Name: dissection and immunofluorescent staining of mushroom body and photoreceptor neurons in adult drosophila melanogaster brains
Uploaded: 2017-11-06T16:45:00
Duration: 10 min 13 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains at JoVE.com

ברצוננו להודות Changhui פאק Alysia Vrailas מורטימר להוראת בתחילה SMK טכניקת ניתוח מוח. אנו מודים גם חברי קבוצת המעבדה של קן Moberg, במיוחד כריס סיבובים, עבור אנושות לקרוא את כתב היד. נוגדנים זיהוי Fas2 (1D 4), chaoptin (24B10) התקבלו מהבנק ליפידים של מחקרים התפתחותיים. נוגדנים 24B10 ועליהן כדי DSHB סימור Benzer ו Nansi Colley24,60,61, נוגדן 1D 4 נמצא כדי DSHB על קורי גודמן 22,23,56. מניות לטוס התקבלו ממרכז מניות בבלומינגטון. . גם אני רוצה להודות את המחקר החקלאי אוהיו ומרכז פיתוח מרכז (OARDC) MCIC הדמיה לשימוש של מיקרוסקופ קונפוקלי לשיקוף המוחות בכל איור 4A וב' SMK נתמך על ידי מענק של NICHD (1 R15 HD084241-01A1).

המחברים מצהירים כי יש להם אינטרסים כלכליים אין מתחרים.

