Name: application of multicolor flpout technique to study high resolution single cell morphologies and cell interactions of glia in drosophila
Uploaded: 2017-10-20T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Application of MultiColor FlpOut Technique to Study High Resolution Single Cell Morphologies and Cell Interactions of Glia in Drosophila at JoVE.com

Die Autoren danken Arnim Jenett, Aljoscha Nern und anderen Mitgliedern des Rubin-Labors für Beratung und Austausch von unveröffentlichten Reagenzien und Janelia fliegen Licht Projektteam für konfokale Bilder zu erzeugen. Die Autoren danken auch die Mitglieder von Gallien Labor für Kommentare auf das Manuskript.

1. Vorbereitung fliegen für mehrfarbige FlpOut (MCFO) Experimente Hinweis: die MCFO Technik bezieht sich auf eine modifizierte Version der so genannten Flp-vermittelten Stop Kassette Exzision (FlpOut). Transgene MCFO fliegen tragen einen Hitze-Schock-Promotor (Hsp)-Flp Rekombinase und andere Reporter unter UAS zu kontrollieren. Jeder Reporter besteht aus einer gemeinsamen Rückgrat einer Myristoylated (Myr) super Ordner grün fluoreszierenden Proteins (SfGFP), in welcher 10 Exemplare eines Ep...

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	<li>Freeman, M. R., Doherty, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial+cell+biology+in+Drosophila+and+vertebrates.">Glial cell biology in Drosophila and vertebrates.</a> Trends Neurosci. 29 (2), 82-90 (2006).</li><li>Stork, T., Bernardos, R., Freeman, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+glial+cell+development+and+function+in+Drosophila.">Analysis of glial cell development and function in Drosophila.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2012 (1), 1-17 (2012).</li><li>Corty, M. M., Freeman, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+biology+in+neuroscience:+Architects+in+neural+circuit+design:+Glia+control+neuron+numbers+and+connectivity.">Cell biology in neuroscience: Architects in neural circuit design: Glia control neuron numbers and connectivity.</a> J Cell Biol. 203 (3), 395-405 (2013).</li><li>Hidalgo, A., Kato, K., Sutcliffe, B., McIlroy, G., Bishop, S., Alahmed, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trophic+neuron-glia+interactions+and+cell+number+adjustments+in+the+fruit+fly.">Trophic neuron-glia interactions and cell number adjustments in the fruit fly.</a> Glia. 59 (9), 1296-1303 (2011).</li><li>Liu, J., Speder, P., Brand, A. 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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mystery+and+magic+of+glia:+a+perspective+on+their+roles+in+health+and+disease.">The mystery and magic of glia: a perspective on their roles in health and disease.</a> Neuron. 60 (3), 430-440 (2008).</li><li>Edenfeld, G., Stork, T., Klambt, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuron-glia+interaction+in+the+insect+nervous+system.">Neuron-glia interaction in the insect nervous system.</a> Curr Opin Neurobiol. 15 (1), 34-39 (2005).</li><li>Oland, L. A., Tolbert, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Key+interactions+between+neurons+and+glial+cells+during+neural+development+in+insects.">Key interactions between neurons and glial cells during neural development in insects.</a> Annu Rev Entomol. 48, 89-110 (2003).</li><li>Stork, T., Sheehan, A., Tasdemir-Yilmaz, O. E., Freeman, M. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+new+site-specific+recombinases+for+use+in+manipulating+animal+genomes.">Multiple new site-specific recombinases for use in manipulating animal genomes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (34), 14198-14203 (2011).</li><li>Nern, A., Pfeiffer, B. D., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+tools+for+multicolor+stochastic+labeling+reveal+diverse+stereotyped+cell+arrangements+in+the+fly+visual+system.">Optimized tools for multicolor stochastic labeling reveal diverse stereotyped cell arrangements in the fly visual system.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (22), E2967-E2976 (2015).</li><li>Viswanathan, S., Williams, M. E., Bloss, E. B., Stasevich, T. J., Speer, C. M., Nern, A., Pfeiffer, B. D., Hooks, B. M., Li, W. P., English, B. P., Tian, T., Henry, G. L., Macklin, J. J., Patel, R., Gerfen, C. R., Zhuang, X., Wang, Y., Rubin, G. M., Looger, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-performance+probes+for+light+and+electron+microscopy.">High-performance probes for light and electron microscopy.</a> Nat Methods. 12 (6), 568-576 (2015).</li><li>Livet, J., Weissman, T. A., Kang, H., Draft, R. W., Lu, J., Bennis, R. A., Sanes, J. R., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+strategies+for+combinatorial+expression+of+fluorescent+proteins+in+the+nervous+system.">Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system.</a> Nature. 450 (7166), 56-62 (2007).</li><li>Hampel, S., Chung, P., McKellar, C. E., Hall, D., Looger, L. L., Simpson, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+Brainbow:+A+recombinase-based+fluorescence+labeling+technique+to+subdivide+neural+expression+patterns.">Drosophila Brainbow: A recombinase-based fluorescence labeling technique to subdivide neural expression patterns.</a> Nat Methods. 8 (3), 253-259 (2011).</li><li>Hadjieconomou, D., Rotkopf, S., Alexandre, C., Bell, D. M., Dickson, B. J., Salecker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flybow:+Genetic+multicolor+cell+labeling+for+neural+circuit+analysis+in+Drosophila+melanogaster.">Flybow: Genetic multicolor cell labeling for neural circuit analysis in Drosophila melanogaster.</a> Nat Methods. 8 (3), 260-266 (2011).</li><li>Kremer, M. C., Jung, C., Batelli, S., Rubin, G. M., Gaul, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+glia+of+the+adult+Drosophila+nervous+system.">The glia of the adult Drosophila nervous system.</a> Glia. 65 (4), 606-638 (2017).</li></ol>

