Name: dissection and immunofluorescent staining of mushroom body and photoreceptor neurons in adult drosophila melanogaster brains
Uploaded: 2017-11-06T16:45:00
Duration: 10 min 13 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains at JoVE.com

Vorremmo ringraziare Changhui Pak e Alysia Vrailas Mortimer per inizialmente insegnamento SMK la tecnica di dissezione del cervello. Ringraziamo anche i membri del gruppo di Ken Moberg lab, soprattutto Chris turni, per leggere criticamente il manoscritto. Anticorpi che riconoscono Fas2 (1 4) e chaoptin (24B10) sono stati ottenuti da Developmental Studies Hybridoma Bank. Anticorpo 24B10 è stato depositato per il DSHB da Seymour Benzer e Nansi Colley24,60,61, anticorpo 1 4 è stato depositato per il DSHB da Corey Goodman 22,23,56. Stock di volare sono stati ottenuti dal centro di Stock di Bloomington. Desideriamo anche ringraziare l'Ohio Agricultural Research e Development Center (OARDC) Classifica MCIC Imaging Center per l'utilizzo del microscopio confocale all'immagine i cervelli in figura 4A e B. SMK è sostenuta da una sovvenzione NICHD (1 R15 HD084241-01A1).

Gli autori dichiarano di non avere nessun concorrenti interessi finanziari.

