Name: application of multicolor flpout technique to study high resolution single cell morphologies and cell interactions of glia in drosophila
Uploaded: 2017-10-20T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Application of MultiColor FlpOut Technique to Study High Resolution Single Cell Morphologies and Cell Interactions of Glia in Drosophila at JoVE.com

Les auteurs remercient Arnim Jenett, Aljoscha Nern et autres membres du laboratoire Rubin pour les conseils et le partage des réactifs non publiées et le Janelia Fly lumière équipe projet pour générer des images confocales. Les auteurs remercient également les membres du laboratoire de Gaule pour commentaires sur le manuscrit.

1. préparation des mouches pour expériences MultiColor FlpOut (MCFO) Remarque : MCFO le technique se réfère à une version modifiée de l’excision de cassette Flp-mediated arrêt ce qu’on appelle (FlpOut). Transgéniques MCFO mouches portent un promoteur de choc thermique (hsp)-recombinase Flp et différents journalistes sous SAMU de contrôle. Chaque journaliste est constitué d’une ossature commune d’une myristoylated (myr) super dossier vert fluorescent protéine (sfGFP), dont ...

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	<li>Freeman, M. R., Doherty, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial+cell+biology+in+Drosophila+and+vertebrates.">Glial cell biology in Drosophila and vertebrates.</a> Trends Neurosci. 29 (2), 82-90 (2006).</li><li>Stork, T., Bernardos, R., Freeman, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+glial+cell+development+and+function+in+Drosophila.">Analysis of glial cell development and function in Drosophila.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2012 (1), 1-17 (2012).</li><li>Corty, M. M., Freeman, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+biology+in+neuroscience:+Architects+in+neural+circuit+design:+Glia+control+neuron+numbers+and+connectivity.">Cell biology in neuroscience: Architects in neural circuit design: Glia control neuron numbers and connectivity.</a> J Cell Biol. 203 (3), 395-405 (2013).</li><li>Hidalgo, A., Kato, K., Sutcliffe, B., McIlroy, G., Bishop, S., Alahmed, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trophic+neuron-glia+interactions+and+cell+number+adjustments+in+the+fruit+fly.">Trophic neuron-glia interactions and cell number adjustments in the fruit fly.</a> Glia. 59 (9), 1296-1303 (2011).</li><li>Liu, J., Speder, P., Brand, A. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+new+site-specific+recombinases+for+use+in+manipulating+animal+genomes.">Multiple new site-specific recombinases for use in manipulating animal genomes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (34), 14198-14203 (2011).</li><li>Nern, A., Pfeiffer, B. D., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+tools+for+multicolor+stochastic+labeling+reveal+diverse+stereotyped+cell+arrangements+in+the+fly+visual+system.">Optimized tools for multicolor stochastic labeling reveal diverse stereotyped cell arrangements in the fly visual system.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (22), E2967-E2976 (2015).</li><li>Viswanathan, S., Williams, M. E., Bloss, E. B., Stasevich, T. J., Speer, C. M., Nern, A., Pfeiffer, B. D., Hooks, B. M., Li, W. P., English, B. P., Tian, T., Henry, G. L., Macklin, J. J., Patel, R., Gerfen, C. R., Zhuang, X., Wang, Y., Rubin, G. M., Looger, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-performance+probes+for+light+and+electron+microscopy.">High-performance probes for light and electron microscopy.</a> Nat Methods. 12 (6), 568-576 (2015).</li><li>Livet, J., Weissman, T. A., Kang, H., Draft, R. W., Lu, J., Bennis, R. A., Sanes, J. R., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+strategies+for+combinatorial+expression+of+fluorescent+proteins+in+the+nervous+system.">Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system.</a> Nature. 450 (7166), 56-62 (2007).</li><li>Hampel, S., Chung, P., McKellar, C. E., Hall, D., Looger, L. L., Simpson, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+Brainbow:+A+recombinase-based+fluorescence+labeling+technique+to+subdivide+neural+expression+patterns.">Drosophila Brainbow: A recombinase-based fluorescence labeling technique to subdivide neural expression patterns.</a> Nat Methods. 8 (3), 253-259 (2011).</li><li>Hadjieconomou, D., Rotkopf, S., Alexandre, C., Bell, D. M., Dickson, B. J., Salecker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flybow:+Genetic+multicolor+cell+labeling+for+neural+circuit+analysis+in+Drosophila+melanogaster.">Flybow: Genetic multicolor cell labeling for neural circuit analysis in Drosophila melanogaster.</a> Nat Methods. 8 (3), 260-266 (2011).</li><li>Kremer, M. C., Jung, C., Batelli, S., Rubin, G. M., Gaul, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+glia+of+the+adult+Drosophila+nervous+system.">The glia of the adult Drosophila nervous system.</a> Glia. 65 (4), 606-638 (2017).</li></ol>

Ce protocole décrit une méthode simple et efficace afin d’étudier la morphologie des différents types de cellules dans un tissu d’intérêt à haute résolution. Avec la technique MCFO, plusieurs reporters avec étiquettes d’épitope différents sont utilisés en combinaison pour multicolor étiquetage stochastique (Figure 2). Semblable à d’autres méthodes telles que Brainbow/Flybow15,16,17<...

