoir un effet significatif sur la coloration de précision et doit être déterminée avec précision, les cerveaux de temps sont incubés dans l’anticorps primaire contenant les solutions peuvent varier considérablement avec peu d’effet sur le résultat global. Par exemple, nous avons observé des résultats similaires lors de l’incubation disséqué de cerveau avec l’anticorps primaire d’anticorps Fas2 pour deux, trois ou même quatre jours à 4 ° C. Bien que nous recommandions d’au moins deux nuits, nous avons également incubés cerveaux dans la solution d’anticorps primaire pour une seule nuit et obtenu une coloration reproductible. Ce qui est important, limitant la quantité de temps de cerveaux est incubés dans l’anticorps secondaire à 3 h à température ambiante (ou une nuit à 4 ° C) aide limite non-spécifiques d’anticorps secondaires aux tissus du cerveau.
En second lieu, il peut être nécessaire d’utiliser des réactifs de « blocage » supplémentaires afin d’éliminer le signal de fond indésirables. Options consistent à accroître la concentration de NGS à environ 10 %, en ajoutant 1 à 10 % Bovine Serum Albumin (BSA) au blocage ou primaire/secondaire solutions d’anticorps ou adsorption préalable des anticorps primaires pendant la nuit à 4 ° C avec des embryons de drosophile (voir référence68, section 2.9, étape 3).
Alors que nous avons écrit le protocole ci-dessus en utilisant PTN comme tampon suggérée pour la fixation de tous, lavage et les étapes d’incubation anticorps, fixation du tissu dans les autres tampons (par exemple, PLP et PEM, répertoriées dans le Tableau des matériaux) peut entraîner des différences profondes dans force du signal. Par exemple, des études antérieures ont démontré que la cycline E est indétectable dans les disques imaginaux larvaires quand les tissus sont fixés à traditionnel 4 % paraformaldéhyde, dilué dans du PBS, mais est bien visible lorsque les tissus sont fixés dans un tampon PLP (Ken Moberg, personnels communication et référence69). En plus des modifications dans la mémoire tampon composants, modifier l’heure et la température pour la fixation du tissu peut affecter aussi significativement par immunofluorescence souillant et peut être déterminées empiriquement si nécessaire. En règle générale, temps de fixation doit être suffisamment long pour permettre une réticulation suffisante des composants cellulaires, et le maintien à long terme de la morphologie cellulaire dans l’ensemble tout en étant limité assez pour l’empêcher de trop-réticulation et « enterrer » des épitopes des protéines. Par conséquent, quand initialement optimisation des conditions de coloration pour un anticorps primaire nouvellement acquise, nous généralement limiter le temps de fixation à environ 20 min et fixera souvent des tissus à des températures plus froides.
Plusieurs contrôles devraient figurer dans toute expérience d’immunofluorescence pour étudier la spécificité des anticorps primaires et secondaires ainsi que l’effet des transgènes/génétique sur le phénotype observé. Pour vérifier si l’anticorps primaire utilisé spécifiquement reconnaît la protéine d’intérêt, tissu de mouches manque cette protéine et/ou tissus surexprimant la protéine devrait figurer comme témoins. L’ajout de protéine purifiée excès peut également être incluse pour déterminer si l’anticorps primaire reconnaît autres épitopes dans le cerveau de mouche. Enfin, n’importe quel signal fluorescent présent lorsque les anticorps primaires sont omises représente le niveau de liaisons non spécifiques par les anticorps secondaires sélectionnés.