Il metodo di dissezione e visualizzazione sopra descritto può essere utilizzato in un'ampia varietà di immunostaining e vive applicazioni di imaging. Ci hanno delineato un protocollo di immunostaining generale e hanno messo in evidenza un modo in cui MARCM può essere utilizzato per visualizzare axonal morfologia dei neuroni individuali del corpo del fungo. Inoltre, queste procedure generali possono essere utilizzate anche per altre regioni del cervello in fissa di imaging o adulto appena dissecata cervelli48,65. Formazione immagine diretta può fornire un approccio più efficiente quando si analizzano i modelli di espressione di enhancer trap, geni reporter o MiMIC linee66, ad esempio. Per evitare che cattura artefatti dalla morte delle cellule durante la formazione immagine diretta di GFP in tessuto unfixed, cervelli dovrebbero essere sezionati in 1x Phosphate Buffered Saline (PBS) o HL3 media48, montati su slitte di ponte in 1X PBS (o HL3) e fotografati in meno di 15-20 min cura Occorre inoltre di rimuovere tanto trachea come possibile dal cervello dissecato prima di formazione immagine, poiché può interferire con la visualizzazione della fluorescenza di GFP.
Mentre colorazione condizioni per valutare la morfologia dei neuroni del fotoricettore e corpo del fungo sono relativamente ben consolidata24,61,67, la localizzazione di una proteina specifica di interesse in queste cellule tipi possono richiedere ottimizzazione e risoluzione dei problemi completa. In particolare, diversi passaggi critici, tra cui la diluizione dell'anticorpo, blocco buffer componente concentrazione e la fissazione, dovrebbero essere ottimizzati per generare risultati più riproducibili e affidabili. In primo luogo, deve essere determinata la concentrazione ottimale di anticorpo primario. Anche se commercialmente disponibili anticorpi hanno spesso una diluizione consigliata (e spesso inizialmente iniziamo utilizzando quella concentrazione), questi valori sono raramente determinati empiricamente sui tessuti della drosofila . Di conseguenza, testare una serie di diluizioni di anticorpo primario che gamma sopra e sotto suggerimento iniziale del produttore spesso si traduce in colorazione più specifica. Mentre la diluizione di anticorpo primario può avere un effetto significativo sulla macchiatura di precisione e deve essere determinata con precisione, i cervelli di tempo vengono incubati in anticorpo primario contenente soluzioni possono variare notevolmente con scarso effetto sul risultato complessivo. Ad esempio, abbiamo osservato risultati simili quando incubando sezionati cervelli con l'anticorpo primario di anticorpo Fas2 per due, tre o anche quattro giorni a 4 ° C. Anche se si consiglia di almeno due notti, abbiamo anche incubate cervelli in soluzione di anticorpo primario per una sola notte e ottenuto macchiatura riproducibile. D'importanza, limitando la quantità di tempo cervelli sono incubati nell'anticorpo secondario a 3 h a temperatura ambiente (o una notte a 4 ° C) aiuta il legame non specifico limite di anticorpi secondari al tessuto cerebrale.
In secondo luogo, può essere necessario utilizzare altri reagenti "blocchi" per eliminare il segnale di fondo indesiderato. Le opzioni includono l'aumento della concentrazione di NGS a ~ 10%, l'aggiunta di 1-10% dell'albumina di siero bovino (BSA) per le soluzioni Anticorpo bloccante sia primario e secondario, o pre-adsorbimento di anticorpi primari durante la notte a 4 ° C con embrioni della drosofila (Vedi riferimento68, punto 2.9, passaggio 3).
Mentre abbiamo scritto il protocollo sopra utilizzando PTN del buffer suggerito per tutti i fissazione, lavaggio e fasi di incubazione dell'anticorpo, fissazione del tessuto in altri buffer (ad esempio PLP e PEM, elencati nella Tabella materiali) può provocare profonde differenze in potenza del segnale. Ad esempio, studi precedenti hanno dimostrato che la ciclina E è inosservabile in dischi immaginali larvale quando i tessuti sono stati corretti nel tradizionale paraformaldeide 4%, diluito in PBS, ma è chiaramente visibile quando i tessuti sono stati corretti nel buffer di PLP (Ken Moberg, personali comunicazione e riferimento69). Oltre alle modifiche nel buffer componenti, alterare il tempo e la temperatura per il fissaggio del tessuto possa anche significativamente influenzare immunofluorescente macchiatura e può essere determinate empiricamente se necessario. In generale, tempo di fissazione deve essere sufficientemente lungo per consentire sufficiente reticolazione delle componenti cellulari e manutenzione a lungo termine della morfologia cellulare globale pur essendo limitato abbastanza per impedire over-reticolazione e "seppellire" degli epitopi della proteina. Pertanto, quando inizialmente ottimizzazione delle condizioni di colorazione per un anticorpo primario appena acquisita, di solito limitare il tempo di fissazione a circa 20 min e spesso risolvono i tessuti alle temperature più fredde.