Dieses Protokoll beschreibt eine einfache und effiziente Methode, um die Morphologie der verschiedenen Zelltypen innerhalb eines Gewebes von Interesse in hoher Auflösung zu studieren. Mit der MCFO Technik mehrere Reporter mit verschiedenen Epitop-Tags in Kombination multicolor stochastische Kennzeichnung (Abbildung 2) dienen. Ähnlich wie bei anderen Methoden wie Brainbow/Flybow15,16,17, MCFO erhö...

Glia, der nicht-neuronale Zellpopulation des Nervensystems (NS), waren lange geglaubt, um einen statischen Rahmen für Neuronen und wurden daher nicht im Detail untersucht. Jedoch beim Menschen, Glia bilden die überwiegende Mehrheit der Zellen in der NS (~ 90 %) und fallen in verschiedene Kategorien, darunter Astrozyten, Oligodendrozyten, Mikroglia und Schwann-Zellen. In DrosophilaGlia sind etwa 10 % der Zellen in der NS. Faszinierenderweise sind ihren Morphologien und Funktionen bemerkenswert ähnlich denen in Wirbeltieren1,2. Ihre Morphologien gehören Blut - Hirn-Schranke (BBB) Epithelien, Ensheathing und Astrozyten-wie Zellen bilden.
Die Drosophila Zentralnervensystem (ZNS) besteht aus folgenden Grundstrukturen: Cortex-Regionen, die enthalten die neuronalen Zellkörpern; Neuropils, die synaptische Verbindungen zu beherbergen; kleine und große Axon Traktate, die die verschiedenen Neuropiles zu verbinden; periphere Nerven, die Sinnesorgane und Muskeln mit CNS (Abbildung 1) zu verbinden. Glia sind assoziiert mit diesen anatomischen Strukturen gefunden: Cortex Glia (CG) in den kortikalen Regionen, Astrozyten-ähnliche Glia (ALG) und Ensheathing Glia (EG) in den Neuropile Regionen, Ensheathing Glia sind auch zentrale Axon Traktate und peripheren zugeordnet Nerven (EGN), und schließlich zwei folienartigen Glia, perineurial Glia (PG) und subperineurial (SPG), die zusammen bilden eine zusammenhängenden Schicht, die die gesamte NS (Abbildung 2) abdeckt.
Frühere Studien haben gezeigt, dass Gliazellen spielen eine wichtige Rolle bei der Entwicklung der NS; Sie überwachen neuronale Zelle Zahlen durch Reaktion auf systemisch zirkulierende Insulin-Like-Peptide, Neuronen, wie z. B. die Astrozyten-Neuron-Laktat-Shuttle, trophische unterstützen und beseitigen sterbende Neuronen durch Phagozytose3,4 , 5 , 6. in die Reife NS Glia pflegen die BBB Neurotransmitter nehmen Ionischen Homöostase aufrechtzuerhalten, und fungieren als wichtigeren Immunzellen in der NS, da Makrophagen nicht die BBB verletzen und synaptische Aktivität sowie das Verhalten der Tiere6 moduliert , 7 , 8 , 9 , 10 , 11.
Ob der glialen Subtypen spezialisierte Funktionen ausführen, bleibt eine wichtige offene Frage. Jedoch wurde eine systematische genomweite Analyse der Glia, vor allem bei den Erwachsenen, durch einen Mangel an geeigneten genetischen Tools für ihre Handhabung behindert. Hier ist eine Methode, die ermöglicht die effiziente und einfache Charakterisierung der Zellformen zu komplexen Zellezelle Interaktionen zu untersuchen präsentiert. Diese Technik wurde zur Charakterisierung der Morphologie der glialen Subtypen im erwachsenen Gehirn Drosophila angewandt, aber abhängig von den jeweiligen GAL4-Treiber verwendet, es kann angepasst werden, um Neuronen12,13 studieren , jede Art von Vermischung Zellen und im Prinzip jedes Gewebe in alle Entwicklungsstadien.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Grant</td>
			<td>GD100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR tubes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72.737.002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>11251-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting dish 30 mm x 12 mmm</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>70543-30</td>
			<td>Glass dissection dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrex 3 Depression Glass Spot Plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>7223-34</td>
			<td>Glass dissection plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard Black</td>
			<td>SYLGARD, Sigma-Aldrich</td>
			<td>805998</td>
			<td>home made with charcoal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ExpressFive S2 cell culture medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10486-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20% PFA</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Roth</td>
			<td>3051.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal goat serum</td>
			<td>Jackson Laboratories</td>
			<td>005-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal donkey serum</td>
			<td>Jackson Laboratories</td>