Plusieurs commandes importantes devraient également figurer afin d’évaluer la contribution du bagage génétique ou la présence de transgènes à intensité de coloration ou de la morphologie neuronale. Par exemple, les mouches utilisées pour l’expérience MARCM dans la Figure 5 contient plusieurs transgènes (hsFLP, SAMU-CD8-GFP, FRT82B, cuve &#62; GAL80 et OK107-GAL4), chacune d'entre elles doit être analysée séparément pour les effets sur la morphologie du corps aux champignons. À une morphologie corps très minimale, champignon des mouches contenant OK107-GAL4 et SAMU-CD8-GFP doit être analysée. Il peut également être nécessaire d’évaluer l’effet du choc thermique et production recombinase Flp sur le développement de champignons corps en analysant les mouches contenant hsFLP et FRT82B. Bien que MARCM peut fournir la perspicacité significative dans la question de savoir si une protéine donnée contrôle autonome guidage axonal, le nombre de contrôles devra effectuer avec précision cette conclusion peut être une limitation mineure de cette technique. Dans les expériences moins compliquées, contrôles similaires sont également applicables. Par exemple, prenons une expérience où le système de GAL4/UAS est utilisé en combinaison avec un transgène ARNi à coup de masse expression d’une protéine d’intérêt dans tous les neurones. Dans cette expérience, au moins deux transgènes seront présents : un pilote de GAL4 pan-neuronale, comme Elav-GAL4 et le transgène SAMU-Arni . La morphologie des neurones corps aux champignons chez les mouches contenant chacune de ces transgènes seuls devrait être étudiée en plus de la condition expérimentale où les mouches abritent les deux transgènes chez la mouche même.
Enfin, pour déterminer si la protéine d’intérêt est exprimée dans les neurones du corps aux champignons c’est généralement nécessaire de cerveaux co tache avec anticorps anti-Fas2. Par ailleurs, des protéines fluorescentes comme GFP, DP ou la membrane liée CD8-GFP peuvent aussi être exprimées en utilisant le système de GAL4/UAS et utilisé en combinaison avec des anticorps reconnaissant la protéine d’intérêt. Car Fas2 ne reconnaît que les axones fasciculées qui forment les lobes α et β du corps aux champignons, l’utilisation de GAL4 axée sur la, membranaires CD8-GFP a été particulièrement utile pour le marquage des neurones corps aux champignons.
Défauts dans le guidage axonal ne sont souvent pas 100 % ressuage et même cerveau de même génotype peut montrer une variabilité. Par conséquent, lors de l’analyse nouvellement généré des allèles mutants pour déceler les défauts dans corps du champignon ou pathfinding photorécepteur, une combinaison d’allèles différents et des approches devrait être utilisée. La plupart des études dans la littérature utilisent plusieurs approches différentes pour étudier si une protéine joue un rôle autonome cellule dans le contrôle de guidage axonal : J’ai) analyse de pathfinding défauts chez les homozygotes mouches null (préférence en utilisant les différent nuallèles ll), ii) analyse de pathfinding défauts chez les mouches manque la protéine d’intérêt que dans les neurones (généralement par l’intermédiaire d’Arni), iii) analyse MARCM des défauts de pathfinding et iv) expériences où le gène est ré-exprimé dans les neurones null homozygotes de sauvetage mouches. Idéalement, plusieurs douzaines cerveaux par génotype devrait être analysés pour déceler les défauts dans la morphologie neuronale.
Bien que le protocole décrit ici est principalement axé sur la localisation par immunofluorescence des protéines dans le tissu fixe, plusieurs futures applications de cette technique sont développées aux tissus du cerveau live image. Une fois que les cerveaux est disséqués (généralement dans les milieux de culture cellulaire), ils peuvent être ensuite cultivées pendant plusieurs jours à 25 ° C. Ces méthodes de culture ex vivo sont développés afin d’enquêter sur une grande variété de processus biologiques, tels que l’activité de la protéine qui favorise la régénération axonale après blessure70,71, intracellulaire signalisation dynamique72et73de la développement neuronal.

Bien que le système nerveux de drosophile est inférieur à celle des humains et des rongeurs, sa complexité fournit un modèle puissant, facile d’approche pour mieux comprendre ses homologues vertébrés. Dans de nombreux cas, les génomes de vertébrés et mouches codent des protéines très similaires qui régissent les mécanismes de développement du système nerveux. En fait, plusieurs des gènes requis pour développement neuronal chez les vertébrés ont orthologues chez les mouches, y compris ceux impliqués dans les voies de signalisation qui contrôle patterning, neurogenèse et guidage axonal1,2,3 ,4,5. Par exemple, la nétrine est un ligand requis pour guidage axonal chez les mammifères et de d. melanogaster6,7,8. Tandis que la nétrine a été isolé à l’origine d’embryon de poulet de tissu du cerveau6, des études ultérieures ont révélé que la nétrine joue un rôle conservé au cours du développement du système nerveux central embryonnaire (CNS) dans drosophile8. Autres études ont utilisé des écrans génétiques dans l' embryon Drosophila CNS pour identifier des ligands conservées et récepteurs requis pour l’axonal dans drosophile et vertébrés9.
