Name: sample preparation and analysis of rnaseq-based gene expression data from zebrafish
Uploaded: 2017-10-27T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Sample Preparation and Analysis of RNASeq-based Gene Expression Data from Zebrafish at JoVE.com

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alle tierischen Protokolle, die unten beschrieben sind in Übereinstimmung mit und genehmigt von der University of Maryland institutionelle Animal Care und Nutzung Committee (IACUC).
 1. Embryo Vorbereitung <ol><li>Generierung von Embryonen durch natürliche Paarung <ol><li>Kultur Embryonen bis 3 Monate alt, reproduktive Reife 5 , 8 .</li>
		<li>Erwachsenen männlichen und weiblichen Fische aus die gewünschte Bel...

<ol>
	<li>Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Zebrafish. , (2002).</li><li>Detrich, H. W., Zon, L., Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Zebrafish: Disease Models and Chemical Screens. , (2017).</li><li>Detrich, H. W., Zon, L. I., Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Zebrafish: Genetics, Genomics, and Transcriptomics. , (2016).</li><li>Detrich, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Zebrafish: Genetics, Genomics and Informatics. , (2011).</li><li>Avdesh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regular+care+and+maintenance+of+a+zebrafish+(Danio+rerio)+laboratory:+an+introduction.">Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction.</a> J Vis Exp. (69), e4196 (2012).</li><li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+zebrafish+embryos+to+analyze+gene+function.">Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function.</a> J Vis Exp. (25), (2009).</li><li>Hwang, W. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+genome+editing+in+zebrafish+using+a+CRISPR-Cas+system.">Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system.</a> Nat Biotechnol. 31 (3), 227-229 (2013).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2000).</li><li>Rossi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+compensation+induced+by+deleterious+mutations+but+not+gene+knockdowns.">Genetic compensation induced by deleterious mutations but not gene knockdowns.</a> Nature. 524 (7564), 230-233 (2015).</li><li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish.">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).</li><li>Samsa, L. A., Fleming, N., Magness, S., Qian, L., Liu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Characterization+of+Single+Cells+from+Zebrafish+Embryos.">Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos.</a> J Vis Exp. (109), (2016).</li><li>. IDT Primerquest Tool Available from: <a target="_blank" href="https://www.idtdna.com/Primerquest/Home/Index">https://www.idtdna.com/Primerquest/Home/Index</a> (2017)</li><li>Heid, C. A., Stevens, J., Livak, K. J., Williams, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real+time+quantitative+PCR.">Real time quantitative PCR.</a> Genome Res. 6 (10), 986-994 (1996).</li><li>Leitch, C. C., Lodh, S., Prieto-Echague, V., Badano, J. L., Zaghloul, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basal+body+proteins+regulate+Notch+signaling+through+endosomal+trafficking.">Basal body proteins regulate Notch signaling through endosomal trafficking.</a> J Cell Sci. 127 (Pt 11), 2407-2419 (2014).</li><li>Lodh, S., Hostelley, T. L., Leitch, C. C., O'Hare, E. A., Zaghloul, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+effects+on+beta-cell+mass+by+disruption+of+Bardet-Biedl+syndrome+or+Alstrom+syndrome+genes.">Differential effects on beta-cell mass by disruption of Bardet-Biedl syndrome or Alstrom syndrome genes.</a> Hum Mol Genet. 25 (1), 57-68 (2016).</li><li>Hostelley, T. L., Lodh, S., Zaghloul, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+organism+transcriptome+analysis+of+zebrafish+models+of+Bardet-Biedl+Syndrome+and+Alstrom+Syndrome+provides+mechanistic+insight+into+shared+and+divergent+phenotypes.">Whole organism transcriptome analysis of zebrafish models of Bardet-Biedl Syndrome and Alstrom Syndrome provides mechanistic insight into shared and divergent phenotypes.</a> BMC Genomics. 17, 318 (2016).</li></ol>

In diesem Protokoll beschriebene Ansatz bietet eine relativ schnelle und kostengünstige Strategie für Transkriptom-Level-Analyse der ganze Tiere oder bestimmte sortierte Zellpopulationen. Der Zebrabärbling bietet eine vorteilhafte Modell für diese Art der Studie wegen der Leichtigkeit und Schnelligkeit beim generieren großer Mengen an Material, die einfache Implementierung von genetischen oder experimentelle Umweltbedingungen und die Verfügbarkeit eines großen ab Spektrum an transgenen Reporter Linien zur Isolatio...

