Name: sample preparation and analysis of rnaseq-based gene expression data from zebrafish
Uploaded: 2017-10-27T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Sample Preparation and Analysis of RNASeq-based Gene Expression Data from Zebrafish at JoVE.com

وأيده هذا العمل R01DK102001 (N.A.Z.) و P30DK072488 (N.A.Z.) T32DK098107 (T.L.H. و J.E.N.).

كافة البروتوكولات الحيوانية المبينة أدناه وفقا وأقرتها جامعة "ميريلاند رعاية الحيوان المؤسسية" واستخدام اللجنة (إياكوك)-
 1-"إعداد الجنين" ، <ol><li>توليد أجنة عن طريق التزاوج الطبيعي <ol><li>ثقافة الأجنة لمدة 3 أشهر عمر، الإنجابية النضج 5 8 </...

<ol>
	<li>Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Zebrafish. , (2002).</li><li>Detrich, H. W., Zon, L., Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Zebrafish: Disease Models and Chemical Screens. , (2017).</li><li>Detrich, H. W., Zon, L. I., Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Zebrafish: Genetics, Genomics, and Transcriptomics. , (2016).</li><li>Detrich, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Zebrafish: Genetics, Genomics and Informatics. , (2011).</li><li>Avdesh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regular+care+and+maintenance+of+a+zebrafish+(Danio+rerio)+laboratory:+an+introduction.">Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction.</a> J Vis Exp. (69), e4196 (2012).</li><li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+zebrafish+embryos+to+analyze+gene+function.">Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function.</a> J Vis Exp. (25), (2009).</li><li>Hwang, W. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+genome+editing+in+zebrafish+using+a+CRISPR-Cas+system.">Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system.</a> Nat Biotechnol. 31 (3), 227-229 (2013).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2000).</li><li>Rossi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+compensation+induced+by+deleterious+mutations+but+not+gene+knockdowns.">Genetic compensation induced by deleterious mutations but not gene knockdowns.</a> Nature. 524 (7564), 230-233 (2015).</li><li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish.">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).</li><li>Samsa, L. A., Fleming, N., Magness, S., Qian, L., Liu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Characterization+of+Single+Cells+from+Zebrafish+Embryos.">Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos.</a> J Vis Exp. (109), (2016).</li><li>. IDT Primerquest Tool Available from: <a target="_blank" href="https://www.idtdna.com/Primerquest/Home/Index">https://www.idtdna.com/Primerquest/Home/Index</a> (2017)</li><li>Heid, C. A., Stevens, J., Livak, K. J., Williams, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real+time+quantitative+PCR.">Real time quantitative PCR.</a> Genome Res. 6 (10), 986-994 (1996).</li><li>Leitch, C. C., Lodh, S., Prieto-Echague, V., Badano, J. L., Zaghloul, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basal+body+proteins+regulate+Notch+signaling+through+endosomal+trafficking.">Basal body proteins regulate Notch signaling through endosomal trafficking.</a> J Cell Sci. 127 (Pt 11), 2407-2419 (2014).</li><li>Lodh, S., Hostelley, T. L., Leitch, C. C., O'Hare, E. A., Zaghloul, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+effects+on+beta-cell+mass+by+disruption+of+Bardet-Biedl+syndrome+or+Alstrom+syndrome+genes.">Differential effects on beta-cell mass by disruption of Bardet-Biedl syndrome or Alstrom syndrome genes.</a> Hum Mol Genet. 25 (1), 57-68 (2016).</li><li>Hostelley, T. L., Lodh, S., Zaghloul, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+organism+transcriptome+analysis+of+zebrafish+models+of+Bardet-Biedl+Syndrome+and+Alstrom+Syndrome+provides+mechanistic+insight+into+shared+and+divergent+phenotypes.">Whole organism transcriptome analysis of zebrafish models of Bardet-Biedl Syndrome and Alstrom Syndrome provides mechanistic insight into shared and divergent phenotypes.</a> BMC Genomics. 17, 318 (2016).</li></ol>

ويوفر النهج المبينة في هذا البروتوكول استراتيجية فعالة من حيث التكلفة وسريعة نسبيا لتحليل مستوى الترنسكربيتوم للحيوانات كله أو السكان خلية معينة تم فرزها. الزرد يوفر نموذجا مفيداً لهذا النوع من الدراسة بسبب السهولة والسرعة في توليد كميات كبيرة من ابتداء من المواد وسهولة تنفيذ الوراثية ?...