Alors que la mouche embryonnaire CNS a été largement utilisée dans le passé pour identifier les ligands des récepteurs et les protéines de signalisation intracellulaires requis pour guidage axonal8,9, travaux récents a étudié la façon dont beaucoup de ces protéines contrôlent aussi les décisions de pathfinding lors des étapes ultérieures du développement. Plus précisément, enquête du corps aux champignons (MB) et le développement de neurone photorécepteur rétinien (Figure 1) a fourni les mécanismes que pathfinding de contrôle, la formation des synapses, élagage axone et plusieurs autres aspects de neuronale développement10,11,12,13,14,15,16,17. Les neurones photorécepteurs connectent la rétine mouche aux régions du cerveau adulte appelée limbe et médullaire et crucial pour relayer l’information visuelle vers le cerveau (évaluée par18,19), tandis que les neurones corps champignons sont centralement situé dans le cerveau de mouche et sont nécessaires pour l’apprentissage et la mémoire de20,21. Les neurones photorécepteurs et les neurones intrinsèques des organes aux champignons, appelées cellules de Kenyon, utilisent des mécanismes évolutionnaires conservées guidage axonal diffusible et dépendante du contact pour trouver leurs cibles post-synaptiques. En plus d’être visible dans les mouches adultes, photorécepteur et MB neurones peuvent également être directement visualisées dans les larves et les nymphes avec anticorps ou journaliste gènes22,23,24,25. La possibilité de visualiser facilement ces deux ensembles de neurones à différents moments du développement a favorisé leur utilisation comme superbes modèles pour de nombreux aspects du développement neuronal.
Outre son utilisation comme un modèle pour comprendre les mécanismes du développement normal du système nerveux, des études récentes ont démontré que les mouches peuvent aussi servir de modèles précis d’une grande variété de maladies humaines, y compris le Syndrome Fragile de X (FXS)26 , La déficience intellectuelle (ID)27,28,29,30,31, etc.32. Par exemple, pour étudier la fonction moléculaire des ZC3H14, un gène récemment lié à la déficience intellectuelle humaine, nous créé un modèle de mouche d’ID à l’aide d’un allèle nul de la mouche ZC3H14 orthologues, appelée Nab2,30. Mouches manque Nab2 ont des troubles de mémoire grave et prolongé la queue poly (a), récapitulant ce qui est observé chez des patients humains ou patient dérivé cellule lignes33,34. Ce qui est important, mouches manque Nab2 également affichent cérébrales graves défauts de morphologie dans leurs organes de champignons adultes34, semblable à ce qui est observé chez les mouches dépourvues du gène du syndrome FXS, FMR135. Ainsi, mouches peuvent servir comme un organisme modèle important d’étudier les développement normal du cerveau et les maladies qui perturbent l’il.
Enfin, l’accessibilité des méthodes à haut débit pour surveiller le comportement, associé avec la vaste gamme d’outils génétiques disponibles, faire drosophile , un organisme modèle de choix pour identifier les régions du cerveau qui contrôlent les comportements complexes, tels que apprentissage et mémoire, le sommeil, la parade nuptiale, soif et autres36,37,38,,39. Un outil particulièrement utile qui est au centre de « boîte à outils » une mouche généticien est le système de GAL4/UAS (Figure 2). Ce système40,41 utilise expression spécifique des tissus de l’activateur de la transcription Gal4 afin d’augmenter l’expression des gènes ou des transgènes en aval d’une séquence d’activant en amont (UAS). Modifications de ce système ont permis aux chercheurs de, par exemple, de contrôler avec précision l’excitabilité des neurones spécifiques42,43, overexpress ou précipitation des gènes spécifiques d’intérêt44, 45, d’analyser la dynamique en temps réel de calcium en vivo46et exprimer des gènes rapporteurs pour marquer les lignées neuronales41. La combinaison du système de GAL4/UAS avec la recombinaison mitotique a également permis la création de l’analyse de mosaïque avec un marqueur de cellule répressible (MARCM) système12,47. MARCM a été largement utilisé dans le traçage seul neurone pour identifier les composants de signalisation cellulaires requis pour le guidage axonal12,47. Bien que ces autres techniques et ont fourni un certain nombre de renseignements précieux sur les mécanismes cellulaires requis pour le fonctionnement du système nerveux, la plupart exigent que le cerveau de Drosophila tout d’abord être disséqué ; enlèvement soigneux du cerveau est tenue de conserver bon cerveau patrons morphologie et connexion entre les régions du cerveau. Le protocole suivant utilise des neurones corps et photorécepteur champignons commepopulations neuronales exemple telle qu’elle vous guide à travers la dissection et cerveaux de drosophile par immunofluorescence souillant d’adulte.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Microdissection forceps/tweezers</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>505-NM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard dishes</td>