Diversi controlli dovrebbero essere incluso in qualsiasi esperimento di immunofluorescenza per studiare la specificità degli anticorpi primari e secondari così come l'effetto di transgeni/genetico sul fenotipo osservato. Per accertare se l'anticorpo primario utilizzato specificamente riconosce la proteina d'interesse, tessuto da mosche carenti questa proteina e/o tessuto che overexpressing la proteina dovrebbe essere incluso come controlli. L'aggiunta di proteine in eccesso di antigene purificato può anche essere incluso per determinare se l'anticorpo primario riconosce altri epitopi nel cervello volo. Infine, qualsiasi segnale fluorescente presente quando gli anticorpi primari vengono omessi rappresenta il livello di legame non specifico dagli anticorpi secondari selezionati.
Diversi controlli importanti dovrebbero essere inclusi anche per valutare il contributo del background genetico o la presenza di transgeni per intensità di colorazione o morfologia neuronale. Ad esempio, le mosche utilizzate nell'esperimento MARCM nella Figura 5 contengono transgeni multipli (hsFLP, UAS-CD8-GFP, FRT82B, vasca &#62; GAL80 e OK107-GAL4), ognuno dei quali dovrebbe essere analizzato separatamente per gli effetti sulla morfologia del corpo del fungo. A una morfologia molto minimo, fungo corpo di mosche che contiene OK107-GAL4 sia UAS-CD8-GFP dovrebbero essere analizzati. Può anche essere necessario valutare l'effetto di scossa di calore e produzione ricombinasi Flp sullo sviluppo del corpo del fungo analizzando Vola contenente sia hsFLP e FRT82B. Anche se MARCM può fornire la comprensione significativa in se una data proteina controlla autonomamente axonal di orientamento, il numero di controlli necessari per rendere con precisione questa conclusione può essere un limite minore di questa tecnica. Meno complicati esperimenti, controlli simili sono altresì applicabili. Ad esempio, prendere un esperimento dove il sistema GAL4/UAS viene utilizzato in combinazione con un transgene di RNAi per atterramento espressione di una proteina di interesse in tutti i neuroni. In questo esperimento, almeno due transgeni sarà presente: un pan-neuronale GAL4 driver, ad esempio di Elav-GAL4 e il transgene UAS-RNAi . La morfologia dei neuroni del corpo del fungo in mosche contenenti ciascuno di questi transgeni da solo dovrebbe essere studiata oltre alla condizione sperimentale dove mosche harbor sia transgeni al volo stesso.
Infine, per determinare se la proteina di interesse è espresso nei neuroni di corpo del fungo è solitamente necessario cervelli co-macchia con gli anticorpi al Fas2. In alternativa, le proteine fluorescenti come GFP, RFP o la membrana associato CD8-GFP possono anche essere espressa utilizzando il sistema GAL4/UAS e utilizzato in combinazione con anticorpi che riconoscono la proteina di interesse. Poiché Fas2 riconosce solo gli assoni scanditi che formano i lobi α e β del corpo del fungo, l'uso di GAL4-driven, membrana-limita CD8-GFP è stato particolarmente utile per la marcatura di neuroni del corpo del fungo.
Difetti di axonal guida spesso non sono 100% con liquidi penetranti e anche cervello dello stesso genotipo potrebbe mostrare qualche variabilità. Pertanto, quando l'analisi appena generato alleli mutanti per difetti nel corpo del fungo o path-finding del fotoricettore, dovrebbe essere utilizzata una combinazione di alleli differenti e approcci. Maggior parte degli studi nella letteratura utilizzare vari metodi per indagare se una proteina svolge un ruolo delle cellule-autonoma nel controllo Guida assonale: i) analisi di pathfinding difetti in omozigoti mosche null (preferibilmente utilizzando diversi nugli alleli ll), ii) analisi di pathfinding difetti nelle mosche manca la proteina di interesse solo in neuroni (di solito tramite RNAi), iii) analisi MARCM dei difetti di path-finding e iv) esperimenti dove il gene è riespresso nei neuroni null omozigotica di salvataggio mosche. Idealmente, dovrebbero essere analizzati diversi dozzina cervelli al genotipo per difetti nella morfologia neuronale.
Sebbene il protocollo qui descritto si concentra principalmente su immunofluorescente localizzazione delle proteine all'interno del tessuto fisso, diverse applicazioni future di questa tecnica sono state sviluppate immagine dal vivo al tessuto di cervello. Una volta cervelli vengono sezionati (solitamente in terreno di coltura delle cellule), quindi possono essere coltivate per diversi giorni a 25 ° C. Questi metodi di coltura ex vivo stanno sviluppandi per studiare una vasta gamma di processi biologici, quali attività di proteina che promuove la rigenerazione assonale dopo lesione70,71, intracellulare segnalazione dinamica72e lo sviluppo neuronale73.

