Name: dissection and immunofluorescent staining of mushroom body and photoreceptor neurons in adult drosophila melanogaster brains
Uploaded: 2017-11-06T16:45:00
Duration: 10 min 13 s
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Wir möchten Changhui Pak und Alysia Vrailas Mortimer bedanken für den Unterricht zunächst SMK Gehirn Dissektion Technik. Wir danken auch Mitglieder des Ken Mobergs Lab-Gruppe, vor allem Chris Runden für das Manuskript kritisch zu lesen. Antikörper erkennen Fas2 (1-4) und Chaoptin (24B10) stammen aus der Entwicklungsbiologie Studien Hybridoma Bank. Antikörper-24B10 wurde auf die DSHB durch Seymour Benzer und Nansi Colley24,60,61eingezahlt, Antikörper 1 4 war, die DSHB von Corey Goodman 22,23,56hinterlegt. Fliegende-Aktien wurden von Bloomington Stock Center erhalten. Wir möchten auch danke dem Ohio Agricultural Research und Development Center (OARDC) MCIC Imaging Center für den Einsatz des konfokalen Mikroskops Gehirne in Abbildung 4A Image und B. SMK wird unterstützt durch einen Zuschuss von NICHD (1 R15 HD084241-01A1).

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessenkonflikte.

Die Dissektion und Visualisierung der oben beschriebene Methode kann in einer Vielzahl von Immunostaining verwendet werden und live imaging-Anwendungen. Wir haben eine allgemeine Immunostaining Protokoll beschrieben und haben deutlich gemacht, dass eine Art und Weise MARCM axonalen Morphologie der einzelnen Pilz Körper Nervenzellen visualisieren verwendet werden kann. Darüber hinaus diese allgemeine Verfahren können auch verwendet werden, für andere Hirnregionen in festen imaging oder frisch seziert Erwachsenen Gehirne48,65. Live Imaging können ein effizienteres Vorgehen bei der Analyse der Expressionsmuster von Enhancer fallen, Reporter-Gene oder mimischen Linien66, zum Beispiel. Um zu verhindern, dass erfassen Artefakte von Zelltod während der live Aufnahme der GLP in fixierten Gewebe, Gehirne sollten werden zerlegt in 1 x Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) oder HL3 Medien48, montiert auf Brücke Folien in 1 x PBS (oder HL3) und abgebildet in weniger als 15-20 min. Pflege auch achten so viel Luftröhre möglichst aus dem seziert Gehirn vor Bildgebung, zu entfernen, da es mit Visualisierung der GFP Fluoreszenz stören kann.
Während Färbung Bedingungen für die Beurteilung der Morphologie der Pilze Körper und Photorezeptor Neuronen relativ gut etablierte24,61,67, die Lokalisierung eines spezifischen Proteins des Interesses an dieser Zelle sind Typen erfordern umfangreiche Fehlerbehebung und Optimierung. Insbesondere sollte einige wichtige Schritte, einschließlich Antikörper Verdünnung, blockierende Puffer Komponente Konzentration und Fixierung, optimiert werden, um reproduzierbare und zuverlässige Ergebnisse zu generieren. Zunächst sollte die optimale Konzentration der primären Antikörper bestimmt werden. Obwohl im Handel erhältlichen Antikörper oft eine empfohlene Verdünnung haben (und wir oft erst beginnen durch den Einsatz dieser Konzentration), sind diese Werte auf Drosophila Gewebe selten empirisch ermittelt. Daher testen eine Reihe von primären Antikörper-Verdünnungen, der Bereich oberhalb und unterhalb des Herstellers ab Vorschlag oft spezifische Färbung führt. Während Primärantikörper Verdünnung kann erhebliche Auswirkungen auf die Färbung Genauigkeit und sollte genau bestimmt werden, die Zeit Gehirne im primären Antikörper enthaltenden ausgebrütet werden können Lösungen mit wenig Einfluss auf das Gesamtergebnis erheblich variieren. Zum Beispiel haben wir ähnliche Ergebnisse beobachtet, wenn Inkubation Gehirne mit den Fas2 Antikörper Primärantikörper für zwei, drei oder sogar vier Tage bei 4 ° c seziert Zwar wir mindestens zwei Nächte empfehlen, haben wir auch Gehirne in Primärantikörper Lösung für eine einzige Nacht inkubiert und reproduzierbare Färbung erhalten. Wichtiger ist, hilft die Begrenzung der Höhe der Zeit, die Gehirne in der sekundären Antikörper zu 3 h bei Raumtemperatur (oder eine Nacht bei 4 ° C) inkubiert werden Grenze unspezifische Bindung der Sekundärantikörper, Hirngewebe.
