Name: dissection and immunofluorescent staining of mushroom body and photoreceptor neurons in adult drosophila melanogaster brains
Uploaded: 2017-11-06T16:45:00
Duration: 10 min 13 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains at JoVE.com

Vi vill tacka Changhui Pak och Alysia Vrailas Mortimer för initialt undervisning SMK hjärnan dissektion tekniken. Vi tackar också medlemmar i Ken Mobergs lab gruppen, särskilt Chris rundor, för att kritiskt läsa manuskriptet. Antikroppar som erkänner Fas2 (1 d 4) och chaoptin (24B10) erhölls från utvecklande studier Hybridomteknik banken. Antikropp 24B10 sattes till DSHB av Seymour Benzer och Nansi Colley24,60,61, antikropp 1 d 4 deponerades till DSHB av Corey Goodman 22,23,56. Flyga bestånd erhölls från Bloomington lager Center. Vi vill också tacka Ohio jordbruksforskning och utveckling Center (OARDC) MCIC Imaging Center för användning av mikroskopet confocal till bild hjärnor i figur 4A och B. SMK stöds av ett bidrag från NICHD (1 R15 HD084241-01A1).

1. drosophila melanogaster genetik och tillval värme chock förfaranden
<ol><li>En gång flugor har korsats och F1-avkomman har kläckts, få honor eller hanar av lämpliga genotyp. Beroende på hjärnregionen utreds, flugor bör samlas dagligen och åtskilda av kön så att åldersberoende eller könsdimorfisk mönster hjärnan anslutningsmöjligheter lättare kan urskiljas. 
	Obs: Tillval: om flugor som används för Mosaic analys med en Repressible Cell markör (MARCM) analys 12 , 47, embryon, larver eller puppor bör vara värme chockad vid 37 ° C i 30-45 min till inducera mitotisk rekombination. För att rikta specifika regioner svamp organ för MARCM analys, ska värme chock tajmas enligt schema fastställt 12 och beskrivs i figur 5 B. Om du använder MARCM för att undersöka hjärnregioner än svamp organ, bör pilotförsök utföras för att bestämma den optimala scenen vara värme-chockad. Medan stegen nedan skrivs med avseende på eclosed flugor, pharate vuxna kan också vara dissekeras med dessa steg när Pupp fallet har tagits.</li>
</ol> 2. Dissektion Station förberedelse <ol><li>Position den stereomikroskopet och ljus källa med ansluten fiber optic goosenecks på en stor bänkmonterade. Att främja stadig handrörelser och minska hand &#34; skaka &#34; medan dissekera, är det viktigt att det finns adekvat hand och arm resten utrymme runt mikroskopet. Säkerställa att det finns ungefär 8-10 tum på vardera sidan av Mikroskop och 4-6 inches mellan basen av Mikroskop och kanten av bänken.</li>
	<li>Fyllning 2 eller 3 brunnar i ett glas 9-väl eller 3-brunn skålen med 1,0 mL av PTN buffert (0.1 M natrium fosfatbuffert pH 7,2, 0,1% icke-jonaktivt ytaktivt ämne, se material tabell för komplett buffert komponenter) och placera bredvid dissekera stationen på is. Nyligen dissekerade hjärnor kommer att överföras till denna maträtt och lagras tills steget fixering.
	<ol><li>Obs: om levande imaging krävs, dissektion bufferten bör vara 1 x fosfat buffrad saltlösning (PBS) eller HL3 buffert 48. Om det krävs intracellulära protein lokalisering, kan PBS också användas som en alternativ buffert för dissektion och fixering. Efter fixering, permeabilisering av cellmembran bör då utföras med PTN tvättar som innehåller 0,1% eller 0,3% Nonjonaktivt rengöringsmedel.</li>
		<li>Om PBS används för dissektioner och fixering, pipettspetsar bör sköljas minst en gång med ett tvättmedel som innehåller buffert (såsom PTN) att förhindra hjärnor fastnar i plast pipettspetsar under överföring till mikrocentrifugrör.</li>
	</ol></li> <li>Med hjälp av en tom 35 mm glas eller plast petriskål, bygga en dissektion maträtt som innehåller en silikonelastomer. Kort, blanda elastomer komponenterna enligt tillverkaren &#39; s riktningar, häll i 35 mm rätter, och låt det polymerisera över natten på en plan yta. Elastomer som innehåller dissektion rätter bör användas för att skydda fina tips av dissekera pincetten, som kan lätt skadas om kontakt sker mellan Tången och en hårdare yta, till exempel en glasskål. Vi köper också regelbundet kommersiellt tillgängliga silikon belagda rätter från återförsäljare online. För att öka kontrast under dissektioner, silikon elastomer dissektion rätter som innehåller inaktiverade träkol (och således färgade svart) är särskilt användbara.</li>
</ol> 3. Vuxna hjärnan dissektion förfarande <ol><li>Anesthetize 3-5 dagars gamla vuxna D. melanogaster med CO 2 eller med is. Om du använder is, flyger plats injektionsflaskan med flugor uppochner (sätt änden ner) i en ishink för ~ 5 min. Placera injektionsflaskan i is uppochner förhindrar från att bli ingavs i maten. När flugorna har varit sövd, placera flugorna på en kall metall pad eller petriskål sittande i is eller på en CO 2 avger flyga pad. Om dissekera hjärnor för att analysera neurodegeneration, äldre flugor kan också användas.</li>
	<li>Placera en liten mängd (150-200 µL) av PTN i mitten av dissektion skålen med överföring pipett eller p200 pipett för att skapa en &#34; bubbla &#34; av PTN. Placera dissektion skålen under stereomikroskopet och justera belysningen och fokusera så att bubbla av PTN fyller synfältet och är jämnt upplyst.</li>
	<li>Manipulera flugor så att de är &#34; mage upp &#34; (dvs, ventrala sida upp) liggande på metallen eller CO 2 pad.</li>
	<li>Med ett par #5 pincett, ta tag i buken av en fluga att vara dissekeras och, att hålla tag i i farten, helt dränka det i PTN på dissektion skålen. 
	Obs: För återstoden av protokollet, alla åtgärder ska utföras medan huvudet är nedsänkt i PTN.</li>
	<li>Använder ett par #5 pincett, ta tag basen av den flyga Snabel och dra de två par av tången isär för att lösgöra flyga huvudet från kroppen. Kassera buk och thorax. Under detta steg är det viktigt att huvudet inte är släppt och tillåtet att flyta på ytan av PTN. När huvudet är flytande, det kan vara mycket svårt att förstå igen utan att krossa hjärnan. 