דיסקציה והדמיה השיטה המתוארת לעיל ניתן להשתמש במגוון רחב של immunostaining, גרה יישומי הדמיה. אנו המחולקות פרוטוקול immunostaining כללי, הדגישו דרך אחת שבה MARCM יכול לשמש כדי להמחיש עצב מורפולוגיה של נוירונים בודדים הגוף פטריות. בנוסף, נהלים כלליים אלה יכול לשמש גם עבור הדמיה אחרים אזורים במוח בקבועה או מבוגר טרי ביתור המוח48,65. הדמיה חיה עשוי לספק גישה יעילה יותר בעת ניתוח דפוסי ביטוי של מלכודות משפר, כתב גנים או לחקות קווים66, לדוגמה. כדי למנוע לכידת ממצאים מוות של תאים במהלך הדמיה חיה של GFP ברקמת מבולבל, המוח צריך להיות גזור 1 x מדיה פוספט Buffered מלוחים (PBS) או HL348רכוב על גשר שקופיות 1 x PBS (או HL3), עם תמונה של פחות מ 15-20 דקות טיפול צריך גם להתייחס כדי להסיר את קנה הנשימה רב ככל האפשר של המוח גזור לפני הדמיה, מאז זה יכול להפריע ויזואליזציה של זריחה GFP.
ואילו תנאים מכתימים להערכת המורפולוגיה של נוירונים הגוף, קולט אור פטריות61,יחסית ומבוססת24,67, הלוקליזציה של חלבון ספציפי עניין באלה תא סוגי עשויים לדרוש פתרון מקיף ואופטימיזציה. בפרט, צריך להיות מוטבת מספר שלבים קריטיים, כולל דילול נוגדן, מאגר רכיב ריכוז חסימה של יציבות, כדי להפיק את התוצאות ביותר לשחזור ואמין. ראשית, צריך להיקבע ריכוז אופטימלי של נוגדן ראשוני. למרות נוגדנים זמינים מסחרית יש לעתים קרובות לדילול המוצע (אנחנו לעיתים קרובות בתחילה להפעיל באמצעות הריכוז הזה), ערכים אלה רחוקות נקבעים מדעית על רקמות דרוזופילה . לכן, בדיקה של סדרת דילולים נוגדן ראשוני כי טווח מעל ומתחת החל הצעה היצרן לעתים קרובות התוצאות מכתים יותר ספציפי. בעוד נוגדן ראשוני דילול יכולה להיות השפעה משמעותית על צביעת דיוק בדיוק ייקבע, שכל הזמן מודגרת ב נוגדן ראשוני המכיל פתרונות יכול להשתנות במידה ניכרת עם השפעה קטנה על התוצאה הכוללת. לדוגמה, הבחנו תוצאות דומות כאשר המקננת גזור מוחות עם הנוגדן העיקרי של נוגדן Fas2. בשביל שניים, שלושה, או אפילו ארבעה ימים ב- 4 מעלות צלזיוס. אמנם אנו ממליצים לפחות שני לילות, יש גם מודגרות המוח בפתרון נוגדן ראשוני לילה יחיד ואנו שהושג מכתים לשחזור. חשוב, להגביל את כמות הזמן המוח מודגרת ב הנוגדן משני ל-3 שעות בטמפרטורת החדר (או לילה אחד ב 4 ° C) מסייעת מגבלת איגוד שאינם ספציפיים של נוגדנים משניים רקמת המוח.
שנית, ייתכן צורך להשתמש נוספים ריאגנטים "חסימה" לחסל את האות הרקע הבלתי רצויים. האפשרויות כוללות הגדלת ריכוז המיתרים ~ 10%, הוספת 1-10% שור אלבומין (BSA) חסימה, ראשי/משני פתרונות נוגדן או טרום ספיחה של נוגדנים העיקרי בין לילה ב 4 ° C עם עוברי דרוזופילה (ראה התייחסות68, סעיף 2.9, שלב 3).
בזמן שכתבנו בפרוטוקול לעיל באמצעות ניידת כמו המאגר המוצע עבור כל קיבעון, לשטוף, נוגדן הדגירה צעדים, קיבוע הרקמה במאגרי אחרים (כגון פיפ ו- PEM, נמצאת טבלת חומרים) עלול לגרום עמוקה הבדלים עוצמת אות. לדוגמה, מחקרים קודמים הדגימו כי Cyclin E הוא לא ניתן לזיהוי בשנת דיסקים דמותי זחל כאשר רקמות המתוקנים ב- paraformaldehyde 4% מסורתיים מדולל ב- PBS, אבל הוא נראה בבירור כאשר רקמות קבועים במאגר פיפ (Moberg קן, אישי תקשורת, ו הפניה69). בנוסף שינויים במאגר רכיבים, משנים את זמן וטמפרטורה עבור קיבוע הרקמה יכול גם להשפיע באופן משמעותי על immunofluorescent מכתים, יכול להיקבע מדעית במידת הצורך. בדרך כלל, קיבוע זמן צריך להיות ארוך מספיק כדי לאפשר crosslinking מספיקות של רכיבי הסלולר, תחזוקה לטווח הארוך של מורפולוגיה הסלולר בסך הכל בעת היותו מוגבל מספיק כדי למנוע נגמר-crosslinking "לקבור" של חלבון epitopes. לכן, כאשר בתחילה מיטוב מכתימים תנאים נוגדן ראשי החדשים שנרכשו, אנו בדרך כלל להגביל את זמן קיבעון כ 20 דקות, לעתים קרובות יהיה לתקן את הרקמות בטמפרטורה קרירה.
