Name: application of multicolor flpout technique to study high resolution single cell morphologies and cell interactions of glia in drosophila
Uploaded: 2017-10-20T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Application of MultiColor FlpOut Technique to Study High Resolution Single Cell Morphologies and Cell Interactions of Glia in Drosophila at JoVE.com

Os autores agradecer Arnim Jenett Aljoscha Nern e outros membros do laboratório Rubin para aconselhamento e partilha de reagentes inéditos e Janelia voar luz equipe do projeto para a geração de imagens confocal. Os autores também agradecer aos membros do laboratório Gália para comentários sobre o manuscrito.

1. moscas preparando-se para experiências MultiColor FlpOut (MCFO) Nota: técnica de The MCFO refere-se a uma versão modificada da excisão de gaveta mediada por Flp parada chamado (FlpOut). Transgénicas MCFO moscas carregam um promotor de choque térmico (hsp)-recombinase Flp e repórteres diferentes sob UAS controlam. Cada repórter consiste de um backbone comum de um myristoylated (myr) super pasta verde proteína fluorescente (sfGFP), no quais 10 cópias de uma marca de epítopo (EG...

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	<li>Freeman, M. R., Doherty, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial+cell+biology+in+Drosophila+and+vertebrates.">Glial cell biology in Drosophila and vertebrates.</a> Trends Neurosci. 29 (2), 82-90 (2006).</li><li>Stork, T., Bernardos, R., Freeman, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+glial+cell+development+and+function+in+Drosophila.">Analysis of glial cell development and function in Drosophila.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2012 (1), 1-17 (2012).</li><li>Corty, M. M., Freeman, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+biology+in+neuroscience:+Architects+in+neural+circuit+design:+Glia+control+neuron+numbers+and+connectivity.">Cell biology in neuroscience: Architects in neural circuit design: Glia control neuron numbers and connectivity.</a> J Cell Biol. 203 (3), 395-405 (2013).</li><li>Hidalgo, A., Kato, K., Sutcliffe, B., McIlroy, G., Bishop, S., Alahmed, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trophic+neuron-glia+interactions+and+cell+number+adjustments+in+the+fruit+fly.">Trophic neuron-glia interactions and cell number adjustments in the fruit fly.</a> Glia. 59 (9), 1296-1303 (2011).</li><li>Liu, J., Speder, P., Brand, A. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+new+site-specific+recombinases+for+use+in+manipulating+animal+genomes.">Multiple new site-specific recombinases for use in manipulating animal genomes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (34), 14198-14203 (2011).</li><li>Nern, A., Pfeiffer, B. D., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+tools+for+multicolor+stochastic+labeling+reveal+diverse+stereotyped+cell+arrangements+in+the+fly+visual+system.">Optimized tools for multicolor stochastic labeling reveal diverse stereotyped cell arrangements in the fly visual system.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (22), E2967-E2976 (2015).</li><li>Viswanathan, S., Williams, M. E., Bloss, E. B., Stasevich, T. J., Speer, C. M., Nern, A., Pfeiffer, B. D., Hooks, B. M., Li, W. P., English, B. P., Tian, T., Henry, G. L., Macklin, J. J., Patel, R., Gerfen, C. R., Zhuang, X., Wang, Y., Rubin, G. M., Looger, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-performance+probes+for+light+and+electron+microscopy.">High-performance probes for light and electron microscopy.</a> Nat Methods. 12 (6), 568-576 (2015).</li><li>Livet, J., Weissman, T. A., Kang, H., Draft, R. W., Lu, J., Bennis, R. A., Sanes, J. R., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+strategies+for+combinatorial+expression+of+fluorescent+proteins+in+the+nervous+system.">Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system.</a> Nature. 450 (7166), 56-62 (2007).</li><li>Hampel, S., Chung, P., McKellar, C. E., Hall, D., Looger, L. L., Simpson, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+Brainbow:+A+recombinase-based+fluorescence+labeling+technique+to+subdivide+neural+expression+patterns.">Drosophila Brainbow: A recombinase-based fluorescence labeling technique to subdivide neural expression patterns.</a> Nat Methods. 8 (3), 253-259 (2011).</li><li>Hadjieconomou, D., Rotkopf, S., Alexandre, C., Bell, D. M., Dickson, B. J., Salecker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flybow:+Genetic+multicolor+cell+labeling+for+neural+circuit+analysis+in+Drosophila+melanogaster.">Flybow: Genetic multicolor cell labeling for neural circuit analysis in Drosophila melanogaster.</a> Nat Methods. 8 (3), 260-266 (2011).</li><li>Kremer, M. C., Jung, C., Batelli, S., Rubin, G. M., Gaul, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+glia+of+the+adult+Drosophila+nervous+system.">The glia of the adult Drosophila nervous system.</a> Glia. 65 (4), 606-638 (2017).</li></ol>

Este protocolo descreve um método fácil e eficiente para estudar a morfologia dos diferentes tipos de células dentro de um tecido de interesse em alta resolução. Com a técnica MCFO, vários repórteres com epítopo diferente tags são usados em combinação para a rotulagem estocástico multicolor (Figura 2). Semelhante a outros métodos, como Brainbow/Flybow15,16,17, MCFO aumenta a diversidad...