	Obs: Med den här metoden, undertrckande anslutningar mellan hjärnan och ventrala nerv sladd. Om intakt anslutningar mellan dessa regioner av CNS krävs bör en alternativ dissektion protokoll, till exempel 49 , 50, följas. Om snabel lossnar från chefen fly innan huvudet tas bort, blir det ett hål där snabel var. I detta fall förstå flyga huvudet vid kanten av hålet nära ena ögat. Ta sedan bort huvudet med en måttlig mängd kraft samtidigt som du drar två parar av tången från varandra. Ibland när huvudet avlägsnas från kroppen, tarm och/eller ventrala nerv sladd resterna bifogas huvudet och bör tas bort innan du fortsätter dissektion.</li>
	<li>Medan ett par pincett griper snabel, det andra paret bör förstå mediala kanten av just flyga ögat. Dra långsamt, tången från varandra. Detta steg bör utföras med en liten mängd stadig sidokraft. När tången långsamt flyttar från varandra, bör snabel dra bort från huvudet och skapa ett centralt hål i huvudet nagelbanden. Kassera snabel med det första paret tången utan att släppa den mediala delen av höger öga från det andra paret. 
	Obs: Vuxen D. melanogaster hjärnan är i den kaudala (dvs bakre/bakre) regionen av flyga huvudet. Således, greppa regionen av huvudet bör undvikas. Helst, bara den rostralt (dvs, front) del av huvudet nära mediala näthinnan bör röras direkt av tången. Hjärnan och associerade luftstrupen ska nu synas genom centrala hålet i nagelbanden. Vid denna tid, några vita trådiga trådar av luftstrupen sticker ut från hålet kan tas bort och kasseras.</li>
	<li>Med det andra paret av tången, greppa den mediala kanten av vänster näthinnan (på kanten av den centrala hål i huvudet nagelbanden). Ta bort de näthinnor och associerade nagelband, långsamt dra tången ligger bredvid varandra i 180 ° vinkel. Som näthinnan dissocierar från den underliggande optic loben, bör du känna en liten minskning av spänningar. Gå långsamt att förhindra riva den optic loben. 
	Obs: Separera tången för snabbt under detta steg kan resultera i avrivningen av the optic LOB eller störningar av svamp kroppens strukturer. Ibland, fjällskiktet tas bort men bitar av näthinnan kommer att sitta kvar på optic LOB. Om imaging svamp organ, är det inte helt nödvändigt att ta bort hela näthinnan. Analys av andra regioner i hjärnan (t.ex. retinala neuron innervation av fiberoptiska hjärnan loberna) kan dock kräva näthinnan tas bort helt som beskrivs av 48 , 51. 
	Obs: Näthinnan är långsamt skild från den underliggande optic loben av hjärnan, den optiska loben bör vara observerbara som en ogenomskinlig vit struktur täckt med vit, trådiga luftstrupen. När en näthinnan har tagits bort, kan det kastas. När man analyserar pathfinding av retinala nervceller, försiktig särskilt under detta steg att förhindra skador på synnerven LOB. Ett tilläggsprotokoll fokuserade på dissektion och levande avbildning av ljusmätare nervceller är också tillgängliga 48.</li>
	<li>Nu, ta försiktigt bort så mycket av synliga luftstrupen som möjligt. Luftstrupen kan redan innehålla eller senare fylla med luft, orsakar hjärnor att flyta och, eventuellt, förloras under senare immunfärgning steg. Ta bort luftstrupen, plocka bort hjärnan använder en mycket vass par #5 pincett.</li>
	<li>Ta bort återstående näthinnan och omgivande nagelbanden med båda paren av pincett för att förstå mediala regionen av vänster flyga näthinnan. Försiktigt riva näthinnan i hälften för att ta bort bitar av näthinnan och nagelband. I vissa fall bevisar ta bort återstående nagelbanden utan att krossa hjärnan särskilt utmanande. I dessa fall har vi funnit att de återstående delarna av den ventrala nerv sladden istället kan gripas av en par pincett medan den andra par pincett används för att ta försiktigt bort sist av nagelbanden.</li>
	<li>Med pipett p200 flytta dissekerade hjärnor till en brunn av 9 - eller 3-bra maträtt som innehåller PTN. Hjärnor av samma genotyp bör vara poolade tillsammans i samma väl och hållas på is. Hjärnvävnaden bör fastställas inom en timme av dissektion. Hjärnor kan fastställas i små partier och poolade krävs ett större antal hjärnor. I de flesta fall kan en erfaren forskare oftast dissekera en hjärna och överföra det till glas samling skålen i cirka 3-5 min.</li>
</ol> 4. Fixering och Immunofluorescerande färgning förfarande <ol><li>med p200 pipett överföra dissekerade hjärnor från 9-väl skålen till en 0,5 mL mikrocentrifug rör fyllda med 0,5 mL 4% PARAFORMALDEHYD utspätt i PTN. Minst 10-15 hjärnor av samma genotyp kan kombineras i en mikrocentrifug rör. Alla återstående steg (tills montering av hjärnor på diabilder) färdigställs i 0,5 ml mikrocentrifugrör. 
	FÖRSIKTIGHET: PARAFORMALDEHYD (PFA) bör hanteras i dragskåp. PFA avfall bör sparas och kasseras på rätt sätt. 20% PARAFORMALDEHYD köpt i glas ampuller kan vara aliquoted i mikrocentrifugrör och lagras vid-20 ° C tills behövs.</li>
	<li>Inuti ett dragskåp, inkubera hjärnor i 4% PARAFORMALDEHYD i 20 min med långsam hastighet gunga i rumstemperatur.</li>
	<li>Efter fixering, tillåta hjärnor sedimentera till botten av röret mikrocentrifug självtryck. 
	Obs: Ibland hjärnor kan fastna vid sidan av mikrocentrifug röret. Om detta inträffar är det oftast bra till sido rotera röret mellan pekfingret och tummen eller mycket försiktigt tryck röret på bänken att främja förlisningen av hjärnor.</li>
	<li>Ta bort fixativ använder en p1000 pipett och utför två &#34; snabb &#34; tvättar med 500 µL av PTN, vilket gör att hjärnan sedimentera till botten av mikrocentrifug röret mellan tvättarna. Under dessa snabb tvättar, när alla hjärnor har fast självtryck längst ned i mikrocentrifug röret, kan PTN omedelbart bytas mot färsk buffert; ingen ytterligare tvätt tid krävs. 
	Obs: Lämna extra buffert i röret är vanligtvis att föredra att riskera hjärnan borttagning. Noggrann undersökning av pipettspetsen krävs ofta för att säkerställa att ingen hjärna har tagits bort av misstag från röret. Om hjärnor har misstag pipetteras i spetsen, fördela dem tillbaka i mikrocentrifug röret, vänta för hjärnor sedimentera och fortsätt sedan att ta bort eventuella extra PTN som förblir.</li>
	<li>Efter den sista snabba tvättningen, använda p1000 pipett för att utföra tre &#34; lång &#34; tvättar: Tillsätt 500 µL av PTN och tvätt för 20 min i rumstemperatur på en rocker/nutator. Alla framtida &#34; lång &#34; tvättar bör vara i 20 minuter. 