מספר פקדים צריכים להיכלל בכל ניסוי immunofluorescence לחקור יחודיות של נוגדנים ראשיים ומשניים, כמו גם את השפעת הרקע הגנטי/transgenes על פנוטיפ שנצפה. לבירור אם הנוגדן העיקרי בשימוש במיוחד מזהה את החלבון עניין, רקמות מהזבובים חסר זה חלבון ו/או רקמות overexpressing החלבון צריך להיות כלול כפקדים. התוספת של אנטיגן מטוהרים עודף חלבון יכולים להיכלל גם כדי לקבוע אם הנוגדן ראשי מזהה אחרים epitopes במוח לעוף. לבסוף, כל אות ניאון נוכח כאשר נוגדנים העיקרי מושמטים מייצג הרמה של איגוד לא ספציפית על ידי הנוגדנים משני שנבחרו.
יש גם לכלול מספר פקדים חשוב להעריך את התרומה של הרקע הגנטי או הנוכחות של transgenes עוצמת מכתימים או מורפולוגיה עצביים. לדוגמה, הזבובים בשימוש הניסוי MARCM באיור 5 להכיל מספר transgenes (hsFLP, UAS-CD8-GFP, FRT82B, האמבטיה &#62; GAL80, OK107-GAL4), שכל אחד מהם צריך להיות מנותח בנפרד על ההשפעות על הגוף פטריות מורפולוגיה. ב מורפולוגיה מאוד מינימלי, פטריות גוף של הזבובים המכיל OK107-GAL4 והן UAS-CD8-GFP צריך להיות מנותח. זה יכול להיות גם צורך להעריך את ההשפעה של הלם חום ומפליגה Flp הפקה recombinase על פיתוח גוף פטריות על-ידי ניתוח המכילים הן hsFLP והן FRT82B. למרות MARCM יכול לספק תובנה משמעותית אם חלבון נתון שולט באופן עצמאי הדרכה עצב, מספר פקדים נדרש לבצע במדויק מסקנה זו יכול להיות מגבלה מינור של טכניקה זו. בניסויים פחות מסובך, פקדים דומים חלים גם. לדוגמה, קח ניסוי שבו מערכת GAL4/UAS משמש בשילוב עם transgene RNAi לביטוי תמונות ציפורים של חלבון של עניין כל הנוירונים. בניסוי זה, לפחות שני transgenes להיות נוכחים: נהג GAL4 פאן עצבית, כגון elav-GAL4, את transgene UAS-RNAi . המורפולוגיה של הגוף פטריות נוירונים בזבובים המכילים כל אחד מהם את transgenes האלה לבד צריך להיחקר בנוסף התנאי ניסיוני איפה זבובים הנמל בשני transgenes בתוך הזבוב אותו.
לבסוף, כדי לקבוע אם החלבון עניין מתבטאת נוירונים הגוף פטריות יש בדרך כלל צורך המוח הכתם שיתוף עם נוגדנים Fas2. לחלופין, פלורסנט חלבונים כמו GFP, RFP, או הקרום מאוגדים CD8-GFP יכול להתבטא גם באמצעות מערכת GAL4/UAS , בשילוב עם נוגדנים זיהוי החלבון עניין. Fas2 מזהה רק fasciculated האקסונים המהווים האונות α וβ הגוף פטריות, השימוש של CD8-GFP, מונחי-GAL4 ממברנה מכורך מאז שימושי במיוחד עבור סימון הגוף פטריות נוירונים.
פגמים הדרכה עצב לעתים קרובות לא 100% penetrant, אפילו המוח גנוטיפ באותה עשויים להראות כמה השתנות. לכן, כאשר ניתוח החדש שנוצר אללים mutant פגמים הגוף פטריות או קולט אור pathfinding, שילוב של אללים שונים וגישות צריך להיות מנוצל. רוב המחקרים בספרות להשתמש מספר גישות שונות כדי לחקור אם חלבון ממלאת תפקיד התא-אוטונומי שליטה הדרכה עצב: אני) ניתוח של pathfinding פגמים homozygous זבובים null (רצוי באמצעות nu שוניםll אללים), ii) ניתוח של pathfinding פגמים זבובים חסר החלבון עניין רק בנוירונים (בדרך כלל באמצעות RNAi), השלישי) ניתוח MARCM של פגמים pathfinding, ו- iv) להציל את הניסויים איפה הגן מחדש מתבטאות הנוירונים של homozygous null זבובים. באופן אידיאלי, כמה עשרות המוח לכל גנוטיפ צריך להיות מנותח על פגמים מורפולוגיה עצביים.
למרות הפרוטוקול המתוארים כאן מתמקדת בעיקר על לוקליזציה immunofluorescent של חלבונים בתוך רקמת קבועה, מספר יישומים עתידיים של טכניקה זו מפותחים לרקמות מוח חי תמונה. ברגע שכל הם גזור (בדרך כלל בתקשורת התרבות התא), ואז ניתן בתרבית במשך מספר ימים ב 25 º C. השיטות שמחוץ culturing שפותחו במטרה לחקור מגוון רחב של תהליכים ביולוגיים, כגון פעילות החלבון לקידום התחדשות האקסון בעקבות פציעה70,71, תאיים דינמיקה איתות72, ההתפתחות העצבית73.