Zweitens kann es notwendig, zusätzliche "Sperrung" Reagenzien zu verwenden, um unerwünschte Hintergrundgeräusche Signal zu beseitigen sein. Erhöhung der Konzentration von NGS auf ~ 10 %, 1-10 % Bovine Serum Albumin (BSA) hinzufügen, die Sperrung und primäre/sekundäre Antikörper Lösungen oder Pre-Adsorption von primären Antikörper über Nacht bei 4 ° C mit Drosophila Embryos (siehe Optionen Referenz-68, Abschnitt 2.9, Schritt 3).
Während wir das obige Protokoll mit PTN als den vorgeschlagenen Puffer für alle Fixierung geschrieben haben, führen waschen, und Antikörper Inkubationsschritte, Gewebe Fixierung in anderen Puffer (z. B. PLP und PEM, aufgeführt in der Materialtabelle) tiefgreifende Unterschiede in Signalstärke. Zum Beispiel haben frühere Studien gezeigt, dass Cyclin E ist nicht nachweisbar im Larvenstadium imaginalen Scheiben, wenn Gewebe im traditionellen 4 % Paraformaldehyd in PBS verdünnt behoben werden, aber ist deutlich sichtbar, wenn Gewebe im PLP Puffer (Ken Moberg, persönliche behoben werden Kommunikation und Referenz-69). Neben Änderungen im Puffer Komponenten, Änderung der Zeit und Temperatur für Gewebe Fixierung auch erheblich immunofluorescent beeinträchtigen kann beflecken und kann bei Bedarf empirisch ermittelt werden. In der Regel Fixierzeit sollte lang genug sein, für ausreichende Vernetzung von Zellkomponenten ermöglichen und langfristige Erhaltung der gesamten zellulären Morphologie während begrenzt genug, um über Vernetzung und "vergraben" von Protein Epitope zu verhindern. Daher beim zunächst Färbung Bedingungen für einen neu erworbenen Primärantikörper optimieren wir in der Regel Fixierzeit ca. 20 min zu begrenzen und behebt oft Gewebe bei kälteren Temperaturen.
Mehrere Steuerelemente sollten in jedem Immunfluoreszenz-Experiment zu untersuchen, die Spezifität der primären und sekundären Antikörper sowie die Wirkung der transgene/genetische Herkunft auf den beobachteten Phänotyp aufgenommen werden. Um festzustellen, ob der primäre Antikörper speziell verwendet wird das Protein des Interesses erkennt, sollte Gewebe von den fliegen fehlt dieses Protein und/oder des Gewebes, die das Protein überexprimiert als Steuerelemente enthalten sein. Die Zugabe von überschüssige gereinigte Antigen Protein kann auch aufgenommen werden, um festzustellen, ob der primäre Antikörper andere Epitope im Gehirn Fliege erkennt. Schließlich stellt jeder Fluoreszenzsignal anwesend, als primären Antikörper entfallen das Niveau der unspezifischen Bindung durch die ausgewählten sekundäre Antikörper.