Anche se il sistema nervoso di Drosophila è inferiore a quello degli esseri umani e roditori, la sua complessità fornisce un modello potente, socievole per comprendere meglio i suoi omologhi dei vertebrati. In molti casi, i genomi di vertebrati e mosche codificano proteine molto simili che dettano i meccanismi di sviluppo del sistema nervoso. Infatti, molti dei geni necessari per lo sviluppo neuronale nei vertebrati sono ortologhi in mosche, compresi quelli coinvolti in vie di segnalazione che controllo patterning, neurogenesi e orientamento axonal1,2,3 ,4,5. Ad esempio, netrina è un ligando necessario per una guida assonale in mammiferi e d. melanogaster6,7,8. Mentre netrina era originariamente isolato da pulcino embrionali cervello tessuto6, studi successivi hanno rivelato che netrina svolge un ruolo conservato durante lo sviluppo del sistema nervoso centrale embrionale (CNS) in Drosophila8. Altri studi hanno utilizzato schermi genetici nell'embrionale della drosofila CNS per identificare conservati ligandi e recettori necessari per path-finding in Drosophila e vertebrati9.
Mentre la Mosca embrionale CNS è stata utilizzata ampiamente in passato per identificare ligandi, i recettori e proteine di segnalazione intracellulare necessarie per orientamento axonal8,9, lavoro recente ha studiato i modi in cui molte delle Queste proteine controllano anche decisioni di path-finding durante le fasi successive di sviluppo. In particolare, indagine del corpo del fungo (MB) e sviluppo di neurone dei fotorecettori retinici (Figura 1) ha fornito la comprensione nei meccanismi che path-finding controllo, formazione della sinapsi, potatura dell'assone e molti altri aspetti di un neurone sviluppo10,11,12,13,14,15,16,17. I neuroni del fotoricettore connettersi retina Vola in regioni del cervello adulto chiamato lamina e midollo e sono critico per l'inoltro di informazioni visive al cervello (Recensito da18,19), mentre i neuroni del corpo del fungo sono centralmente situato nel cervello volo e sono necessari per apprendimento e memoria20,21. Sia i neuroni del fotoricettore e i neuroni intrinseci dei corpi del fungo, chiamati cellule di Kenyon, utilizzano meccanismi di evolutivamente conservati Consiglio axonal diffusibile e contatto-dipendente per trovare loro obiettivi post-sinaptiche. Oltre ad essere visibile in mosche adulte, del fotoricettore e MB neuroni possono anche essere direttamente visualizzati in larve e pupe con anticorpi o geni reporter22,23,24,25. La possibilità di visualizzare facilmente questi due insiemi di neuroni in diversi momenti dello sviluppo ha promosso il loro uso come modelli superbe per molti aspetti dello sviluppo neuronale.
Oltre ad essere utilizzato come un modello per capire i meccanismi dello sviluppo normale del sistema nervoso, studi recenti hanno dimostrato che le mosche possono anche servire come modelli accurati di un'ampia varietà di malattie umane, compreso la sindrome di X Fragile (FXS)26 , Disabilità intellettuale (ID)27,28,29,30,31e gli altri32. Ad esempio, per studiare la funzione molecolare di ZC3H14, un gene recentemente collegato alla disabilità intellettuale umano, abbiamo creato un modello fly di ID utilizzando un allele nullo della Mosca dell'ortologo di ZC3H14, chiamato Nab230. Manca Nab2 mosche hanno memoria gravi menomazioni ed estesa code di poli (a), ricapitolare quello che si osserva in pazienti umani o paziente derivato cellula linee33,34. D'importanza, mosche carente Nab2 anche visualizzare severa del cervello morfologia difetti nei loro corpi fungo adulto34, simile a ciò che si osserva nelle mosche privi del gene di sindrome FXS, FMR135. Così, mosche possono servire come un importante organismo modello per studiare lo sviluppo normale del cervello e malattie che interrompono.
Infine, l'accessibilità dei metodi ad alto rendimento per monitorare il comportamento, combinato con la vasta gamma di strumenti genetici disponibili, rendono Drosophila organismo modello di scelta per l'identificazione di regioni del cervello che controllano i comportamenti complessi, come apprendimento e memoria, sonno, corteggiamento, sete e altri36,37,38,39. Uno strumento particolarmente utile che è al centro di «strumenti» di un genetista volare è il sistema GAL4/UAS (Figura 2). Questo sistema40,41 utilizza espressione specifica del tessuto dell'attivatore trascrizionale Gal4 per aumentare l'espressione di geni o transgeni a valle di una sequenza di attivazione a Monte (UAS). Le modifiche di questo sistema hanno permesso che i ricercatori, ad esempio, controllare con precisione l'eccitabilità dei neuroni specifici42,43, iperesprimere o colpo specifici geni di interesse44, 45, l'analisi del calcio in tempo reale dinamica nel vivo46ed esprimere geni reporter per contrassegnare un neurone lignaggi41. La combinazione del sistema GAL4/UAS con ricombinazione mitotica anche permesso la creazione di analisi del mosaico con un indicatore di cella reprensibile (MARCM) sistema12,47. MARCM è stato usato estesamente nell'analisi di singoli neuroni per identificare i componenti di segnalazione cellulari necessari per orientamento axonal12,47. Anche se queste e altre tecniche hanno fornito un numero di preziose informazioni sui meccanismi cellulari necessari per il funzionamento del sistema nervoso, la maggior parte richiedono che il cervello di Drosophila in primo luogo essere sezionato; rimozione accurata del cervello è necessario per mantenere corrette cervello modelli di morfologia e connessione tra regioni del cervello. Il seguente protocollo utilizza fungo neuroni del fotoricettore e corpo comepopolazioni neuronali di esempio come si guida l'utente attraverso la dissezione e cervello di Drosophila immunofluorescenza colorazione dell'adulto.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Microdissection forceps/tweezers</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>505-NM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard dishes</td>
			<td>Living Systems Instrumentation</td>
			<td>DD-50-S-BLK</td>
			<td>Available from amazon.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fas2 Antibody</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>1D4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chaoptin Antibody</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>24B10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP Antibody</td>
			<td>Aves Lab</td>