מערכת העצבים דרוזופילה אמנם קטן יותר מזה של בני אדם, מכרסמים, המורכבות שלה מספק מודל חזק, נגיש כדי להבין טוב יותר את עמיתיהם חוליות. במקרים רבים, הגנום של חולייתנים וזבובים לקודד חלבונים דומים מאוד המכתיבים את מנגנוני התפתחות מערכת העצבים. למעשה, רבים של הגנים הדרושים להתפתחות העצבית גולגולת יש orthologs בזבובים, כולל אלה מעורבים איתות המסלולים את השליטה המתבנת, נוירוג'נסיס ו הדרכה עצב1,2,3 4, ,5. לדוגמה, netrin היא ליגנד הנדרש להדרכה עצב יונקים ו melanogaster ד6,7,8. בעוד netrin הופרדה במקור רקמת המוח צ'יק עובריים6, מחקרים מאוחרים יותר גילו ש-netrin הזה משחק תפקיד שנשמרת במהלך הפיתוח של מערכת העצבים המרכזית עובריים (CNS) דרוזופילה8. מחקרים אחרים השתמשו מסכי גנטית עובריים דרוזופילה CNS כדי לזהות קולטנים הדרושים עבור pathfinding גם דרוזופילה וגם בעלי חוליות9של ליגנדים שנשמרת.
בעוד הזבוב עובריים CNS שימש בהרחבה בעבר כדי לזהות ליגנדים קולטנים, חלבוני איתות תאיים הדרושים עבור הדרכה עצב8,9, עבודה האחרונות חקרה את הדרכים, אשר של חלבונים אלה גם לשלוט pathfinding החלטות במהלך בשלבים מאוחרים יותר של התפתחות. באופן ספציפי, חקירה של הגוף פטריות (MB) ופיתוח נוירון קולט אור ברשתית (איור 1) סיפקה תובנה המנגנון הזה pathfinding שליטה, היווצרות סינפסה, גיזום האקסון, מספר היבטים אחרים של עצביים פיתוח10,11,12,13,14,15,16,17. קולט אור נוירונים להתחבר הרשתית לעוף לאזורים במוח למבוגרים שנקרא הנדן, לשד הם קריטיים עבור מסירת מידע חזותי למוח (נבדקה על ידי18,19), בעוד הגוף פטריות הנוירונים הם מרכזי ממוקם במוח לעוף, נדרשים עבור20,של למידה וזיכרון -21. נוירונים קולט אור והן את הנוירונים מהותי של הגופים פטריות, המכונים תאים קניון, לנצל מנגנוני שנשמרת אבולוציונית diffusible תלויי-הקשר עצב והדרכה כדי למצוא את המטרות הפוסט-סינפטית. בנוסף להיותו גלוי הזבוב הבוגר, קולט אור, נוירונים MB גם להיות ישירות visualized הזחלים, גלמי עם נוגדנים או כתב גנים22,23,24,25. היכולת בקלות לדמיין אלו שתי קבוצות של נוירונים בנקודות זמן שונות התפתחותית קידם את השימוש בהם כמו דגמים מעולים עבור היבטים רבים של ההתפתחות העצבית.
בנוסף נעשה שימוש כמודל להבין את המנגנונים של התפתחות מערכת העצבים נורמלי, מחקרים שנעשו לאחרונה הראו כי זבובים יכול לשמש גם מודלים מדויק של מגוון רחב של מחלות האדם, לרבות שביר X תסמונת (FXS)26 , נכות אינטלקטואלית (ID)27,28,29,30,31, ואחרים32. לדוגמה, כדי ללמוד את הפונקציה מולקולרית של ZC3H14, גן לאחרונה לקשר אנושי מוגבלות שכלית, יצרנו מודל לעוף של מזהה משתמש של אלל null של הזבוב ZC3H14 ortholog, שנקרא Nab230. זבובים חסר Nab2 יש ליקויי הזיכרון חמורה, מורחב poly(A) זנבות, recapitulating מה נצפית בחולים אנושיים או החולה נגזר תא קווים33,34. חשוב לציין, זבובים חסר Nab2 גם להציג מוחית חמורה מורפולוגיה פגמים שלהם גופות פטריות למבוגרים34, הדומה תצפית בזבובים חסר הגן תסמונת FXS, FMR135. לפיכך, זבובים יכול לשמש אורגניזם מודל חשוב ללמוד גם התפתחות המוח נורמלי וגם מחלות לשבש את זה.
לבסוף, הנגישות של תפוקה גבוהה שיטות לעקוב אחר התנהגות, בשילוב עם המערך העצום של כלים גנטיים זמין, להפוך דרוזופילה אורגניזם מודל של בחירה עבור זיהוי האזורים במוח השולטים התנהגויות מורכבות, כגון למידה, זיכרון, שינה, חיזור, הצמא ואחרים36,-37,-38,-39. כלי שימושי במיוחד נמצא במרכז של גנטיקאי לעוף "ארגז הכלים" היא מערכת GAL4/UAS (איור 2). זו מערכת40,41 משתמש ביטוי ספציפי רקמות activator תעתיק Gal4 כדי להגדיל את הביטוי של גנים או transgenes במורד הזרם של במעלה הפעלת רצף (UAS). שינויים של מערכת זו מאפשרת לחוקרים, לדוגמה, הבקרה בדיוק את דעתנית של נוירונים ספציפיים42,43, overexpress או דפיקה למטה גנים ספציפיים של עניין44, 45, לנתח את הדינמיקה ויווסידן בזמן אמת46ו אקספרס גנים כתב לסימון שושלות עצביים41. השילוב של מערכת GAL4/UAS עם רקומבינציה mitotic אפשרו גם את היצירה של הניתוח פסיפס עם12,מערכת סמן תא Repressible (MARCM)47. MARCM כבר בשימוש נרחב נוירון בודד העקיבה כדי לזהות את מרכיבי התא איתות הדרושים עבור הדרכה עצב12,47. למרות אלה וטכניקות אחרות סיפק מספר תובנות על המנגנונים הסלולר הנדרשות לתפקוד מערכת העצבים, דורשות המוח דרוזופילה קודם להיות שפרופסור; הסרת זהיר של המוח הוא נדרש לשמור תבניות מורפולוגיה וחיבור מוח הנכון בין אזורי המוח. להלן כללי התנהגות משתמש נוירונים הגוף, קולט אור פטריות כמודוגמה אוכלוסיות עצביים כמו זה מנחה אותך דרך הקרע, המוח דרוזופילה immunofluorescent מכתים של מבוגר.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Microdissection forceps/tweezers</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>505-NM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard dishes</td>
			<td>Living Systems Instrumentation</td>
			<td>DD-50-S-BLK</td>
			<td>Available from amazon.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fas2 Antibody</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>1D4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chaoptin Antibody</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>24B10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP Antibody</td>
			<td>Aves Lab</td>
			<td>GFP-1010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa488 goat anti-mouse secondary antibody</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A-11001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa488 goat anti-chicken secondary antibody</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A-11039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa647 goat anti-mouse secondary antibody</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A-21236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20% paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscope Services</td>