	Obs: Efter dessa tvättar, fast hjärnor kan komma att lagras över natten vid 4 ° C i PTN.</li>
	<li>Ta bort den sista tvättningen med p1000 pipett och inkubera hjärnor på en rocker eller nutator vid rumstemperatur i 0,5 mL blockerar lösning [PTN + 5% normala get serum (NGS)] för minst 30 min i rumstemperatur.
	<ol><li>Get sekundära antikroppar kommer att användas i efterföljande protokollstegen. Om sekundära antikroppar från en annan art kommer att användas, normala serum från det arter (snarare än NGS) bör användas för blockering och antikropp lösningarna.</li>
	</ol></li> <li>Med p1000 pipett bort blockerande lösning och lägga till den primära antikroppen utspätt i PTN (PTN + 5% NGS + utspädda primär antikropp). När du använder en primär antikropp för första gången, optimal utspädning av att antikroppar bör bestämmas empiriskt. 
	Obs: För att visualisera svamp kroppens nervceller, antikroppar erkänner Fas2 vanligtvis används. Dessa antikroppar är tillgängliga från den utvecklande studier Hybridomteknik Bank (DSHB) som antikropp 1 d 4 och bör vara utspädd 1:20 i PTN + 5% NGS. 
	Obs: För att visualisera ljusmätare nervceller, antikroppar erkänner chaoptin används normalt. Chaoptin antikroppar är tillgängliga från DSHB som antikropp 24B10 och bör vara utspädd 1:20 i PTN + 5% NGS. 
	Obs: Fixering processen vanligtvis eliminerar fluorescens från fluorescerande protein såsom grönt fluorescerande protein (GFP). Därför, när du använder MARCM för att analysera axonal vägledning av enskilda MB nervceller, använda en antikropp erkänner GFP.</li>
	<li>Inkubera hjärnor i primär antikropp lösning på en rocker/nutator 2-3 nätter på 4 ° C.</li>
	<li>Efter inkubation med primära antikroppar, tillåta hjärnor att bosätta sig i mikrocentrifug rörets botten och sedan ta bort primär antikropp lösningen.</li>
	<li>Med pipett p1000 utföra 2 &#34; snabb &#34; tvättar och 3 &#34; lång &#34; 20 min tvättar med 0,5 mL av PTN som beskrivs ovan i steg 4.4 och 4.5, noggrant så att brains för att kvitta självtryck längst ned i mikrocentrifug röret mellan varje wash.</li>
	<li>Inkubera hjärnor för 3 h vid rumstemperatur med lämpligt fluorescently-märkt sekundära antikroppar. Sekundära antikroppar är oftast utspädd i 0,5 mL PTN + 5% NGS vid en koncentration på 1: 200. 
	Obs: När fluorescerande sekundära antikroppar har lagts till, hjärnor bör hållas i mörkret för återstoden av experimentet. 
	Obs: I fallet kvarstående god Jordbrukarsed fluorescens förblir, när du utför MARCM analys det är tillrådligt att använda en sekundär antikropp märkt med en fluorophore med liknande excitation/utsläpp våglängder som GFP (t.ex., Fluoroscein isothyocyanate (FITC) eller Alexa488).</li>
	<li>Efter sekundär antikropp inkubation, tillåta hjärnor att bosätta sig i mikrocentrifug rörets botten och ta bort sekundär antikropp lösningen.</li>
	<li>Utför 2 &#34; snabb &#34; tvättar och 3 &#34; lång &#34; 20 min tvättar med 0,5 mL av PTN som beskrivs ovan i steg 4.4 och 4.5, noggrant så att brains för att kvitta längst ned i mikrocentrifug röret mellan varje wash.</li>
	<li>Efter tredje &#34; lång &#34; 20 min tvätt, användning p200 pipett ta bort så mycket buffert som möjligt.</li>
	<li>Lägga till 75 µL av fluorescerande anti fade monteringsmedium till hjärnan. Pipett hjärnor och monteringsmedium i pipettspetsen en gång att blanda. Inte Invertera röret eftersom hjärnor kan fastna på cap eller sidor av röret mikrocentrifug. 
	Obs: Efter upphävande av hjärnor i monteringsmedium, rör kan vara insvept i aluminiumfolie att sakta fluorophore snabbkylning och lagras vid 4 ° C över natten. Om nödvändigt, hjärnor kan förvaras i flera dagar vid 4 ° C, men bör helst monteras på bilder så snart som möjligt.</li>
</ol> 5. Montering vuxen D. melanogaster hjärnor på mikroskopet glider och Imaging <ol><li>bygga en &#34; bro &#34; bild. Placera två &#34; bas &#34; coverslips ungefär 1 cm mellanrum på en positivt laddad bild. Se till att den positivt laddade sidan av bilden är vänd uppåt. Följa coverslips till bild med nagel polska som visas i figur 3 A. Det är oftast bra att försegla varje bas täckglas med nagel polska att säkerställa montering media inte veken under dessa bas täckglas tre yttre kanter. Låt Nagel polska torka ordentligt (10-15 min) innan du fortsätter.</li>
	<li>Placera bilden under stereomikroskopet och Pipettera montering media lösningen innehållande dissekerade hjärnor i mellanrummet mellan de två coverslips. För att ge mer kontrast, det är användbart att manövrera svanhals lamporna så att de är parallella med arbetsbänk.</li>
	<li>Ta bort extra montering media från bilden med pipett, vara noga med att inte Pipettera hjärnor utanför bilden.</li>
	<li>Wick bort extra montering media. Detta gör att hjärnan kan placeras närmare under nästa steg.</li>
	<li>Med hjälp av ett par pincett och stereomikroskopet, placera hjärnor på bilden i ett rutmönster med antennal lober inför uppfostras</li>
	<li>Placera ett täckglas (den &#34; bron &#34;) över hjärnor ( figur 3 A). Använd Nagel polska för att täta sidorna av bron cover slip där de kontakta den &#34; bas &#34; täckglas.</li>
	<li>Med pipett p200 sakta fylla center hålrummet under bron med färska montering media ( figur 3 B). Placera en droppe i taget på den öppna kanten av det center täckglaset och tillåta montering media att veken under det center bridge täckglaset. Fortsätt tills hela hålrummet fylls med montering media, och sedan försegla toppen och botten med tydlig Nagel polska.</li>
	<li>När den Nagel polskt är torr, bild bilder omedelbart eller förvara i en ljustäta snäva bild låda vid -20 ° C.</li>
	<li>Inom en vecka, bild hjärnor med laserskanning confocal Mikroskop med excitation lasrar och filtrera kuber lämpligt att de valda fluorescerande sekundära antikropparna. Z-stack bilder av svamp kropp nervceller erhålls vanligtvis använder 20 X eller 40 X mål. Avbildning av retinal ljusmätare nervceller kan kräva högre förstoring.</li>
</ol>