			<td>GFP-1010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa488 goat anti-mouse secondary antibody</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A-11001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa488 goat anti-chicken secondary antibody</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A-11039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa647 goat anti-mouse secondary antibody</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A-21236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20% paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscope Services</td>
			<td>RT15713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VectaShield</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>H-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperFrost Plus Slides</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>99-910-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12-553-454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na Phosphate Buffer monobasic</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S3139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na phosphate Buffer dibasic</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S3264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X 100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>X100-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fingernail polish</td>
			<td>Electron Microscope Services (EMS)</td>
			<td>72180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stereomicroscope</td>
			<td>Leica S6D with KL300 LED light source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9-well dish (spot plate)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89090-482</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nutator/rocker</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>22-363-152 or 88-861-041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35mm dish</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>32-103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>50-366-794</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipe</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>06-666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potential Fixation Buffers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTN Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.1M NaPhosphate, pH 7.2, 0.1% Triton-X-100, Typically make up 0.5 L of 0.1M NaPhosphate buffer and aliquote 50ml at a time as needed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PLP buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>2% paraformaldehyde, 0.01M NaI04, 0.075M Lysine, 0.037M NaPO4, pH 7.2, Dissolve 0.36 g lysine in 10 ml H2O + 7.5 ml 0.1 M NaH2PO4 pH 7.2 + 2.5 ml 0.1 M Na2HPO4 on ice. Immediately before use, mix 15 ml of this buffered lysine solution with 50 mg NaIO4 (sodium periodate) + 2ml of the 20% high grade paraformaldehyde (EMS) + 3ml H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEM buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.1M PIPES pH 7.0, 2mM MgS04, 1mM EGTA, This buffer can be conveniently made as a 2x stock and diluted with 8% paraformaldehyde (PFA) to give a final concentration of 4% PFA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fly Stocks available from Bloomington</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>elav (c155)-GAL4</td>
			<td></td>
			<td>BL458</td>
			<td>Pan-neuronal GAL4 driver</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>w*;;;OK107-GAL4</td>
			<td></td>
			<td>BL 854</td>
			<td>GAL4 driver for all mushroom body neurons (OK107-GAL4 insertion is on the 4th chromosome)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>y(1), w(67c23); c739-GAL4</td>
			<td></td>
			<td>BL 7362</td>
			<td>GAL4 driver for alpha and beta lobes (on 2nd chromosome)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>y(1), w(67c23); c739-GAL4, UAS-CD8-GFP</td>
			<td></td>
			<td>BL 64305</td>
			<td>GAL4 driver for alpha and beta lobes, also contains UAS-CD8-GFP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>w*; 201Y-GAL4</td>
			<td></td>
			<td>BL 4440</td>
			<td>GAL4 driver for primarily the gamma lobes of mushroom body (on 2nd chromosome)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>y(1), w(67c23); 201Y-GAL4, UAS-CD8-GFP</td>
			<td></td>
			<td>BL 64296</td>
			<td>GAL4 driver for mushroom body gamma lobes, also contains UAS-CD8-GFP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>w*, elav (c155)-GAL4, hsFLP; FRTG13, Tub&#62;Gal80/CyO</td>
			<td></td>
			<td>BL 5145</td>
			<td>MARCM stock, contains FRT site and GAL80 on 2nd chromosome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>w*, elav (c155)-GAL4, hsFLP, UAS-CD8-GFP</td>
			<td></td>
			<td>BL5146</td>
			<td>MARCM stock, contains hsFLP, pan-neuronal GAL4, and CD8-GFP on X chromosome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>y(1), w*, hsFLP, UAS-CD8-GFP;;FRT82B, Tub&#62;GAL80/TM3, Sb(1);OK107-GAL4</td>
			<td></td>
			<td>BL 44408</td>
			<td>MARCM stock for flipping 3rd chromosome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>y(1), w*, hsFLP, UAS-CD8-GFP;FRT40A, Tub&#62;GAL80;OK107-GAL4</td>
			<td></td>
			<td>BL44406</td>
			<td>MARCM stock for flipping 2nd chromosome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>w*, hsFLP, tub&#62;GAL80, FRT19A; UAS-CD8-GFP/CyO;;OK107-GAL4</td>
			<td></td>
			<td>BL 44407</td>
			<td>MARCM stock for flipping X chromosome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>y(1), w*; UAS-CD8-GFP/CyO</td>
			<td></td>
			<td>BL 5137</td>
			<td>GFP labels cell surface (CD8 is a transmembrane protein)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>y(1), w*; FRTG13, UAS-CD8-GFP</td>
			<td></td>
			<td>BL 5139</td>
			<td>MARCM stock, contains FRT site and CD8-GFP on 2nd chromosome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>y(1), w*, hsFLP, UAS-CD8-GFP; Pin(1)/CyO</td>
			<td></td>
			<td>BL 28832</td>
			<td>MARCM stock, contains hsFLP and CD8-GFP on X chromosome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>w*; FRTG13, Tub&#62;GAL80</td>
			<td></td>
			<td>BL 5140</td>
			<td>MARCM stock, contains FRT site and GAL80 on 2nd chromosome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>y(1), w*;; FRT82B, Tub&#62;GAL80</td>
			<td></td>
			<td>BL 5135</td>
			<td>MARCM stock, contains FRT site and GAL80 on 3rd chromosome</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dissection and immunofluorescent staining of mushroom body and photoreceptor neurons in adult drosophila melanogaster brains