Glia, a população de células não-neuronais do sistema nervoso (NS), foram por muito tempo acreditou que fornecem uma estrutura estática de neurônios e, portanto, não foram estudados em detalhe. No entanto, em humanos, glia constituem a grande maioria das células no NS (~ 90%) e caem em várias categorias diferentes, incluindo astrócitos, oligodendrócitos, micróglia e células de Schwann. Em Drosophila, glia constituem cerca de 10% das células da NS. Curiosamente, suas morfologias e funções são muito semelhantes aos encontrados em vertebrados1,2. Suas morfologias incluem a barreira hemato - encefálica (BBB) formando epitélios, ensheathing e células astrocyte.
O sistema nervoso central de Drosophila (CNS) é composto das seguintes estruturas principais: regiões do córtex que contêm os corpos celulares neuronais; neuropils que abrigar conexões sinápticas; intervalos de axônio de pequenos e grandes que se conectar a diferentes neuropiles; nervos periféricos que conectam os músculos e órgãos sensoriais com o CNS (Figura 1). Glia encontram-se associados com todas estas estruturas anatômicas: glia Cortex (CG) nas regiões corticais, como astrocyte glia (AIG) e ensheathing glia (EG) nas regiões neuropile, ensheathing glia também estão associados com intervalos de axônio central e periférico nervos (EGN) e finalmente, duas folha-como glia, glia perineurial (PG) e subperineurial (SPG), que juntos formam uma camada contígua que cobre o NS inteiro (Figura 2).
Estudos anteriores mostraram que glia desempenham papéis importantes no desenvolvimento do NS; monitorar os números de celular neuronal por reagir a circula sistemicamente insulin-como peptides, fornecem suporte trófico para os neurônios, tais como o transporte do lactato astrocyte-neurônio e eliminar os neurônios morrendo por fagocitose3,4 , 5 , 6. no NS maduro, glia manter o BBB, ocupam os neurotransmissores e manter a homeostase iónica, atuam como as principais células do sistema imunológico da ns, desde que os macrófagos não podem violar o BBB e modulam a atividade sináptica, bem como comportamento animal6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11.
Se os diferentes subtipos gliais executam funções especializadas permanece uma importante questão em aberto. No entanto, uma análise sistemática de todo o genoma da glia, especialmente no adulto, é dificultada pela falta de ferramentas genéticas adequadas para sua manipulação. Aqui, um método que permite a caracterização eficiente e fácil de formas de célula para estudar interações célula-célula complexo é apresentado. Esta técnica foi aplicada para caracterizar a morfologia dos diferentes subtipos gliais no cérebro adulto Drosophila , mas, dependendo do driver específico GAL4 usado, isso poderia ser adaptado para estudar neurônios12,13 , qualquer tipo de entrelaçamento de células e em princípio qualquer tecido em qualquer fase do desenvolvimento.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Grant</td>
			<td>GD100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR tubes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72.737.002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>11251-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting dish 30 mm x 12 mmm</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>70543-30</td>
			<td>Glass dissection dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrex 3 Depression Glass Spot Plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>7223-34</td>
			<td>Glass dissection plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard Black</td>
			<td>SYLGARD, Sigma-Aldrich</td>
			<td>805998</td>
			<td>home made with charcoal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ExpressFive S2 cell culture medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10486-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20% PFA</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Roth</td>
			<td>3051.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal goat serum</td>
			<td>Jackson Laboratories</td>
			<td>005-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal donkey serum</td>
			<td>Jackson Laboratories</td>
			<td>017-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit HA-tag</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>C29F4</td>
			<td>Primary antibody, dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat FLAG-tag</td>
			<td>Novus Biologicals</td>
			<td>NBP1-06712</td>
			<td>Primary antibody, dilution 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse V5-tag:DyLight 549</td>
			<td>AdSerotec</td>
			<td>0411</td>
			<td>Conjugated antibody, dilution 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-rabbit AlexaFluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11034</td>
			<td>Secondary antibody, dilution 1:250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-rat DyLight 647</td>
			<td>Jackson Laboratories</td>
			<td>712-605-153</td>
			<td>Secondary antibody, dilution 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vecta Shield</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SlowFate Gold</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>S36937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secure Seal Spacer</td>
			<td>Grace Biolabs</td>
			<td></td>
			<td>Contact company for ordering</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope cover glass 22 X 60 mm</td>
			<td>Marienfeld</td>
			<td>101152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope cover glass 22 x 22 mm</td>
			<td>Roth</td>
			<td>H874</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo Microscope, Leica MZ6</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal laser scanning microscope LSM710</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersol</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>518 F</td>
			<td>Immersion oil for fluorescence-microscopy, halogen free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersol</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>W 2010</td>
			<td>Immersion fluid for water-immersion objectives, halogen free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R56F03-GAL4 (EG)</td>
			<td>Bloomington Stock Center</td>
			<td>39157</td>
			<td>GAL4 driver</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R86E01-GAL4 (ALG)</td>
			<td>Bloomington Stock Center</td>
			<td>45914</td>
			<td>GAL4 driver</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hspFlpPestOpt; UAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-HA, UAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-FLAG, UAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-V5</td>
			<td>Bloomington Stock Center</td>
			<td>64085</td>
			<td>UAS reporter (https://bdscweb.webtest.iu.edu/stock/misc/mcfo.php)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji (Image J)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Image analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi Time Macro</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Software for automated scanning</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