			<td>RT15713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VectaShield</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>H-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperFrost Plus Slides</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>99-910-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12-553-454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na Phosphate Buffer monobasic</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S3139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na phosphate Buffer dibasic</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S3264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X 100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>X100-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fingernail polish</td>
			<td>Electron Microscope Services (EMS)</td>
			<td>72180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stereomicroscope</td>
			<td>Leica S6D with KL300 LED light source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9-well dish (spot plate)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89090-482</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nutator/rocker</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>22-363-152 or 88-861-041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35mm dish</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>32-103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>50-366-794</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipe</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>06-666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potential Fixation Buffers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTN Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.1M NaPhosphate, pH 7.2, 0.1% Triton-X-100, Typically make up 0.5 L of 0.1M NaPhosphate buffer and aliquote 50ml at a time as needed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PLP buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>2% paraformaldehyde, 0.01M NaI04, 0.075M Lysine, 0.037M NaPO4, pH 7.2, Dissolve 0.36 g lysine in 10 ml H2O + 7.5 ml 0.1 M NaH2PO4 pH 7.2 + 2.5 ml 0.1 M Na2HPO4 on ice. Immediately before use, mix 15 ml of this buffered lysine solution with 50 mg NaIO4 (sodium periodate) + 2ml of the 20% high grade paraformaldehyde (EMS) + 3ml H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEM buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.1M PIPES pH 7.0, 2mM MgS04, 1mM EGTA, This buffer can be conveniently made as a 2x stock and diluted with 8% paraformaldehyde (PFA) to give a final concentration of 4% PFA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fly Stocks available from Bloomington</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>elav (c155)-GAL4</td>
			<td></td>
			<td>BL458</td>
			<td>Pan-neuronal GAL4 driver</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>w*;;;OK107-GAL4</td>
			<td></td>
			<td>BL 854</td>
			<td>GAL4 driver for all mushroom body neurons (OK107-GAL4 insertion is on the 4th chromosome)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>y(1), w(67c23); c739-GAL4</td>
			<td></td>
			<td>BL 7362</td>
			<td>GAL4 driver for alpha and beta lobes (on 2nd chromosome)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>y(1), w(67c23); c739-GAL4, UAS-CD8-GFP</td>
			<td></td>
			<td>BL 64305</td>
			<td>GAL4 driver for alpha and beta lobes, also contains UAS-CD8-GFP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>w*; 201Y-GAL4</td>
			<td></td>
			<td>BL 4440</td>
			<td>GAL4 driver for primarily the gamma lobes of mushroom body (on 2nd chromosome)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>y(1), w(67c23); 201Y-GAL4, UAS-CD8-GFP</td>
			<td></td>
			<td>BL 64296</td>
			<td>GAL4 driver for mushroom body gamma lobes, also contains UAS-CD8-GFP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>w*, elav (c155)-GAL4, hsFLP; FRTG13, Tub&#62;Gal80/CyO</td>
			<td></td>
			<td>BL 5145</td>
			<td>MARCM stock, contains FRT site and GAL80 on 2nd chromosome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>w*, elav (c155)-GAL4, hsFLP, UAS-CD8-GFP</td>
			<td></td>
			<td>BL5146</td>
			<td>MARCM stock, contains hsFLP, pan-neuronal GAL4, and CD8-GFP on X chromosome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>y(1), w*, hsFLP, UAS-CD8-GFP;;FRT82B, Tub&#62;GAL80/TM3, Sb(1);OK107-GAL4</td>
			<td></td>
			<td>BL 44408</td>
			<td>MARCM stock for flipping 3rd chromosome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>y(1), w*, hsFLP, UAS-CD8-GFP;FRT40A, Tub&#62;GAL80;OK107-GAL4</td>
			<td></td>
			<td>BL44406</td>
			<td>MARCM stock for flipping 2nd chromosome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>w*, hsFLP, tub&#62;GAL80, FRT19A; UAS-CD8-GFP/CyO;;OK107-GAL4</td>
			<td></td>
			<td>BL 44407</td>
			<td>MARCM stock for flipping X chromosome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>y(1), w*; UAS-CD8-GFP/CyO</td>
			<td></td>
			<td>BL 5137</td>
			<td>GFP labels cell surface (CD8 is a transmembrane protein)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>y(1), w*; FRTG13, UAS-CD8-GFP</td>
			<td></td>
			<td>BL 5139</td>
			<td>MARCM stock, contains FRT site and CD8-GFP on 2nd chromosome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>y(1), w*, hsFLP, UAS-CD8-GFP; Pin(1)/CyO</td>
			<td></td>
			<td>BL 28832</td>
			<td>MARCM stock, contains hsFLP and CD8-GFP on X chromosome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>w*; FRTG13, Tub&#62;GAL80</td>
			<td></td>
			<td>BL 5140</td>
			<td>MARCM stock, contains FRT site and GAL80 on 2nd chromosome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>y(1), w*;; FRT82B, Tub&#62;GAL80</td>
			<td></td>
			<td>BL 5135</td>
			<td>MARCM stock, contains FRT site and GAL80 on 3rd chromosome</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dissection and immunofluorescent staining of mushroom body and photoreceptor neurons in adult drosophila melanogaster brains