Sviluppo del sistema nervoso comporta una serie sequenziale di eventi che sono coordinati da diverse vie di segnalazione e reti di regolazione. Molte delle proteine coinvolte in queste vie sono evolutivamente conservate tra mammiferi e altri eucarioti, come moscerino della frutta Drosophila melanogaster, suggerendo l'esistano di principi organizzativi simili durante lo sviluppo di questi organismi. D'importanza, Drosophila è stato usato estesamente per identificare i meccanismi cellulari e molecolari che regolano processi che sono necessari nei mammiferi, compresa la neurogenesi, differenziazione, orientamento assonale e sinaptogenesi. Mosche sono anche stati utilizzati con successo per modellare una varietà di malattie umane neurodevelopmental. Qui descriviamo un protocollo per la microdissezione passo dopo passo, fissazione e immunofluorescente localizzazione delle proteine all'interno del cervello di Drosophila adulto. Questo protocollo si concentra su due popolazioni neuronali di esempio, i neuroni del corpo del fungo e fotorecettori retinici e include passaggi facoltativi per la traccia di neuroni individuali corpo fungo usando analisi di mosaico con una tecnica di reprensibile Cell Marker (MARCM). Dati di esempio da cervelli wild-type e mutanti sono mostrati insieme con una breve descrizione di un criterio di punteggio per orientamento axonal difetti. Mentre questo protocollo mette in evidenza due anticorpi ben consolidati per indagare la morfologia del corpo del fungo e i neuroni del fotoricettore, altre regioni del cervello di Drosophila e la localizzazione delle proteine all'interno di altre regioni del cervello può anche essere studiato usando questo protocollo.