Mehrere wichtige Steuerelemente sollten auch aufgenommen werden, um den Beitrag der genetische Hintergrund oder das Vorhandensein von transgenen Färbung Intensität oder neuronale Morphologie zu beurteilen. Beispielsweise enthalten die fliegen in die MARCM Experiment in Abbildung 5 verwendet mehrere transgene (HsFLP, UAS-CD8-GFP, FRT82B, Wanne &#62; GAL80 und OK107-GAL4), von denen jeder für Auswirkungen auf die Morphologie der Pilze Körper getrennt analysiert werden sollte. Auf ein absolutes minimum, Pilz Körper Morphologie von fliegen sollten mit OK107-GAL4 und UAS-CD8-GFP analysiert werden. Es kann auch erforderlich sein, die Wirkung der Hitzeschock und Flp Rekombinase Produktion auf Pilz Karosserieentwicklung Dateientyp fliegt mit HsFLP und FRT82B. Obwohl MARCM erhebliche Einblick bieten, ob ein gegebenen Proteins autonom axonalen Führung steuert, kann die Anzahl der Kontrollen erforderlich, um genau diese Schlussfolgerung machen eine kleine Einschränkung dieser Technik sein. In weniger komplizierten Experimente gelten ähnliche Kontrollen auch. Zum Beispiel nehmen Sie ein Experiment, wo ist die GAL4/UAS -System in Kombination mit einer RNAi-Transgen Knockdown Ausdruck eines Proteins des Interesses an alle Neuronen verwendet wird. In diesem Experiment werden mindestens zwei transgene anwesend: eine Pfanne neuronalen GAL4-Treiber z. B. Ilav-GAL4 und UAS-RNAi -Transgen. Die Morphologie der Pilze Körper Neuronen im fliegen, enthält jeder der diese transgene allein sollte neben der Versuchsbedingung untersucht werden, wo fliegen beide transgene in der gleichen Fliege beherbergen.
Schließlich, um festzustellen, ob das Protein des Interesses in Pilz Körper Neuronen zum Ausdruck kommt ist es normalerweise notwendig, Co Fleck Gehirne mit Antikörpern gegen Fas2. Fluoreszierende Proteine wie z. B. GFP, RFP oder die Membran gebunden CD8-GFP können alternativ auch ausgedrückt werden, verwenden das GAL4/UAS -System und in Kombination mit Antikörpern, die das Protein des Interesses zu erkennen. Fas2 erkennt nur die fasciculated Axone, die die Pilz Körper α und β-Lappen zu bilden, seit die Verwendung von GAL4-driven, Membrane-springen CD8-GFP besonders nützlich für die Kennzeichnung von Pilz Körper Neuronen.
Mängel bei der axonalen Beratung sind oft nicht 100 % Penetranz und sogar Gehirne des gleichen Genotyps können gewisse Variabilität zeigen. Daher, wenn mutierten Allele für Mängel in Pilz oder Photorezeptor Pathfinding Analyse neu generiert werden, sollte eine Kombination aus verschiedenen Allelen und Ansätze genutzt werden. Die meisten Studien in der Literatur verschiedene Ansätze um zu untersuchen, ob ein Protein eine Zelle-autonome Rolle bei der Kontrolle der axonalen Anleitung verwenden: ich) Analyse der Pfadfindung Mängel bei homozygot null fliegen (vorzugsweise mit verschiedenen Null-Allele), Ii) Analyse der Pfadfindung Mängel an fliegen fehlt das Protein des Interesses nur in Neuronen (in der Regel über RNAi), Iii) MARCM Analyse der Pfadfindung Mängel und iv) Experimente, wo das Gen erneut zum Ausdruck in den Neuronen der homozygot Null ist, zu retten fliegt. Im Idealfall sollten mehrere Dutzend Köpfe pro Genotyp für Mängel in neuronale Morphologie analysiert werden.