Glia, la population de cellules non neuronales du système nerveux (NS), ont longtemps cru à fournir un cadre statique pour les neurones et n’ont donc pas été étudiées en détail. Cependant, chez les humains, cellules gliales constituent la grande majorité des cellules dans le NS (~ 90 %) et entrent dans plusieurs catégories, y compris les astrocytes, les oligodendrocytes, la microglie et les cellules de Schwann. Chez la drosophile, cellules gliales constituent environ 10 % des cellules dans le NS. Curieusement, leurs morphologies et leurs fonctions sont remarquablement similaires à ceux trouvés chez les vertébrés1,2. Leurs morphologies comprennent la barrière hémato - encéphalique (BHE) formant des épithéliums, engainantes et cellules semblables à des astrocytes.
Drosophila système nerveux central (SNC) se compose des structures principales suivantes : régions de cortex qui contiennent les corps cellulaires neurones ; neuropils hébergeant des connexions synaptiques ; tracts axon petits et grands qui relient les différents neuropiles ; nerfs périphériques qui se connectent les organes sensoriels et les muscles avec le système nerveux central (Figure 1). Cellules gliales se trouvent associés à toutes ces structures anatomiques : Cortex cellules gliales (CG) dans les régions corticales, astrocyte ressemblant cellules gliales (ALG) et engainantes glia (EG) dans les régions de neuropile, engainantes glia sont aussi associés aux tracts axon central et périphérique nerfs (EGN) et enfin, deux feuillet glia, périneurale glia (PG) et subperineurial (SPG), qui ensemble forment une couche contigue qui recouvre l’ensemble NS (Figure 2).
Des études antérieures ont montré que glia jouent un rôle important dans le développement de la NS ; elles surveillent nombre de cellules neuronales en réagissant à la circulation systémique insuline-like peptides, soutiennent trophique aux neurones, tels que la navette de lactate astrocyte-neurone et éliminer les neurones mourants par phagocytose3,4 , 5 , 6. dans le NS mature, cellule gliale maintenir la BHE, relever les neurotransmetteurs et maintenir l’homéostasie ionique, agissent comme les grandes cellules immunitaires dans le NS, étant donné que les macrophages ne peuvent violer la BHE et moduler l’activité synaptique comme comportement animal6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11.
Si les différents sous-types gliales fonctions spécialisées importante question reste ouverte. Cependant, une analyse systématique de tout le génome des cellules gliales, surtout chez l’adulte, a été entravée par un manque d’outils génétiques appropriés pour leur manipulation. Ici, on présente une méthode qui permet la caractérisation facile et efficace des formes cellulaires pour étudier les interactions cellule-cellule complexe. Cette technique a été utilisée pour caractériser la morphologie des différents sous-types gliales dans le cerveau de drosophile adulte, mais, selon le pilote spécifique de GAL4 utilisé, il pourrait être adapté pour étudier les neurones12,13 , tout type de cellules entremêlant et en principe n’importe quel tissu dans des stades de développement.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Grant</td>
			<td>GD100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR tubes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72.737.002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>11251-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting dish 30 mm x 12 mmm</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>70543-30</td>
			<td>Glass dissection dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrex 3 Depression Glass Spot Plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>7223-34</td>
			<td>Glass dissection plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard Black</td>
			<td>SYLGARD, Sigma-Aldrich</td>
			<td>805998</td>
			<td>home made with charcoal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ExpressFive S2 cell culture medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10486-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20% PFA</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Roth</td>
			<td>3051.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal goat serum</td>
			<td>Jackson Laboratories</td>
			<td>005-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal donkey serum</td>
			<td>Jackson Laboratories</td>
			<td>017-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit HA-tag</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>C29F4</td>
			<td>Primary antibody, dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat FLAG-tag</td>
			<td>Novus Biologicals</td>
			<td>NBP1-06712</td>
			<td>Primary antibody, dilution 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse V5-tag:DyLight 549</td>
			<td>AdSerotec</td>
			<td>0411</td>
			<td>Conjugated antibody, dilution 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-rabbit AlexaFluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11034</td>
			<td>Secondary antibody, dilution 1:250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-rat DyLight 647</td>
			<td>Jackson Laboratories</td>
			<td>712-605-153</td>
			<td>Secondary antibody, dilution 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vecta Shield</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SlowFate Gold</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>S36937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secure Seal Spacer</td>
			<td>Grace Biolabs</td>
			<td></td>
			<td>Contact company for ordering</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope cover glass 22 X 60 mm</td>
			<td>Marienfeld</td>
			<td>101152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope cover glass 22 x 22 mm</td>
			<td>Roth</td>
			<td>H874</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo Microscope, Leica MZ6</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal laser scanning microscope LSM710</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersol</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>518 F</td>
			<td>Immersion oil for fluorescence-microscopy, halogen free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersol</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>W 2010</td>
			<td>Immersion fluid for water-immersion objectives, halogen free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R56F03-GAL4 (EG)</td>
			<td>Bloomington Stock Center</td>
			<td>39157</td>
			<td>GAL4 driver</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R86E01-GAL4 (ALG)</td>
			<td>Bloomington Stock Center</td>
			<td>45914</td>
			<td>GAL4 driver</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hspFlpPestOpt; UAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-HA, UAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-FLAG, UAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-V5</td>
			<td>Bloomington Stock Center</td>
			<td>64085</td>
			<td>UAS reporter (https://bdscweb.webtest.iu.edu/stock/misc/mcfo.php)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji (Image J)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Image analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi Time Macro</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Software for automated scanning</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