Författarna förklarar att de har inga konkurrerande finansiella intressen.

Dissektion och visualisering metoden som beskrivs ovan kan användas i en mängd olika immunfärgning och leva bildhanteringsprogram. Vi har skisserat ett allmänt immunfärgning protokoll och har belyst ett sätt där MARCM kan användas för att visualisera axonal morfologi av enskilda svamp organ nervceller. Dessutom, dessa allmänna förfaranden kan också användas för imaging andra regioner i hjärnan i fasta eller nymalen dissekerade vuxen brains48,65. Levande imaging kan ge en effektivare strategi när man analyserar uttrycksmönster enhancer fällor, reporter gener eller härma linjer66, t.ex. Att förhindra att fånga artefakter från celldöd under levande avbildning av GFP i ofixerad vävnad, hjärnor bör dissekeras i 1 x fosfat buffrad saltlösning (PBS) eller HL3 media48, monterad på bron diabilder i 1 x PBS (eller HL3) och avbildas i mindre än 15-20 min. vård bör också tas bort så mycket luft som möjligt från dissekerade hjärnan före imaging, eftersom det kan störa visualisering av GFP fluorescens.
Medan färgning villkor vid bedömningen av morfologi av svamp kropp och ljusmätare nervceller är förhållandevis väletablerade24,61,67, lokalisering av ett specifikt protein av intresse i dessa cell typer kan kräva omfattande felsökning och optimering. I synnerhet bör flera kritiska steg, inklusive antikropp utspädning, blockerande buffert komponent koncentration och fixering, optimeras för att generera de mest reproducerbara och pålitliga resultat. Först, den optimala koncentrationen av primär antikropp bör fastställas. Även om kommersiellt tillgängliga antikroppar har ofta en föreslagna utspädning (och vi startar ofta initialt med att koncentration), är dessa värden sällan utifrån empiriskt Drosophila vävnader. Därför testning av en serie av primär antikropp utspädningar som utbud över och under tillverkarens start förslag ofta resulterar i mer specifik färgning. Medan primär antikropp utspädning kan ha en betydande inverkan på färgning noggrannhet och bör fastställas exakt, tid hjärnor inkuberas i primär antikropp innehållande kan lösningar variera avsevärt med liten effekt på det totala resultatet. Exempelvis har vi observerat liknande resultat när ruvning dissekerade hjärnor med Fas2 antikropp primära antikroppen för två, tre eller ännu fyra dagar vid 4 ° C. Även om vi rekommenderar minst två nätter, har vi också inkuberas hjärnor i primär antikropp lösning för en enda natt och erhålls reproducerbara färgning. Ännu viktigare, att begränsa mängden tid hjärnor inkuberas i den sekundära antikroppen i 3 timmar vid rumstemperatur (eller en natt vid 4 ° C) bidrar till gräns icke-specifik bindning av sekundära antikroppar att hjärnvävnaden.
Andra, kan det vara nödvändigt att använda ytterligare ”blockering” reagenser för att eliminera oönskad bakgrund signal. Alternativ inkluderar öka koncentrationen av NGS ~ 10%, att lägga till 1-10% bovint serumalbumin (BSA) den blockerande och primär/sekundär antikropp lösningar, eller före adsorption av primära antikroppar övernattning på 4 ° C med Drosophila embryon (se referera till68, avsnitt 2.9, steg 3).
Medan vi har skrivit det ovanstående protokoll använder PTN som det föreslagna buffert för alla fixering, kan tvätta, och antikropp inkubationsstegen, vävnad fixering i andra buffertar (såsom PLP och PEM, i Material tabell) leda till djupgående skillnader i signalstyrka. Till exempel har tidigare studier visat att cyklin E är omätbara i larval imaginal skivor när vävnader är i traditionella 4% PARAFORMALDEHYD utspätt i PBS, men syns tydligt när vävnader är i PLP buffert (Ken Moberg, personliga kommunikation och referens69). Förutom förändringar i buffert komponenter, ändring av tid och temperatur för vävnaden fixering kan också påverka Immunofluorescerande färgning och empiriskt kan bestämmas om det behövs. Generellt fixering tid bör vara tillräckligt lång för att möjliggöra tillräcklig crosslinking av cellulära komponenter och långsiktigt underhåll av övergripande cellulära morfologi samtidigt begränsas tillräckligt för att förhindra över-crosslinking och ”begrava” av protein epitoper. Därför när du initialt optimerar färgning villkor för en nyförvärvade primär antikropp, vi brukar begränsa fixering tid till ca 20 min och kommer ofta fixa vävnader vid kallare temperaturer.
Flera kontroller bör ingå i någon immunofluorescens-experiment för att undersöka specificiteten av primära och sekundära antikroppar samt effekten av transgener/genetiska bakgrunden på den observerade fenotypen. För att få klarhet i huruvida den primär antikropp används specifikt känner igen proteinet av intresse bör vävnad från flugor saknar detta protein och/eller vävnad överuttryck av proteinet inkluderas som kontroller. Tillägg av överskjutande renat antigen protein kan också ingå för att avgöra om den primär antikroppen känner igen andra epitoper i flyga hjärnan. Slutligen representerar någon närvarande när primära antikroppar utelämnas fluorescerande signal nivån på icke-specifik bindning av de valda sekundära antikropparna.
Flera viktiga kontroller bör också ingå för att utvärdera bidraget av genetisk bakgrund eller förekomsten av transgener till färgning intensitet eller neuronala morfologi. De flugor som används i MARCM experimentet i figur 5 innehåller exempelvis flera transgener (hsFLP, UAS-CD8-GFP, FRT82B, bubbelpool &#62; GAL80 och OK107-GAL4), som alla bör analyseras separat för effekter på svamp kropp morfologi. På ett minimum, svamp kropp morfologi av flugor bör som innehåller både OK107-GAL4 och UAS-CD8-GFP analyseras. Det kan också vara nödvändig för att bedöma effekten av värme chock och Flp recombinase produktion på svamp kropp utveckling genom att analysera flugor som innehåller både hsFLP och FRT82B. Även om MARCM kan ge betydande insikt om ett visst protein autonomt styr axonal vägledning, kan antalet kontroller som krävs för att korrekt göra denna slutsats vara en mindre begränsning av denna teknik. I mindre komplicerade experiment är liknande kontroller också tillämpliga. Ta till exempel ett experiment där GAL4/UAS systemet används i kombination med en RNAi transgenens knockdown uttryck av ett protein av intresse för alla nervceller. I detta experiment, minst två transgener kommer att närvara: en pan-neuronal GAL4 förare, såsom elav-GAL4, och den UAS-RNAi transgenens. Morfologi av svamp kropp nervceller i flugor som innehåller var och en av dessa transgener ensam bör utredas förutom det experimentella villkor där flugor harbor båda transgener i samma fluga.
Slutligen, för att avgöra huruvida proteinet av intresse uttrycks i svamp kropp nervceller är det oftast nödvändigt att samtidig fläcken hjärnor med antikroppar mot Fas2. Alternativt kan fluorescerande proteiner som GFP, RFP eller membranet bunden CD8-GFP också uttryckas med hjälp av GAL4/UAS -systemet och används i kombination med antikroppar som känner igen proteinet av intresse. Eftersom Fas2 erkänner bara fasciculated axoner som bildar svamp kropp α och β loberna, har användning av GAL4-driven, membran-bundna CD8-GFP varit särskilt användbar för märkning svamp kroppens nervceller.
Defekter i axonal vägledning ofta inte är 100% penetrant och även hjärnor av samma genotyp kan visa vissa variabilitet. Därför, när analysera nyligen genererade muterade alleler för defekter i svamp kropp eller ljusmätare pathfinding, en kombination av olika alleler och metoder bör användas. De flesta studier i litteraturen använder flera olika metoder för att undersöka huruvida ett protein har en cell-självständiga roll i kontrollen av axonal vägledning: jag) analys av pathfinding defekter i homozygot null flugor (helst med olika null alleler), ii) analys av pathfinding defekter i flugor som saknar proteinet av intresse endast i nervceller (oftast via RNAi), iii) MARCM analys av pathfinding defekter, och iv) rädda experiment där genen är åter uttryckt i nervceller i homozygot null flugor. Helst bör flera dussin hjärnor per genotyp analyseras för fel i neuronala morfologi.
Även om protokollet beskrivs här främst fokuserar på Immunofluorescerande lokalisering av proteiner inom fasta vävnad, utvecklas flera framtida tillämpningar av denna teknik till bild levande hjärnvävnad. När hjärnan är dissekerade (vanligen i cell kultur media), kan de sedan vara odlade i flera dagar vid 25 ° C. Dessa ex vivo culturing metoder utvecklas för att undersöka en mängd biologiska processer, såsom protein-aktivitet som främjar axon regeneration efter skador70,71, intracellulära signalering dynamics72, och neuronal utveckling73.