Obwohl das Protokoll hier in erster Linie konzentriert sich auf immunofluorescent Lokalisierung von Proteinen innerhalb fixierte Gewebe beschrieben, werden mehrere zukünftige Anwendungen dieser Technik zum Bild live Hirngewebe entwickelt. Gehirn (in der Regel in Zellkulturmedien) seziert werden, kann sie dann kultiviert für mehrere Tage bei 25 ° c Diese ex Vivo Kultivierung Methoden entwickelt, um eine Vielzahl von biologischen Prozessen, wie z. B. Proteinaktivität zu untersuchen, das Axon Regeneration nach Verletzungen70,71, intrazelluläre fördert Signalisierung Dynamik72und neuronale Entwicklung73.

Zwar das Nervensystem Drosophila kleiner als die von Menschen und Nagern, stellt seine Komplexität ein kraftvoll, ansprechbar Modell zum besseren Verständnis seiner fest gefügten Pendants. In vielen Fällen kodieren das Genom der Wirbeltiere und fliegt sehr ähnliche Proteine, die die Mechanismen der Entwicklung des Nervensystems zu diktieren. In der Tat erforderlich viele der Gene, für die neuronale Entwicklung bei Wirbeltieren Orthologe in fliegen, einschließlich derjenigen Signalwege, dass Kontrolle Musterung, Neurogenese und axonalen Anleitung1,2,3 beteiligt haben ,4,5. Netrin ist beispielsweise ein Ligand für axonalen Beratung bei Säugetieren und D. Melanogaster6,7,8erforderlich. Während Netrin von embryonalen Küken Gehirn Gewebe6ursprünglich isoliert war, haben nachfolgende Studien gezeigt, dass Netrin spielt eine erhaltene Rolle während der Entwicklung des embryonalen zentrale Nervensystem (ZNS) in Drosophila8. Andere Studien haben genetische Bildschirme in der embryonalen Drosophila CNS zum konservierten Liganden und Rezeptoren für Pathfinding in Drosophila und Wirbeltieren9erforderlichen identifizieren.
Während die embryonale Fliege CNS weitgehend in der Vergangenheit verwendet worden ist, um Liganden, Rezeptoren und intrazellulären Signalproteine axonalen Anleitung8,9gefordert zu identifizieren, hat die jüngsten Arbeiten die Wege in denen viele der untersucht. Diese Proteine Steuern Pathfinding Entscheidungen auch in späteren Phasen der Entwicklung. Insbesondere hat Untersuchung von Pilz Körper (MB) und Netzhaut Photorezeptor Neuron Entwicklung (Abbildung 1) Einblick in die Mechanismen dieser Kontrolle Wegfindung, Synapse Bildung, Axon beschneiden, und verschiedene andere Aspekte der neuronalen zur Verfügung gestellt Entwicklung10,11,12,13,14,15,16,17. Photorezeptor Neuronen verbinden die Fliege Netzhaut Regionen des erwachsenen Gehirns genannt der Lamina und Medulla und sind entscheidend für die Weiterleitung von visuellen Informationen an das Gehirn (rezensiert von18,19), während der Pilz Körper Neuronen sind zentral gelegen im Gehirn Fliege und sind erforderlich für lernen und Gedächtnis20,21. Photorezeptor Neuronen und die intrinsische Neuronen die Pilzkörper, Kenyon Zellen, genannt nutzen evolutionär konservierte diffusiblem und Kontakt-abhängige axonalen Anleitung Mechanismen um ihre postsynaptischen Ziele zu finden. Abgesehen davon, dass bei Erwachsenen fliegen, können Photorezeptor und MB Neuronen werden auch direkt in die Larven und Puppen mit Antikörpern oder Reporter Gene22,23,24,25visualisiert. Die Fähigkeit, leicht zu diesen beiden Gruppen von Neuronen zu unterschiedlichen Entwicklungsstörungen Zeitpunkten visualisieren hat ihre Verwendung als hervorragende Modelle für viele Aspekte der neuronalen Entwicklung gefördert.