			<td>017-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit HA-tag</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>C29F4</td>
			<td>Primary antibody, dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat FLAG-tag</td>
			<td>Novus Biologicals</td>
			<td>NBP1-06712</td>
			<td>Primary antibody, dilution 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse V5-tag:DyLight 549</td>
			<td>AdSerotec</td>
			<td>0411</td>
			<td>Conjugated antibody, dilution 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-rabbit AlexaFluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11034</td>
			<td>Secondary antibody, dilution 1:250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-rat DyLight 647</td>
			<td>Jackson Laboratories</td>
			<td>712-605-153</td>
			<td>Secondary antibody, dilution 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vecta Shield</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SlowFate Gold</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>S36937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secure Seal Spacer</td>
			<td>Grace Biolabs</td>
			<td></td>
			<td>Contact company for ordering</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope cover glass 22 X 60 mm</td>
			<td>Marienfeld</td>
			<td>101152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope cover glass 22 x 22 mm</td>
			<td>Roth</td>
			<td>H874</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo Microscope, Leica MZ6</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal laser scanning microscope LSM710</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersol</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>518 F</td>
			<td>Immersion oil for fluorescence-microscopy, halogen free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersol</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>W 2010</td>
			<td>Immersion fluid for water-immersion objectives, halogen free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R56F03-GAL4 (EG)</td>
			<td>Bloomington Stock Center</td>
			<td>39157</td>
			<td>GAL4 driver</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R86E01-GAL4 (ALG)</td>
			<td>Bloomington Stock Center</td>
			<td>45914</td>
			<td>GAL4 driver</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hspFlpPestOpt; UAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-HA, UAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-FLAG, UAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-V5</td>
			<td>Bloomington Stock Center</td>
			<td>64085</td>
			<td>UAS reporter (https://bdscweb.webtest.iu.edu/stock/misc/mcfo.php)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji (Image J)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Image analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi Time Macro</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Software for automated scanning</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

application of multicolor flpout technique to study high resolution single cell morphologies and cell interactions of glia in drosophila

Zellen zeigen unterschiedliche Morphologien und komplexen anatomischen Verhältnisse. Wie interagieren die Zellen mit ihren Nachbarn? Unterscheiden sich die Wechselwirkungen zwischen Zelltypen oder sogar innerhalb eines bestimmten Typs? Welche Arten von räumlichen Regeln folgen sie? Die Antworten auf solche grundlegenden Fragen in Vivo haben bisher durch einen Mangel an Tools für hochauflösende Einzelzelle Kennzeichnung behindert worden. Hier steht ein detailliertes Protokoll auf einzelne Zellen mit einer mehrfarbigen FlpOut (MCFO) Technik zur Verfügung. Diese Methode beruht auf drei unterschiedlich tagged Reporter (HA, Flagge und V5) unter FH-Kontrolle, die durch einen transkriptionelle Terminator, flankiert von zwei FRT Standorte (FRT-Stop-FRT) still gehalten werden. Ein Hitze-Schock-Puls induziert die Expression von einer Hitze Schock-induzierte Flp Rekombinase, die nach dem Zufallsprinzip die FRT-Stop-FRT-Kassetten in einzelnen Zellen entfernt: Ausdruck tritt nur in Zellen, die auch einen GAL4-Fahrer zum Ausdruck bringen. Dies führt zu einer Reihe von unterschiedlich gefärbten Zellen von einem bestimmten Zelltyp, der die Visualisierung der einzelnen Zelle Morphologien in hoher Auflösung ermöglicht. Als Beispiel kann die MCFO Technik mit spezifischen Glia GAL4-Treibern, die Morphologien der glialen Subtypen im erwachsenen Gehirn Drosophila zu visualisieren kombiniert werden.