تحليل مقارن للتعبير الجيني العالمي أداة قيمة لتحديد الجينات الجديدة المساهمة تعمل الملاحظة. هذه التحليلات عادة تعتمد على التقييم الكمي لوفرة نسخة مقارنة بين التجريبية والتحكم في العينات. النهج المستهدفة، مثل قرة-بكر نسبيا سريعة ودقيقة لتحقيق تغييرات التعبير الجيني واحد. تسلسل الحمض النووي الريبي (رناسيق) يقدم نهجاً واسع النطاق وخالية من فرضية لتحديد التغيرات الهامة في التعبير الجيني بين العينات، مما يجعل الآن معياراً لمثل هذه التحقيقات عبر أنظمة تجريبية.
وظهرت الزرد نموذجا بارزا عبر مجالات أمراض عديدة. وضعت أصلاً لفائدتها في دراسات علم الأحياء التنموي، نظراً للخصوبة العالية والتكلفة المنخفضة نسبيا للصيانة، والاستخدام التجريبي من الزرد تطورت لتشمل طائفة واسعة من تعمل من الجنينية إلى مراحل الكبار، وكذلك مجموعة واسعة من الجزيئات فحوصات1،،من23. في الواقع، هذه المزايا تجعل الدراسات الميكانيكية الجزيئية السريعة والفعالة من حيث التكلفة بسبب سهولة الحصول على كميات كبيرة من المواد جنبا إلى جنب مع سهولة التلاعب الوراثية والبيئية على السواء في جميع مراحل الحياة. وعلاوة على ذلك، الطبيعة الشفافة لليرقات والأجنة الزرد تجعله مثاليا لتوليد خطوط مراسل المعدلة وراثيا المحددة للخلايا والأنسجة مما يسمح في فيفو التصور لخلية منفصلة السكان4. استغلال هذه الخطوط يسمح تحليل التعبير الجيني العالمي في أنواع الخلايا المعزولة محددة استناداً إلى مراسل الجينات.
وهنا يقدم بروتوكول شامل لتحليل التعبير الجيني العالمي باستخدام رناسيق بعد ثقافة الأجنة الزرد. التلاعب التجريبية الوراثية، بما في ذلك morpholino (ميسوري)-ضربة قاضية على أساس الجينات عابرة أو تحرير كريسبر بوساطة الجينوم، وقد عرضت في مكان آخر5،،من67. ولذلك نحن التركيز على بروتوكول مفصل لعزل الحمض النووي الريبي من الأجنة كله أو فرز الخلايا المحورة وراثيا معربا عن مراسل متبوعاً بالتحليل الحسابي البسيط للنتائج رناسيق باستخدام أدوات المسار ومصطلحات علم الوجود (GO) الجينات. أخيرا، لقد شملت استراتيجية من أجل التحقق من صحة التغييرات التعبير الجيني بالكمية عكس المنتسخة بكر (قرت-PCR). هذه البروتوكولات قابلة للتطبيق للأجنة الزرد التعرض لمجموعة واسعة من الظروف التجريبية، بما في ذلك مقارنة من طفرات وراثية أو الظروف البيئية.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Commercial Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TriZol</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>15596026</td>
			<td>lysis reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12604013</td>
			<td>dissociation buffer 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSMax</td>
			<td>Genlantis</td>
			<td>T200100</td>
			<td>dissociation buffer 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC-treated water</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>95284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FirstStrand cDNA conversion</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>K1621</td>
			<td>cDNA conversion kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2X SYBR Green Master Mix</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4707516001</td>
			<td>qRT-PCR Master Mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS buffer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-105-9042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chloroform</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>288306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium acetate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S2889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zebrafish Strains</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tuebingen</td>
			<td>ZIRC</td>
			<td>ZL57</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ins2a:mCherry</td>
			<td>ZIRC</td>
			<td>ZL1483</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 micron cell strainer</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>CLS431750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS tube</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hemocytometer</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z359629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illumina HiSeq</td>
			<td>Illumina</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 480</td>
			<td>Roche</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mating tanks 1.0L Crossing Tank Set</td>
			<td>Aquaneering</td>
			<td>ZHCT100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS tube 5 mL polypropylene tube</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Consensus Path DB</td>
			<td>http://cpdb.molgen.mpg.de/</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GO Enrichment Analysis</td>
			<td colspan="2">http://geneontology.org/page/go-enrichment-analysis</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sample preparation and analysis of rnaseq-based gene expression data from zebrafish

تحليل التغيرات التعبير الجيني العالمي أداة قيمة لتحديد مسارات الرواية الأساسية تعمل الملاحظة. الزرد نموذج ممتاز للتقييم السريع لأسرة الترنسكربيتوم من السكان الخلية الحيوانية أسرة أو فرد بسبب السهولة لعزل الحمض النووي الريبي من إعداد كبيرة من الحيوانات. ويرد هنا بروتوكولا لتحليل التعبير الجيني العالمي في الأجنة الزرد استخدام تسلسل الحمض النووي الريبي (رناسيق). يصف لنا إعداد الجيش الملكي النيبالي من الأجنة كله أو من السكان الخلية التي تم الحصول عليها باستخدام الخلية الفرز في الحيوانات المحورة وراثيا. كما يصف لنا نهج لتحليل البيانات رناسيق لتحديد مسارات المخصب وشروط الجينات علم الوجود (GO) في مجموعات البيانات التعبير الجيني العالمي. وأخيراً، نحن نقدم بروتوكول للتحقق تغييرات التعبير الجيني باستخدام المنتسخة العكسية الكمي PCR (قرت-PCR). يمكن استخدامها لتحليل مقارن للتحكم ومجموعات تجريبية من الزرد لتحديد التغييرات التعبير الجيني رواية هذه البروتوكولات، والتبصير الجزيئية تعمل لمصلحة.