Neben dem Einsatz als Modell um zu verstehen, die Mechanismen der normalen Nervensystem Entwicklung, haben neuere Studien gezeigt, dass fliegen auch dazu als genaue Modelle für eine Vielzahl von menschlichen Krankheiten dienen können, einschließlich Fragile X Syndrom (FXS)26 , Geistige Behinderung (ID)27,28,29,30,31, und andere32. Beispielsweise um die molekulare Funktion des ZC3H14 zu untersuchen, ein Gen, das vor kurzem verbunden mit menschlicher geistiger Behinderung haben wir fliegen Modellcharakter für die ID mit einer null Allel der Fliege ZC3H14 Ortholog, genannt Nab230. Fliegen fehlt Nab2 haben schweren Gedächtnisstörungen und poly(A) Tails erweitert, Rekapitulation was wird beobachtet bei menschlichen Patienten oder Patienten abgeleitet Zelle Linien33,34. Wichtig ist, anzeigen fliegen fehlt Nab2 auch schwere Gehirn Morphologie Mängel in ihren Erwachsenen Pilzkörper34, ähnlich wie was beobachtet wird, in denen das FXS-Syndrom gen, 135fliegen. So können fliegen dienen als ein wichtiger Modellorganismus, normale Gehirnentwicklung und Krankheiten, die es stören zu studieren.
Schließlich machen die Zugänglichkeit von Hochdurchsatz-Methoden, Verhalten, kombiniert mit der Vielzahl der verfügbaren genetischen Tools überwachen Drosophila Modellorganismus der Wahl für die Ermittlung der Hirnregionen, die komplexe Verhaltensweisen, wie z. B. Steuern lernen und Gedächtnis, Schlaf, Balz, Durst und andere36,37,38,39. Ein besonders nützliches Werkzeug, das in der Mitte eine Fliege Genetiker "Toolbox" ist ist das GAL4/UAS-System (Abbildung 2). Dieses System40,41 verwendet Gewebe Konkretisierung der Gal4 transcriptional Aktivator, um den Ausdruck der Gene oder transgene flussabwärts von einer vorgelagerten Aktivierung Sequenz (UAS) zu erhöhen. Änderungen dieses Systems konnten Forscher, z. B. genau steuern, die Erregbarkeit der spezifische Neuronen42,43, Overexpress oder Knock-down spezifischen Genen Interesse44, 45, Echtzeit-Kalzium Dynamik in Vivo46zu analysieren und express Reporter Gene neuronale Linien41markieren. Die Kombination aus der GAL4/UAS-System mit mitotische Rekombination, die auch für die Erstellung der Mosaik-Analyse mit einem tragen Zelle Marker (MARCM) System12,47erlaubt. MARCM ist beträchtlich bei der Rückverfolgung der einzelnen Nervenzelle benutzt worden, um zellulären Signalisierung für axonalen Führung12,47benötigten Komponenten zu identifizieren. Obwohl diese und andere Techniken etliche wertvolle Erkenntnisse über die zellulären Mechanismen erforderlich für die Funktion des Nervensystems zur Verfügung gestellt haben, erfordern die meisten, dass Drosophila Gehirn zuerst zerlegt werden; schonende Entfernung des Gehirns ist erforderlich, um korrekte Gehirn Morphologie und Verbindung Muster zwischen Gehirnregionen zu behalten. Das folgende Protokoll verwendet Pilz Körper und Photorezeptor Neuronen alsBeispiel neuronalen Populationen als es führt Sie durch die Zerlegung und immunofluorescent Färbung der Erwachsenen Drosophila Gehirne.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Microdissection forceps/tweezers</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>505-NM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard dishes</td>
			<td>Living Systems Instrumentation</td>
			<td>DD-50-S-BLK</td>
			<td>Available from amazon.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fas2 Antibody</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>1D4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chaoptin Antibody</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>24B10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP Antibody</td>
			<td>Aves Lab</td>
			<td>GFP-1010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa488 goat anti-mouse secondary antibody</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A-11001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa488 goat anti-chicken secondary antibody</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A-11039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa647 goat anti-mouse secondary antibody</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A-21236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20% paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscope Services</td>