Dieser Abschnitt zeigt Beispiele für Ergebnisse, die mithilfe der MCFO-Technik im erwachsenen Gehirn Drosophila abgerufen werden können. Abbildung 3 zeigt eine schematische Darstellung der Methode. Drei unterschiedlich Membran-Tags Reporter (Myr-SmGFP-HA, Myr-SmGFP-FLAG und Myr-SmGFP-V5) unter Kontrolle der FH sind durch einen transkriptionelle Terminator, flankiert von zwei FRT Standorte (FRT-Stop-FRT) geschwiegen. Ein Hitze-Sch...

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Application of MultiColor FlpOut Technique to Study High Resolution Single Cell Morphologies and Cell Interactions of Glia in Drosophila

Zellen zeigen unterschiedliche Morphologien und eine Vielzahl von Interaktionen mit ihren Nachbarn zu etablieren. Dieses Protokoll beschreibt, die Morphologie der Einzelzellen zu offenbaren und Zell-Zell-Interaktion mithilfe der etablierten Gal4/UAS-Expressionssystem zu untersuchen.

Anwendung von mehrfarbigen FlpOut Technik, hochauflösende Einzelzelle Morphologien und Zell-Interaktionen der Glia in Drosophila studieren

Cells display different morphologies and complex anatomical relationships. How do cells interact with their neighbors? Do the interactions differ between ...

Research

JoVE Journal

Behavior

Application of MultiColor FlpOut Technique to Study High Resolution Single Cell Morphologies and Cell Interactions of Glia in Drosophila

Assessment and Evaluation of the High Risk Neonate: The NICU Network Neurobehavioral Scale

Bewertung und Evaluierung der High Risk Neugeborene: Die Neugeborenen-Intensivstation Netzwerk Neuropsychologische Skala

There has been a long-standing interest in the assessment of the neurobehavioral integrity of the newborn infant.  The NICU Network Neurobehavioral Scale ...

Forschung

Verhalten

A Procedure to Study the Effect of Prolonged Food Restriction on Heroin Seeking in Abstinent Rats

Eine Vorgehensweise, um die Wirkung von Längerer Essen Beschränkung Heroin suche in abstinent Ratten untersucht

In human drug addicts, exposure to drug-associated cues or environments that were previously associated with drug taking can trigger relapse during ...

Study Motor Skill Learning by Single-pellet Reaching Tasks in Mice

Studie Motorik Lernen durch Einzel-Pellet Erreichen Aufgaben in Mäuse

Reaching for and retrieving objects require precise and coordinated motor movements in the forelimb. When mice are repeatedly trained to grasp and ...

Uncovering Beat Deafness: Detecting Rhythm Disorders with Synchronized Finger Tapping and Perceptual Timing Tasks

Aufdecken Schlag Taubheit: Entdecken Rhythmusstörungen mit Synchronized Finger Tapping und Wahrnehmungszeit Aufgaben

A set of behavioral tasks for assessing perceptual and sensorimotor timing abilities in the general population (i.e., non-musicians) is presented here ...

A Novel Approach to Assess Motor Outcome of Deep Brain Stimulation Effects in the Hemiparkinsonian Rat: Staircase and Cylinder Test

Ein neuer Ansatz Motor Ergebnis der tiefen Hirnstimulation Effekte in der Hemiparkinsonian Rat zur Bewertung: Treppe und Zylinder-Test

Deep brain stimulation of the subthalamic nucleus is an effective treatment option for Parkinson&#39;s disease. In our lab we established a protocol to ...

Reversible Cooling-induced Deactivations to Study Cortical Contributions to Obstacle Memory in the Walking Cat

Reversible Kühlung-induzierte Deaktivierungen kortikalen Beiträge zum Hindernis Speicher in der zu Fuß Katze zu studieren

On complex, naturalistic terrain, sensory information about an environmental obstacle can be used to rapidly adjust locomotor movements for avoidance. For ...

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Kombination von quantitativer Nahrungsaufnahme Assays und zwangsweise Aktivierung von Neuronen um Appetit in Drosophila studieren

Food consumption is under the tight control of the brain, which integrates the physiological status, palatability, and nutritional contents of the food, ...

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Beurteilung der Kohärenz der kurzen Erzählungen der Eltern über ihr Kind mithilfe des fünfminütigen Sprachbeispielverfahrens

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