وأعرب عن الفرز من خلطات الجينات:
نحن استهدفت تحديد الجينات الأثران المعرب عنها في مرحلة اليرقات الزرد نماذج من مرض Alström ومرض متلازمة باردت-بيدل (BBS)، أما alms1 أو النصوص bbs1 بالحقن قبل التحقق من صحة موس إلى حجب الوصلة الزرد البرية من ن?...

Watch this Scientific Journal Video about Sample Preparation and Analysis of RNASeq-based Gene Expression Data from Zebrafish at JoVE.com

Sample Preparation and Analysis of RNASeq-based Gene Expression Data from Zebrafish

نموذج إعداد وتحليل البيانات التعبير الجيني على أساس رناسيق من الزرد

هذا البروتوكول يقدم نهجاً لتحليل الترنسكربيتوم كله من الأجنة الزرد، اليرقات، أو فرز الخلايا. نحن تشمل عزلة من الجيش الملكي النيبالي، وتحليل المسار للبيانات رناسيق، والمستندة إلى بكر qRT التحقق من صحة التغييرات التعبير الجيني.

The analysis of global gene expression changes is a valuable tool for identifying novel pathways underlying observed phenotypes. The zebrafish is an ...

Research

JoVE Journal

Genetics

Parallel Measurement of Circadian Clock Gene Expression and Hormone Secretion in Human Primary Cell Cultures

قياس موازية التعبير الإيقاعية جين ساعة وهرمون إفراز في مزارع الخلايا الأولية البشرية

Circadian clocks are functional in all light-sensitive organisms, allowing for an adaptation to the external world by anticipating daily environmental ...

Single-cell Gene Expression Profiling Using FACS and qPCR with Internal Standards

وحيدة الخلية التعبير الجيني التنميط عن طريق نظام مراقبة الأصول الميدانية وQPCR مع المعايير الداخلية

Gene expression measurements from bulk populations of cells can obscure the considerable transcriptomic variation of individual cells within those ...

Studying Cell Cycle-regulated Gene Expression by Two Complementary Cell Synchronization Protocols

دراسة الخلية التعبير عن تنظيم دورة الجينات من قبل اثنين من بروتوكولات التزامن الخلية التكميلية

The gene expression program of the cell cycle represents a critical step for understanding cell cycle-dependent processes and their role in diseases such ...

Bidirectional Retroviral Integration Site PCR Methodology and Quantitative Data Analysis Workflow

موقع التكامل ثنائي الاتجاه للفيروسات القهقرية منهجية ير والتحليل الكمي للبيانات سير العمل

Integration Site (IS) assays are a critical component of the study of retroviral integration sites and their biological significance. In recent retroviral ...

Measuring Gene Expression in Bombarded Barley Aleurone Layers with Increased Throughput

قياس التعبير الجيني في طبقات الارون الشعير قصفت مع زيادة الإنتاجية

The aleurone layer of barley grains is an important model system for hormone-regulated gene expression in plants. In aleurone cells, genes required for ...

An Optogenetic Method to Control and Analyze Gene Expression Patterns in Cell-to-cell Interactions

أسلوب أوبتوجينيتيك لمراقبة وتحليل أنماط التعبير الجيني في تفاعلات الخلية للخلية

Cells should respond properly to temporally changing environments, which are influenced by various factors from surrounding cells. The Notch signaling ...

An Ecdysone Receptor-based Singular Gene Switch for Deliberate Expression of Transgene with Robustness, Reversibility, and Negligible Leakiness

Ecdysone المستندة إلى مستقبلات فريدة الجينات التبديل للتعبير المتعمد للتحوير مع المتانة وإمكانية الرجوع ويجتازها لا يعتد بها

Precise control of transgene expression is desirable in biological and clinical studies. However, because the binary feature of currently employed gene ...

Exploring the Root Microbiome: Extracting Bacterial Community Data from the Soil, Rhizosphere, and Root Endosphere

استكشاف ميكروبيومي الجذر: استخراج البيانات المجتمع البكتيرية من التربة، ورهيزوسفيري، واندوسفيري الجذر

The intimate interaction between plant host and associated microorganisms is crucial in determining plant fitness, and can foster improved tolerance to ...

Informatic Analysis of Sequence Data from Batch Yeast 2-Hybrid Screens

تحليل بيانات تسلسل من دفعة الخميرة 2-الهجين شاشات المعلوماتي

We have adapted the yeast 2-hybrid assay to simultaneously uncover dozens of transient and static protein interactions within a single screen utilizing ...

Maintaining Biological Cultures and Measuring Gene Expression in Aphis nerii: A Non-model System for Plant-insect Interactions

Maintaining Biological Cultures and Measuring Gene Expression in Aphis nerii: A Non-model System for Plant-insect Interactions

الحفاظ على الثقافات البيولوجية وقياس التعبير الجيني في نيري عافص: نظام عدم-نموذج للتفاعلات بين النبات-الحشرات

Aphids are excellent experimental models for a variety of biological questions ranging from the evolution of symbioses and the development of polyphenisms ...