			<td>RT15713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VectaShield</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>H-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperFrost Plus Slides</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>99-910-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12-553-454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na Phosphate Buffer monobasic</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S3139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na phosphate Buffer dibasic</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S3264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X 100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>X100-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fingernail polish</td>
			<td>Electron Microscope Services (EMS)</td>
			<td>72180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stereomicroscope</td>
			<td>Leica S6D with KL300 LED light source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9-well dish (spot plate)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89090-482</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nutator/rocker</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>22-363-152 or 88-861-041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35mm dish</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>32-103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>50-366-794</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipe</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>06-666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potential Fixation Buffers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTN Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.1M NaPhosphate, pH 7.2, 0.1% Triton-X-100, Typically make up 0.5 L of 0.1M NaPhosphate buffer and aliquote 50ml at a time as needed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PLP buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>2% paraformaldehyde, 0.01M NaI04, 0.075M Lysine, 0.037M NaPO4, pH 7.2, Dissolve 0.36 g lysine in 10 ml H2O + 7.5 ml 0.1 M NaH2PO4 pH 7.2 + 2.5 ml 0.1 M Na2HPO4 on ice. Immediately before use, mix 15 ml of this buffered lysine solution with 50 mg NaIO4 (sodium periodate) + 2ml of the 20% high grade paraformaldehyde (EMS) + 3ml H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEM buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.1M PIPES pH 7.0, 2mM MgS04, 1mM EGTA, This buffer can be conveniently made as a 2x stock and diluted with 8% paraformaldehyde (PFA) to give a final concentration of 4% PFA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fly Stocks available from Bloomington</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>elav (c155)-GAL4</td>
			<td></td>
			<td>BL458</td>
			<td>Pan-neuronal GAL4 driver</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>w*;;;OK107-GAL4</td>
			<td></td>
			<td>BL 854</td>
			<td>GAL4 driver for all mushroom body neurons (OK107-GAL4 insertion is on the 4th chromosome)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>y(1), w(67c23); c739-GAL4</td>
			<td></td>
			<td>BL 7362</td>
			<td>GAL4 driver for alpha and beta lobes (on 2nd chromosome)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>y(1), w(67c23); c739-GAL4, UAS-CD8-GFP</td>
			<td></td>
			<td>BL 64305</td>
			<td>GAL4 driver for alpha and beta lobes, also contains UAS-CD8-GFP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>w*; 201Y-GAL4</td>
			<td></td>
			<td>BL 4440</td>
			<td>GAL4 driver for primarily the gamma lobes of mushroom body (on 2nd chromosome)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>y(1), w(67c23); 201Y-GAL4, UAS-CD8-GFP</td>
			<td></td>
			<td>BL 64296</td>
			<td>GAL4 driver for mushroom body gamma lobes, also contains UAS-CD8-GFP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>w*, elav (c155)-GAL4, hsFLP; FRTG13, Tub&#62;Gal80/CyO</td>
			<td></td>
			<td>BL 5145</td>
			<td>MARCM stock, contains FRT site and GAL80 on 2nd chromosome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>w*, elav (c155)-GAL4, hsFLP, UAS-CD8-GFP</td>
			<td></td>
			<td>BL5146</td>