Även om Drosophila nervsystemet är mindre än hos människa och gnagare, ger dess komplexitet en kraftfull, lättillgänglig modell för att bättre förstå dess ryggradsdjur motsvarigheter. I många fall koda genomen hos ryggradsdjur och flyger mycket liknande proteiner som dikterar mekanismerna i nervsystemet utveckling. I själva verket krävs många av generna som för neuronal utveckling hos ryggradsdjur har orthologs i flugor, inklusive de inblandade i signalvägar som kontroll mallning, neurogenes och axonal vägledning1,2,3 ,4,5. Netrin är exempelvis en ligand som krävs för axonal vägledning hos däggdjur och D. melanogaster6,7,8. Medan netrin isolerades ursprungligen från embryonala chick hjärnans vävnad6, har efterföljande studier visat att netrin en roll bevarade under utvecklingen av embryonala centrala nervsystemet (CNS) i Drosophila8. Andra studier har använt genetiska skärmar i den embryonala Drosophila CNS för att identifiera bevarade ligander och receptorer som krävs för pathfinding i både Drosophila och ryggradsdjur9.
Medan embryonala flugan CNS har använts flitigt i förflutnan för att identifiera ligander, receptorer och Intracellulär signalering proteiner krävs för axonal vägledning8,9, har senaste arbete undersökt sätt på vilket många av dessa proteiner styr också pathfinding beslut under senare stadier av utveckling. Specifikt, har utredning av svamp kropp (MB) och retinal ljusmätare neuron utveckling (figur 1) gett insikt om mekanismerna som kontroll pathfinding, synaps bildas, axon beskärning och flera andra aspekter av neuronala utveckling10,11,12,13,14,15,16,17. Ljusmätare nervceller ansluta flyga näthinnan till regioner i den vuxna hjärnan kallas lamina och medulla och är kritiska för återutläggning visuell information till hjärnan (Recenserad av18,19), medan svamp kropp nervceller är centralt beläget i flyga hjärnan och krävs för inlärning och minne20,21. Både ljusmätare nervceller och de inneboende nervcellerna svamp organ, kallas Kenyon celler, utnyttja evolutionärt bevarade diffusible och kontakt-beroende axonal vägledning mekanismer för att hitta sina efter synaptic mål. Förutom att vara synliga i vuxna flugor, kan ljusmätare och MB nervceller också direkt visualiseras i larver och puppor med antikroppar eller reporter gener22,23,24,25. Möjligheten att enkelt visualisera dessa två uppsättningar av nervceller vid olika utvecklande tidpunkter har främjat deras användning som fantastiskt modeller för många aspekter av neuronal utveckling.
Förutom som används som en modell för att förstå mekanismerna bakom normala nervsystemet utveckling, har nyligen genomförda studier visat att flugor kan också fungera som korrekta modeller av en mängd olika sjukdomar, inklusive bräckliga X syndrom (FXS)26 , Intellektuella funktionshinder (ID)27,28,29,30,31, och andra32. Exempelvis för att studera den molekylära funktionen av ZC3H14, en gen som nyligen kopplade till människors intellektuella funktionshinder, vi skapade en flyga modell av ID med en null-allelen av flugan ZC3H14 ortholog, kallas Nab230. Flugor som saknar Nab2 har svår minne nedskrivningar och utökade poly(A) svansar, går igenom vad observeras hos patienter eller patienten härrör cell linjer33,34. Ännu viktigare, Visa flugor som saknar Nab2 också svår hjärnans morfologi defekter i deras vuxna svamp organ34, liknar vad som observerats i flugor som saknar genen syndrom FXS, FMR135. Flugor kan således tjäna som ett viktigt modellerar organism att studera både hjärnans normala utveckling och sjukdomar som stör den.
Slutligen, tillgängligheten till hög genomströmning metoder för att övervaka beteendet, kombinerat med det stora utbud av tillgängliga genetiska verktyg, se Drosophila modellorganism i valet för att identifiera de områden i hjärnan som styr komplexa beteenden, såsom lärande och minne, sömn, uppvaktning, törst och andra36,37,38,39. Ett särskilt användbart verktyg som är i mitten av en flyga genetikers ”verktygslåda” är GAL4/UAS systemet (figur 2). Detta system40,41 använder vävnad specifika uttryck för Gal4 transkriptionell aktivator för att öka uttrycket av gener eller transgener nedströms av en uppströms aktivera sekvens (UAS). Ändringar av detta system har gjort det möjligt för forskare att, till exempel kontrollera exakt retbarhet av specifika nervceller42,43, overexpress eller knock-down specifika gener av intresse44, 45, analysera i realtid kalcium dynamics i vivo46och express reporter gener att markera neuronala härstamningar41. Kombinationen av GAL4/UAS systemet med mitotisk rekombination också möjliggjorde skapandet av mosaik analysen med en Repressible Cell markör (MARCM) systemet12,47. MARCM har använts flitigt i enda neuron spårning för att identifiera de cellulära signalering komponenter som krävs för axonal vägledning12,47. Även om dessa och andra tekniker har lämnat ett antal värdefulla insikter om de cellulära mekanismer som krävs för nervsystemets funktion, kräver de flesta att Drosophila hjärnan först vara dissekeras; noggrann borttagning av hjärnan krävs att behålla rätt hjärnans morfologi och anslutning mönster mellan regioner i hjärnan. Följande protokoll använder svamp kropp och ljusmätare nervceller somexempel neuronala populationer som guidar dig genom dissektion och Immunofluorescerande färgning av vuxen Drosophila brains.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Microdissection forceps/tweezers</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>505-NM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard dishes</td>
			<td>Living Systems Instrumentation</td>
			<td>DD-50-S-BLK</td>
			<td>Available from amazon.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fas2 Antibody</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>1D4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chaoptin Antibody</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>24B10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP Antibody</td>
			<td>Aves Lab</td>
			<td>GFP-1010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa488 goat anti-mouse secondary antibody</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A-11001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa488 goat anti-chicken secondary antibody</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A-11039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa647 goat anti-mouse secondary antibody</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A-21236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20% paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscope Services</td>