פיתוח מערכת העצבים כרוכה בביצוע סידרת אירועים שפעילותם מתואמת על ידי מספר איתות המסלולים, רשתות בקרה רגולטריות רציפים. רבים מן החלבונים המעורבים המסלולים הללו אבולוציונית נשמרים בין יונקים אחרים פרוקריוטים, כגון זבוב הפירות דרוזופילה melanogaster, רומז כי עקרונות ארגון דומה קיים במהלך הפיתוח של אלה אורגניזמים. חשוב לציין, דרוזופילה שימש בהרחבה כדי לזהות מנגנונים תאית ומולקולרית ויסות תהליכים הנדרשים אצל יונקים לרבות נוירוג'נסיס, בידול, הדרכה עצב synaptogenesis. זבובים שימשו גם בהצלחה לדגם מגוון רחב של מחלות התפתחותיות אנושי. כאן נתאר פרוטוקול עבור microdissection שלב אחר שלב, קיבוע, לוקליזציה immunofluorescent של חלבונים בתוך המוח דרוזופילה למבוגרים. פרוטוקול זה מתמקד שתי האוכלוסיות עצביים דוגמה, הגוף פטריות נוירונים, photoreceptors ברשתית, וכוללת שלבים אופציונליים כדי לעקוב אחר נוירונים בודדים הגוף פטריות באמצעות ניתוח פסיפס עם טכניקה סמן תא Repressible (MARCM). נתונים לדוגמה המוח פראי-סוג והן מוטציה מוצגים עם תיאור קצר של קריטריון הבקיע עבור הדרכה עצב פגמים. פרוטוקול זה מדגיש שני נוגדנים ומבוססת על חקירת המורפולוגיה של הגוף פטריות ואילו נוירונים קולט אור, אחרים אזורים במוח דרוזופילה , הלוקליזציה של חלבונים בתוך אזורים אחרים במוח יכול להיות גם חקר באמצעות פרוטוקול זה.