			<td>MARCM stock, contains hsFLP, pan-neuronal GAL4, and CD8-GFP on X chromosome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>y(1), w*, hsFLP, UAS-CD8-GFP;;FRT82B, Tub&#62;GAL80/TM3, Sb(1);OK107-GAL4</td>
			<td></td>
			<td>BL 44408</td>
			<td>MARCM stock for flipping 3rd chromosome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>y(1), w*, hsFLP, UAS-CD8-GFP;FRT40A, Tub&#62;GAL80;OK107-GAL4</td>
			<td></td>
			<td>BL44406</td>
			<td>MARCM stock for flipping 2nd chromosome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>w*, hsFLP, tub&#62;GAL80, FRT19A; UAS-CD8-GFP/CyO;;OK107-GAL4</td>
			<td></td>
			<td>BL 44407</td>
			<td>MARCM stock for flipping X chromosome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>y(1), w*; UAS-CD8-GFP/CyO</td>
			<td></td>
			<td>BL 5137</td>
			<td>GFP labels cell surface (CD8 is a transmembrane protein)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>y(1), w*; FRTG13, UAS-CD8-GFP</td>
			<td></td>
			<td>BL 5139</td>
			<td>MARCM stock, contains FRT site and CD8-GFP on 2nd chromosome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>y(1), w*, hsFLP, UAS-CD8-GFP; Pin(1)/CyO</td>
			<td></td>
			<td>BL 28832</td>
			<td>MARCM stock, contains hsFLP and CD8-GFP on X chromosome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>w*; FRTG13, Tub&#62;GAL80</td>
			<td></td>
			<td>BL 5140</td>
			<td>MARCM stock, contains FRT site and GAL80 on 2nd chromosome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>y(1), w*;; FRT82B, Tub&#62;GAL80</td>
			<td></td>
			<td>BL 5135</td>
			<td>MARCM stock, contains FRT site and GAL80 on 3rd chromosome</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dissection and immunofluorescent staining of mushroom body and photoreceptor neurons in adult drosophila melanogaster brains

Nervensystem-Entwicklung beinhaltet eine sequenzielle Serie von Ereignissen, die durch mehrere Signalwege und Regulationsnetzwerke koordiniert werden. Viele von den Proteinen, die in diesen Bahnen sind evolutionär konserviert zwischen Säugetieren und anderen Eukaryoten, wie der Fruchtfliege Drosophila Melanogaster, was darauf hindeutet, dass ähnliche organisierende Grundregeln bei der Entwicklung dieser vorhanden Organismen. Wichtig ist, wurde Drosophila ausgiebig zur zelluläre und molekulare Mechanismen, die Regulierung der Prozesse, die erforderlich sind, bei Säugetieren einschließlich Neurogenese, Differenzierung, axonalen Beratung und Synaptogenese zu identifizieren. Fliegen haben auch erfolgreich eingesetzt, um eine Vielzahl von menschlichen Neurodevelopmental Krankheiten zu modellieren. Hier beschreiben wir ein Protokoll für die schrittweise Mikrodissektion, Fixierung und immunofluorescent Lokalisierung von Proteinen im erwachsenen Gehirn Drosophila . Dieses Protokoll konzentriert sich auf zwei Beispiel neuronalen Populationen, Pilz Körper Neuronen und retinalen Photorezeptoren und beinhaltet optionale Schritte zu einzelnen Pilz Körper Neuronen mit Mosaik-Analyse mit einer tragen Zelle Marker (MARCM) Technik zu verfolgen. Beispieldaten aus Wildtyp und Mutanten Gehirne sind mit einer kurzen Beschreibung der Bewertungskriterien für axonalen Anleitung Mängel gezeigt. Während dieses Protokoll zwei etablierte Antikörper zeigt für die Untersuchung der Morphologie der Pilze Körper und Photorezeptor Neuronen, andere Hirnregionen Drosophila und die Lokalisierung der Proteine in anderen Hirnregionen können auch mit Hilfe dieses Protokolls untersucht.

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Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dieses Protokoll beschreibt die Dissektion und Immunostaining von Erwachsenen Drosophila Melanogaster Gewebe des Gehirns. Insbesondere unterstreicht dieses Protokoll die Verwendung von Drosophila Pilz Körper und Photorezeptor Neuronen als Beispiel neuronale Teilmengen, die genau verwendet werden, um die allgemeinen Grundsätze für viele Aspekte der neuronalen Entwicklung aufzudecken.

Dissektion, Immunofluorescent Färbung der Pilz Körper und Photorezeptor Neuronen im Gehirn Erwachsener Taufliege melanogaster

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

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