			<td>RT15713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VectaShield</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>H-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperFrost Plus Slides</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>99-910-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12-553-454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na Phosphate Buffer monobasic</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S3139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na phosphate Buffer dibasic</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S3264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X 100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>X100-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fingernail polish</td>
			<td>Electron Microscope Services (EMS)</td>
			<td>72180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stereomicroscope</td>
			<td>Leica S6D with KL300 LED light source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9-well dish (spot plate)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89090-482</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nutator/rocker</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>22-363-152 or 88-861-041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35mm dish</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>32-103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>50-366-794</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipe</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>06-666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potential Fixation Buffers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTN Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.1M NaPhosphate, pH 7.2, 0.1% Triton-X-100, Typically make up 0.5 L of 0.1M NaPhosphate buffer and aliquote 50ml at a time as needed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PLP buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>2% paraformaldehyde, 0.01M NaI04, 0.075M Lysine, 0.037M NaPO4, pH 7.2, Dissolve 0.36 g lysine in 10 ml H2O + 7.5 ml 0.1 M NaH2PO4 pH 7.2 + 2.5 ml 0.1 M Na2HPO4 on ice. Immediately before use, mix 15 ml of this buffered lysine solution with 50 mg NaIO4 (sodium periodate) + 2ml of the 20% high grade paraformaldehyde (EMS) + 3ml H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEM buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.1M PIPES pH 7.0, 2mM MgS04, 1mM EGTA, This buffer can be conveniently made as a 2x stock and diluted with 8% paraformaldehyde (PFA) to give a final concentration of 4% PFA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fly Stocks available from Bloomington</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>elav (c155)-GAL4</td>
			<td></td>
			<td>BL458</td>
			<td>Pan-neuronal GAL4 driver</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>w*;;;OK107-GAL4</td>
			<td></td>
			<td>BL 854</td>
			<td>GAL4 driver for all mushroom body neurons (OK107-GAL4 insertion is on the 4th chromosome)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>y(1), w(67c23); c739-GAL4</td>
			<td></td>
			<td>BL 7362</td>
			<td>GAL4 driver for alpha and beta lobes (on 2nd chromosome)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>y(1), w(67c23); c739-GAL4, UAS-CD8-GFP</td>
			<td></td>
			<td>BL 64305</td>
			<td>GAL4 driver for alpha and beta lobes, also contains UAS-CD8-GFP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>w*; 201Y-GAL4</td>
			<td></td>
			<td>BL 4440</td>
			<td>GAL4 driver for primarily the gamma lobes of mushroom body (on 2nd chromosome)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>y(1), w(67c23); 201Y-GAL4, UAS-CD8-GFP</td>
			<td></td>
			<td>BL 64296</td>
			<td>GAL4 driver for mushroom body gamma lobes, also contains UAS-CD8-GFP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>w*, elav (c155)-GAL4, hsFLP; FRTG13, Tub&#62;Gal80/CyO</td>
			<td></td>
			<td>BL 5145</td>
			<td>MARCM stock, contains FRT site and GAL80 on 2nd chromosome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>w*, elav (c155)-GAL4, hsFLP, UAS-CD8-GFP</td>
			<td></td>
			<td>BL5146</td>
			<td>MARCM stock, contains hsFLP, pan-neuronal GAL4, and CD8-GFP on X chromosome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>y(1), w*, hsFLP, UAS-CD8-GFP;;FRT82B, Tub&#62;GAL80/TM3, Sb(1);OK107-GAL4</td>
			<td></td>
			<td>BL 44408</td>
			<td>MARCM stock for flipping 3rd chromosome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>y(1), w*, hsFLP, UAS-CD8-GFP;FRT40A, Tub&#62;GAL80;OK107-GAL4</td>
			<td></td>
			<td>BL44406</td>
			<td>MARCM stock for flipping 2nd chromosome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>w*, hsFLP, tub&#62;GAL80, FRT19A; UAS-CD8-GFP/CyO;;OK107-GAL4</td>
			<td></td>
			<td>BL 44407</td>
			<td>MARCM stock for flipping X chromosome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>y(1), w*; UAS-CD8-GFP/CyO</td>
			<td></td>
			<td>BL 5137</td>
			<td>GFP labels cell surface (CD8 is a transmembrane protein)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>y(1), w*; FRTG13, UAS-CD8-GFP</td>
			<td></td>
			<td>BL 5139</td>
			<td>MARCM stock, contains FRT site and CD8-GFP on 2nd chromosome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>y(1), w*, hsFLP, UAS-CD8-GFP; Pin(1)/CyO</td>
			<td></td>
			<td>BL 28832</td>
			<td>MARCM stock, contains hsFLP and CD8-GFP on X chromosome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>w*; FRTG13, Tub&#62;GAL80</td>
			<td></td>
			<td>BL 5140</td>
			<td>MARCM stock, contains FRT site and GAL80 on 2nd chromosome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>y(1), w*;; FRT82B, Tub&#62;GAL80</td>
			<td></td>
			<td>BL 5135</td>
			<td>MARCM stock, contains FRT site and GAL80 on 3rd chromosome</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dissection and immunofluorescent staining of mushroom body and photoreceptor neurons in adult drosophila melanogaster brains