			<td>Living Systems Instrumentation</td>
			<td>DD-50-S-BLK</td>
			<td>Available from amazon.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fas2 Antibody</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>1D4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chaoptin Antibody</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>24B10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP Antibody</td>
			<td>Aves Lab</td>
			<td>GFP-1010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa488 goat anti-mouse secondary antibody</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A-11001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa488 goat anti-chicken secondary antibody</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A-11039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa647 goat anti-mouse secondary antibody</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A-21236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20% paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscope Services</td>
			<td>RT15713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VectaShield</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>H-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperFrost Plus Slides</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>99-910-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12-553-454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na Phosphate Buffer monobasic</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S3139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na phosphate Buffer dibasic</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S3264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X 100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>X100-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fingernail polish</td>
			<td>Electron Microscope Services (EMS)</td>
			<td>72180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stereomicroscope</td>
			<td>Leica S6D with KL300 LED light source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9-well dish (spot plate)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89090-482</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nutator/rocker</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>22-363-152 or 88-861-041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35mm dish</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>32-103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>50-366-794</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipe</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>06-666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potential Fixation Buffers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTN Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.1M NaPhosphate, pH 7.2, 0.1% Triton-X-100, Typically make up 0.5 L of 0.1M NaPhosphate buffer and aliquote 50ml at a time as needed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PLP buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>2% paraformaldehyde, 0.01M NaI04, 0.075M Lysine, 0.037M NaPO4, pH 7.2, Dissolve 0.36 g lysine in 10 ml H2O + 7.5 ml 0.1 M NaH2PO4 pH 7.2 + 2.5 ml 0.1 M Na2HPO4 on ice. Immediately before use, mix 15 ml of this buffered lysine solution with 50 mg NaIO4 (sodium periodate) + 2ml of the 20% high grade paraformaldehyde (EMS) + 3ml H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEM buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.1M PIPES pH 7.0, 2mM MgS04, 1mM EGTA, This buffer can be conveniently made as a 2x stock and diluted with 8% paraformaldehyde (PFA) to give a final concentration of 4% PFA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fly Stocks available from Bloomington</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>elav (c155)-GAL4</td>
			<td></td>
			<td>BL458</td>
			<td>Pan-neuronal GAL4 driver</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>w*;;;OK107-GAL4</td>
			<td></td>
			<td>BL 854</td>
			<td>GAL4 driver for all mushroom body neurons (OK107-GAL4 insertion is on the 4th chromosome)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>y(1), w(67c23); c739-GAL4</td>
			<td></td>
			<td>BL 7362</td>
			<td>GAL4 driver for alpha and beta lobes (on 2nd chromosome)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>y(1), w(67c23); c739-GAL4, UAS-CD8-GFP</td>
			<td></td>
			<td>BL 64305</td>
			<td>GAL4 driver for alpha and beta lobes, also contains UAS-CD8-GFP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>w*; 201Y-GAL4</td>
			<td></td>
			<td>BL 4440</td>
			<td>GAL4 driver for primarily the gamma lobes of mushroom body (on 2nd chromosome)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>y(1), w(67c23); 201Y-GAL4, UAS-CD8-GFP</td>