application of multicolor flpout technique to study high resolution single cell morphologies and cell interactions of glia in drosophila

Les cellules affichent différentes morphologies et relations anatomiques complexes. Comment les cellules interagissent avec leurs voisins ? Les interactions diffèrent-ils entre les types de cellules ou même au sein d’un type donné ? Quels types de règles spatiales ils suivent ? Les réponses à ces questions fondamentales in vivo ont été entravés jusqu'à présent par un manque d’outils pour l’étiquetage de cellule unique de haute résolution. Ici, un protocole détaillé pour cibler les cellules individuelles avec une technique de FlpOut MultiColor (MCFO) est fourni. Cette méthode s’appuie sur trois marqués différemment reporters (HA, drapeau et V5) sous contrôle de l’UAS qui restent silencieux d’un terminateur transcriptionnel, flanqué de deux sites FRT (FRT-stop-FRT). Une impulsion de choc thermique induit l’expression d’une recombinase Flp de chaleur d’induite par le choc, qui enlève au hasard les cassettes de FRT-stop-FRT dans des cellules individuelles : expression se produit uniquement dans les cellules qui expriment également un pilote de GAL4. Cela conduit à une matrice de cellules colorées différemment d’un type donné de cellules qui permet la visualisation des morphologies de cellules individuelles à haute résolution. À titre d’exemple, la technique MCFO est cumulable avec les pilotes de GAL4 gliales spécifiques pour visualiser les morphologies des différents sous-types gliales dans le cerveau adulte de la drosophile .

Cette section illustre des exemples de résultats qui peuvent être obtenus en utilisant la technique MCFO dans le cerveau adulte de la drosophile . La figure 3 montre une représentation schématique de la méthode. Trois marqués différemment membrane reporters (myr-smGFP-HA, myr-smGFP-drapeau et myr-smGFP-V5) sous contrôle de l’UAS restent silencieux d’un terminateur transcriptionnel, flanqué de deux sites FRT (FRT-stop-F...

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Application of MultiColor FlpOut Technique to Study High Resolution Single Cell Morphologies and Cell Interactions of Glia in Drosophila

Les cellules affichent différentes morphologies et établissent une variété d’interactions avec leurs voisins. Ce protocole décrit comment révéler la morphologie des cellules individuelles et d’étudier les interactions cellule-cellule en utilisant le système d’expression de Gal4/UAS bien établi.

Application de MultiColor FlpOut Technique pour étudier les Morphologies de cellule unique de haute résolution et Interactions cellulaires des cellules gliales chez la drosophile

Cells display different morphologies and complex anatomical relationships. How do cells interact with their neighbors? Do the interactions differ between ...

Research

JoVE Journal

Behavior

Application of MultiColor FlpOut Technique to Study High Resolution Single Cell Morphologies and Cell Interactions of Glia in Drosophila

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Évaluation et d&#39;évaluation du risque néonatal haut: L&#39;échelle Neurobehavioral USIN réseau

There has been a long-standing interest in the assessment of the neurobehavioral integrity of the newborn infant.  The NICU Network Neurobehavioral Scale ...

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