Nervsystemet utveckling innebär en sekventiell serie händelser som samordnas av flera signalvägar och regleringsnät. Många av proteinerna som är involverade i dessa vägar är evolutionärt bevarade mellan däggdjur och andra Eukaryoter, såsom bananflugan Drosophila melanogaster, vilket tyder på att liknande organiserande principer finns under utvecklingen av dessa organismer. Ännu viktigare, har Drosophila använts i stor utsträckning att identifiera cellulära och molekylära mekanismer som reglerar processer som krävs i däggdjur inklusive neurogenes, differentiering, axonal vägledning och synaptogenes. Flugor har även använts framgångsrikt att modellera en mängd mänskliga nervsystemets sjukdomar. Här beskriver vi ett protokoll för den stegvisa lokalt, fixering och Immunofluorescerande lokalisering av proteiner inom den vuxna Drosophila -hjärnan. Detta protokoll fokuserar på två exempel neuronala populationer, svamp kroppens nervceller och näthinnans fotoreceptorer och innehåller valfria steg för att spåra enskilda svamp organ nervceller med hjälp av Mosaic analys med en Repressible Cell markör (MARCM)-teknik. Exempeldata från både vildtyp och muterade hjärnor visas tillsammans med en kort beskrivning av en poängkriterier för axonal vägledning defekter. Medan detta protokoll belyser två väletablerade antikroppar för att utreda morfologi av svamp kropp och ljusmätare nervceller, andra Drosophila hjärnregioner och lokalisering av proteiner inom andra områden i hjärnan kan också vara undersökt använder detta protokoll.