Watch this Scientific Journal Video about Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains at JoVE.com

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

פרוטוקול זה מתאר את הקרע של immunostaining של המבוגרים דרוזופילה melanogaster רקמות המוח. באופן ספציפי, פרוטוקול זה מדגיש את השימוש נוירונים הגוף, קולט אור פטריות דרוזופילה בתור דוגמה עצביים קבוצות משנה יכול לשמש באופן מדויק לחשוף את עקרונות כלליים שבבסיס היבטים רבים של ההתפתחות העצבית.

ניתוח Immunofluorescent מכתים של פטריות הגוף והנפש ומה קולט אור נוירונים במוח למבוגרים דרוזופילה melanogaster

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva

Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva

אוכלוסיות תאי דם Assaying של<em&gt; תסיסנית melanogaster</em&gt; זחל

In vertebrates, hematopoiesis is regulated by inductive microenvironments (niches). Likewise, in the invertebrate model organism&#160;Drosophila ...

Rearing the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions

Rearing the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions

גידול זבוב הפירות<em&gt; תסיסנית</em&gt; בתנאי Axenic ו Gnotobiotic

The influence of microbes on myriad animal traits and behaviors has been increasingly recognized in recent years. The fruit fly Drosophila melanogaster is ...

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

חיתוך, צביעה של השחלות הגולמי דרוזופילה

Unlike adult Drosophila ovaries, pupal ovaries are relatively difficult to access and examine due to their small size, translucence, and encasing within a ...

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

מפשיר Culturing, Cryopreserving שורות תאים דרוזופילה

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the ...

Methods to Test Endocrine Disruption in Drosophila melanogaster

Methods to Test Endocrine Disruption in Drosophila melanogaster

שיטות לבדיקת הפרעה אנדוקרינית בדרוזופילה מלאנוסטר

In recent years there has been growing evidence that all organisms and the environment are exposed to hormone-like chemicals, known as endocrine disruptor ...

Assay for Blood-brain Barrier Integrity in Drosophila melanogaster

Assay for Blood-brain Barrier Integrity in Drosophila melanogaster

שיטת שלמות המוח בדם בדרוזופילה מלאנוסטר

Proper nervous system development includes the formation of the blood-brain barrier, the diffusion barrier that tightly regulates access to the nervous ...

Dissection and Live-Imaging of the Late Embryonic Drosophila Gonad

Dissection and Live-Imaging of the Late Embryonic Drosophila Gonad

דיסקציה והדמיה חיה של דרוזופילה גונד העוברית המאוחרת

The Drosophila melanogaster male embryonic gonad is an advantageous model to study various aspects of developmental biology including, but not limited to, ...

Imaging Live Brain Explants from Drosophila melanogaster Third Instar Larvae

Live-Cell Imaging of Drosophila melanogaster Third Instar Larval Brains

Investigating Asymmetric Cell Division Dynamics: A Protocol for Live-Imaging of Drosophila Larval Brain Explants (Video) | JoVE

הדמיה של תאים חיים של Drosophila melanogaster מוח זחל כוכב שלישי

Drosophila neural stem cells (neuroblasts, NBs hereafter) undergo asymmetric divisions, regenerating the self-renewing neuroblast, while also forming a ...

Detection and Quantification of Single mRNA Molecules in Drosophila

Studying Muscle Transcriptional Dynamics at Single-molecule Scales in Drosophila

Investigating mRNA Spatial Distribution in Drosophila Muscle Tissue (Video) | JoVE

חקר דינמיקת שעתוק שרירים בסקאלות של מולקולות בודדות בדרוזופילה

Skeletal muscles are large syncytia made up of many bundled myofibers that produce forces and enable body motion. Drosophila is a classical model to study ...

﻿Staging and Collecting Drosophila melanogaster Third Instar Larvae

ï»¿Staging and Collecting Drosophila melanogaster Third Instar Larvae (Video) | JoVE 

בימוי ואיסוף דרוזופילה מלנוגסטר זחלי כוכב שלישי