application of multicolor flpout technique to study high resolution single cell morphologies and cell interactions of glia in drosophila

Células exibem morfologias diferentes e complexas relações anatômicas. Como as células interagem com seus vizinhos? Que as interações diferem entre tipos de células, ou mesmo dentro de um determinado tipo? Quais os tipos de regras espaciais que eles seguem? As respostas a essas perguntas fundamentais na vivo foram dificultadas até agora por falta de ferramentas para a rotulagem de célula única de alta resolução. Aqui, um protocolo detalhado para atingir células única com uma técnica de FlpOut MultiColor (MCFO) é fornecido. Esse método se baseia em três diferentemente marcados repórteres (HA, bandeira e V5) sob controle UAS que são mantidos em silêncio por um terminador transcricional ladeado por dois sites FRT (FRT-paragem-FRT). Uma onda de choque do calor induz a expressão de um calor induzida por choque Flp recombinase, que aleatoriamente elimina as fitas FRT-FRT-paragem em células individuais: expressão ocorre apenas em células que expressam também um driver GAL4. Isto leva a uma matriz de cores diferentes células de um tipo de célula dado que permite a visualização da morfologia das células individuais em alta resolução. Como exemplo, a técnica MCFO pode ser combinada com drivers de GAL4 gliais específicos para visualizar as morfologias dos diferentes subtipos gliais no cérebro adulto drosófila .

Esta seção ilustra exemplos de resultados que podem ser obtidos usando a técnica MCFO no cérebro adulto drosófila . A Figura 3 mostra um esquema do método. Três diferentemente a membrana-tag repórteres (myr-smGFP-HA, myr-smGFP-bandeira e myr-smGFP-V5) sob controle UAS são mantidos em silêncio por um terminador transcricional ladeado por dois sites FRT (FRT-paragem-FRT). Uma onda de choque do calor induz a expressão de re...

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Application of MultiColor FlpOut Technique to Study High Resolution Single Cell Morphologies and Cell Interactions of Glia in Drosophila

Células exibir diferentes morfologias e estabelecer uma variedade de interações com seus vizinhos. Este protocolo descreve como para revelar a morfologia das células únicas e para investigar a interação célula-célula, usando o sistema de expressão Gal4/UAS bem estabelecido.

Aplicação de técnica de FlpOut MultiColor para estudar a alta resolução única célula morfologias e interações de células da Glia em Drosophila

Cells display different morphologies and complex anatomical relationships. How do cells interact with their neighbors? Do the interactions differ between ...

Research

JoVE Journal

Behavior

Application of MultiColor FlpOut Technique to Study High Resolution Single Cell Morphologies and Cell Interactions of Glia in Drosophila

Assessment and Evaluation of the High Risk Neonate: The NICU Network Neurobehavioral Scale

Análise e Avaliação do Risco Neonatal Alta: A Escala de UTIN Rede Neurobehavioral

There has been a long-standing interest in the assessment of the neurobehavioral integrity of the newborn infant.  The NICU Network Neurobehavioral Scale ...

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