Watch this Scientific Journal Video about Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains at JoVE.com

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Det här protokollet beskriver den dissektion och immunfärgning av vuxen Drosophila melanogaster hjärnans vävnader. Specifikt, belyser detta protokoll användningen av Drosophila svamp kropp och ljusmätare nervceller som exempel neuronala delmängder som exakt kan användas till att avslöja de allmänna principerna för många aspekter av neuronal utveckling.

Dissektion och Immunofluorescerande färgning av svamp kropp och ljusmätare nervceller i vuxen Drosophila melanogaster hjärnor

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva

Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva

Analysera blodcellpopulationer av<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Larva

In vertebrates, hematopoiesis is regulated by inductive microenvironments (niches). Likewise, in the invertebrate model organism&#160;Drosophila ...

Rearing the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions

Rearing the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions

Uppfödning bananfluga<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Under axenisk och gnotobiotiska Villkor

The influence of microbes on myriad animal traits and behaviors has been increasingly recognized in recent years. The fruit fly Drosophila melanogaster is ...

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

Dissektion och färgning av Drosophila Pupp äggstockarna

Unlike adult Drosophila ovaries, pupal ovaries are relatively difficult to access and examine due to their small size, translucence, and encasing within a ...

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Upptining, odling och bevarandet Drosophila cellinjer

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the ...

Methods to Test Endocrine Disruption in Drosophila melanogaster

Methods to Test Endocrine Disruption in Drosophila melanogaster

Metoder för att testa endokrina störningar i Drosophila melanogaster

In recent years there has been growing evidence that all organisms and the environment are exposed to hormone-like chemicals, known as endocrine disruptor ...

Assay for Blood-brain Barrier Integrity in Drosophila melanogaster

Assay for Blood-brain Barrier Integrity in Drosophila melanogaster

Analys för blod-hjärnbarriären integritet i Drosophila melanogaster

Proper nervous system development includes the formation of the blood-brain barrier, the diffusion barrier that tightly regulates access to the nervous ...

Dissection and Live-Imaging of the Late Embryonic Drosophila Gonad

Dissection and Live-Imaging of the Late Embryonic Drosophila Gonad

Dissektion och live-avbildning av den sena embryonala Drosophila Gonad

The Drosophila melanogaster male embryonic gonad is an advantageous model to study various aspects of developmental biology including, but not limited to, ...

Imaging Live Brain Explants from Drosophila melanogaster Third Instar Larvae

Live-Cell Imaging of Drosophila melanogaster Third Instar Larval Brains

Investigating Asymmetric Cell Division Dynamics: A Protocol for Live-Imaging of Drosophila Larval Brain Explants (Video) | JoVE

Levande cellavbildning av Drosophila melanogaster Tredje Instar Larval Brains

Drosophila neural stem cells (neuroblasts, NBs hereafter) undergo asymmetric divisions, regenerating the self-renewing neuroblast, while also forming a ...

Detection and Quantification of Single mRNA Molecules in Drosophila

Studying Muscle Transcriptional Dynamics at Single-molecule Scales in Drosophila

Investigating mRNA Spatial Distribution in Drosophila Muscle Tissue (Video) | JoVE

Studerar muskeltranskriptionsdynamik på enmolekylskalor i Drosophila

Skeletal muscles are large syncytia made up of many bundled myofibers that produce forces and enable body motion. Drosophila is a classical model to study ...

﻿Staging and Collecting Drosophila melanogaster Third Instar Larvae

ï»¿Staging and Collecting Drosophila melanogaster Third Instar Larvae (Video) | JoVE 

Iscensättning och insamling av Drosophila melanogaster Tredje Instar larver