			<td></td>
			<td>BL 64296</td>
			<td>GAL4 driver for mushroom body gamma lobes, also contains UAS-CD8-GFP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>w*, elav (c155)-GAL4, hsFLP; FRTG13, Tub&#62;Gal80/CyO</td>
			<td></td>
			<td>BL 5145</td>
			<td>MARCM stock, contains FRT site and GAL80 on 2nd chromosome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>w*, elav (c155)-GAL4, hsFLP, UAS-CD8-GFP</td>
			<td></td>
			<td>BL5146</td>
			<td>MARCM stock, contains hsFLP, pan-neuronal GAL4, and CD8-GFP on X chromosome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>y(1), w*, hsFLP, UAS-CD8-GFP;;FRT82B, Tub&#62;GAL80/TM3, Sb(1);OK107-GAL4</td>
			<td></td>
			<td>BL 44408</td>
			<td>MARCM stock for flipping 3rd chromosome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>y(1), w*, hsFLP, UAS-CD8-GFP;FRT40A, Tub&#62;GAL80;OK107-GAL4</td>
			<td></td>
			<td>BL44406</td>
			<td>MARCM stock for flipping 2nd chromosome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>w*, hsFLP, tub&#62;GAL80, FRT19A; UAS-CD8-GFP/CyO;;OK107-GAL4</td>
			<td></td>
			<td>BL 44407</td>
			<td>MARCM stock for flipping X chromosome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>y(1), w*; UAS-CD8-GFP/CyO</td>
			<td></td>
			<td>BL 5137</td>
			<td>GFP labels cell surface (CD8 is a transmembrane protein)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>y(1), w*; FRTG13, UAS-CD8-GFP</td>
			<td></td>
			<td>BL 5139</td>
			<td>MARCM stock, contains FRT site and CD8-GFP on 2nd chromosome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>y(1), w*, hsFLP, UAS-CD8-GFP; Pin(1)/CyO</td>
			<td></td>
			<td>BL 28832</td>
			<td>MARCM stock, contains hsFLP and CD8-GFP on X chromosome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>w*; FRTG13, Tub&#62;GAL80</td>
			<td></td>
			<td>BL 5140</td>
			<td>MARCM stock, contains FRT site and GAL80 on 2nd chromosome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>y(1), w*;; FRT82B, Tub&#62;GAL80</td>
			<td></td>
			<td>BL 5135</td>
			<td>MARCM stock, contains FRT site and GAL80 on 3rd chromosome</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dissection and immunofluorescent staining of mushroom body and photoreceptor neurons in adult drosophila melanogaster brains

Développement du système nerveux comporte une série séquentielle des événements qui se sont coordonnés par plusieurs voies de signalisation et de réseaux de régulation. Bon nombre des protéines impliqués dans ces voies sont conservés évolutionnaires entre les mammifères et les autres eucaryotes, comme la drosophile Drosophila melanogaster, suggérant que les principes d’organisation similaires existent au cours du développement de ces organismes. Ce qui est important, Drosophila a été largement utilisé pour identifier les mécanismes cellulaires et moléculaires régissant les processus qui sont nécessaires chez les mammifères, y compris la neurogenèse, différenciation, guidage axonal et synaptogenèse. Les mouches ont également été utilisés avec succès pour modéliser une variété de maladies neurologiques du développement humain. Nous décrivons ici un protocole pour la microdissection étape par étape, la fixation et la localisation par immunofluorescence des protéines dans le cerveau adulte de la drosophile . Ce protocole porte sur deux populations neuronales de l’exemple, les neurones corps aux champignons et photorécepteurs rétiniens et comprend les étapes facultatives pour tracer les neurones individuels du corps aux champignons par analyse de mosaïque avec une technique de marqueur de cellules répressible (MARCM). Les données exemple de cerveaux sauvage et mutantes apparaissent ainsi qu’une brève description d’un critère de notation pour les défauts de guidage axonal. Si ce protocole met en évidence deux anticorps bien établis pour étudier la morphologie des champignons corps et les neurones photorécepteurs, autres régions du cerveau drosophile et la localisation des protéines dans d’autres régions du cerveau peut aussi être étudié en utilisant ce protocole.

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Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Ce protocole décrit la dissection et immunostaining des adultes Drosophila melanogaster tissus du cerveau. Plus précisément, ce protocole met en évidence l’utilisation de Drosophila champignon corps et photorécepteur neurones comme des sous-ensembles neuronale exemple qui peuvent être utilisés avec précision afin de découvrir les principes généraux de nombreux aspects du développement neuronal.

Dissection et immunofluorescence souillant de champignon corps et photorécepteur de neurones dans le cerveau adulte Drosophila melanogaster

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

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Developmental Biology

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