Watch this Scientific Journal Video about Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains at JoVE.com

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Questo protocollo descrive la dissezione e immunostaining del adulto Drosophila melanogaster tessuti del cervello. In particolare, questo protocollo evidenzia l'uso di Drosophila fungo del fotoricettore e corpo neuroni come sottoinsiemi di un neurone di esempio che possono essere utilizzati con precisione per scoprire i principi generali alla base di molti aspetti dello sviluppo neuronale.

Dissezione e macchiatura immunofluorescente del corpo di fungo e del fotoricettore neuroni nel cervello adulto Drosophila melanogaster

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva

Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva

Saggio popolazioni cellulari del sangue<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Larva

In vertebrates, hematopoiesis is regulated by inductive microenvironments (niches). Likewise, in the invertebrate model organism&#160;Drosophila ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

Rearing the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions

Rearing the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions

Allevamento la mosca della frutta<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Sotto axeniche e Gnotobiotic Condizioni

The influence of microbes on myriad animal traits and behaviors has been increasingly recognized in recent years. The fruit fly Drosophila melanogaster is ...

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

Dissezione e colorazione delle ovaie Pupal Drosophila

Unlike adult Drosophila ovaries, pupal ovaries are relatively difficult to access and examine due to their small size, translucence, and encasing within a ...

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Scongelamento, coltura e Cryopreserving linee di cellule di Drosophila

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the ...

Methods to Test Endocrine Disruption in Drosophila melanogaster

Methods to Test Endocrine Disruption in Drosophila melanogaster

Metodi per testare la disgregazione endocrina nella Drosophila melanogaster

In recent years there has been growing evidence that all organisms and the environment are exposed to hormone-like chemicals, known as endocrine disruptor ...

Assay for Blood-brain Barrier Integrity in Drosophila melanogaster

Assay for Blood-brain Barrier Integrity in Drosophila melanogaster

Analisi per l'integrità della barriera del cervello edelico nella Drosophila melanogaster

Proper nervous system development includes the formation of the blood-brain barrier, the diffusion barrier that tightly regulates access to the nervous ...

Dissection and Live-Imaging of the Late Embryonic Drosophila Gonad

Dissection and Live-Imaging of the Late Embryonic Drosophila Gonad

Dissezione e Live-Imaging della Drosophila Gonad embrionale tardiva

The Drosophila melanogaster male embryonic gonad is an advantageous model to study various aspects of developmental biology including, but not limited to, ...

Imaging Live Brain Explants from Drosophila melanogaster Third Instar Larvae

Live-Cell Imaging of Drosophila melanogaster Third Instar Larval Brains

Investigating Asymmetric Cell Division Dynamics: A Protocol for Live-Imaging of Drosophila Larval Brain Explants (Video) | JoVE

Imaging delle cellule vive di Drosophila melanogaster Terzo stadio Larvale Cervelli

Drosophila neural stem cells (neuroblasts, NBs hereafter) undergo asymmetric divisions, regenerating the self-renewing neuroblast, while also forming a ...

Detection and Quantification of Single mRNA Molecules in Drosophila

Studying Muscle Transcriptional Dynamics at Single-molecule Scales in Drosophila

Investigating mRNA Spatial Distribution in Drosophila Muscle Tissue (Video) | JoVE

Studio della dinamica trascrizionale muscolare su scale di singole molecole in Drosophila

Skeletal muscles are large syncytia made up of many bundled myofibers that produce forces and enable body motion. Drosophila is a classical model to study ...

﻿Staging and Collecting Drosophila melanogaster Third Instar Larvae

ï»¿Staging and Collecting Drosophila melanogaster Third Instar Larvae (Video) | JoVE 

Stadiazione e raccolta di Drosophila melanogaster Larve del terzo stadio