Vergleichende Analyse der globalen Genexpression ist ein wertvolles Werkzeug, neuartige Gene zur beobachteten Phänotypen zu identifizieren. Solche Analysen in der Regel verlassen sich auf quantitative Bewertung der Abschrift Fülle im Vergleich zwischen experimentellen und Kontrollproben. Gezielte Ansätze, wie z. B. qRT-PCR sind relativ schnelle und genaue Untersuchung der Veränderungen der einzelnen Genexpression. RNA-Sequenzierung (RNASeq) bietet einen breiten, Hypothese-freie Ansatz um wesentliche Änderungen in der Genexpression zwischen Proben, so dass es nun den Standard für solche Untersuchungen über experimentelle Systeme zu identifizieren.
Zebrafisch entstanden als prominente Modell in vielen Bereichen der Krankheit. Ursprünglich entwickelt für ihre Nützlichkeit in Entwicklungsbiologie Studien aufgrund ihrer hohen Fruchtbarkeit und relativ geringen Kosten für Wartung, experimentellen Einsatz von Zebrafisch entwickelt hat, um umfassen eine Vielzahl von Phänotypen aus embryonalen bis adulten Stadien als auch als ein Vielzahl von molekularen Tests1,2,3. In der Tat, diese Vorteile machen die molekularen mechanistische Studien schnelle und kostengünstige wegen der Leichtigkeit des Erwerbs von großen Mengen an Material kombiniert mit der Leichtigkeit des genetischen und umweltbedingten Manipulation in allen Phasen des Lebens. Darüber hinaus die transparente Art der Zebrafisch-Embryonen und Larven machen es ideal für die Erzeugung von Zell- und gewebespezifische transgenen Reporter Linien in Vivo Visualisierung von diskreten Zelle Bevölkerungen4ermöglicht. Ausbeutung von solchen Linien ermöglicht globale gen Expressionsanalyse in bestimmten isolierten Zelle Arten basierend auf Reporter-gen-Expression.
Hier präsentieren wir Ihnen ein umfassendes Protokoll für globale Genanalyse Ausdruck mit RNASeq nach der Kultur der Zebrafisch-Embryonen. Genetischen experimentelle Manipulationen, einschließlich Morpholino (MO)-aufgrund vorübergehender gen-Knockdown oder CRISPR-vermittelten Genom-Bearbeitung, wurden präsentiert an anderer Stelle5,6,7. Wir daher konzentrieren sich auf ein detailliertes Protokoll zur Isolierung von RNA aus ganzen Embryonen oder transgene Reporter exprimierenden Zellen, gefolgt von einfachen numerischen Analyse der RNASeq Ergebnisse mit Weg-Tools und gen Ontology (gehen Sie) Begriffe sortiert. Zu guter Letzt haben wir eine Strategie für die Validierung von Veränderungen der Genexpression durch quantitative Reverse Transkriptase PCR (qRT-PCR) aufgenommen. Diese Protokolle sind für Zebrafisch-Embryonen, die eine Vielzahl von experimentellen Bedingungen, auch im Vergleich der genetische Mutanten oder Umweltbedingungen ausgesetzt.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Commercial Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TriZol</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>15596026</td>
			<td>lysis reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12604013</td>
			<td>dissociation buffer 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSMax</td>
			<td>Genlantis</td>
			<td>T200100</td>
			<td>dissociation buffer 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC-treated water</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>95284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FirstStrand cDNA conversion</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>K1621</td>
			<td>cDNA conversion kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2X SYBR Green Master Mix</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4707516001</td>
			<td>qRT-PCR Master Mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS buffer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-105-9042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chloroform</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>288306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium acetate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S2889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zebrafish Strains</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tuebingen</td>
			<td>ZIRC</td>
			<td>ZL57</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ins2a:mCherry</td>
			<td>ZIRC</td>
			<td>ZL1483</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 micron cell strainer</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>CLS431750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS tube</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hemocytometer</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z359629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illumina HiSeq</td>
			<td>Illumina</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 480</td>
			<td>Roche</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mating tanks 1.0L Crossing Tank Set</td>
			<td>Aquaneering</td>
			<td>ZHCT100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS tube 5 mL polypropylene tube</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Consensus Path DB</td>
			<td>http://cpdb.molgen.mpg.de/</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GO Enrichment Analysis</td>
			<td colspan="2">http://geneontology.org/page/go-enrichment-analysis</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sample preparation and analysis of rnaseq-based gene expression data from zebrafish

Die Analyse der Veränderungen der globalen Genexpression ist ein wertvolles Instrument zur Identifizierung von neuartige Wege beobachteten Phänotypen zugrunde liegen. Der Zebrabärbling ist ein hervorragendes Modell für schnelle Beurteilung der ganze Transkriptom vom ganzen Tier oder einzelne Zellpopulationen wegen der Leichtigkeit der Isolierung der RNA aus große Zahl von Tieren. Hier ist ein Protokoll für globale gen Expressionsanalyse in den Zebrafish Embryos mit RNA Sequenzierung (RNASeq) vorgestellt. Wir beschreiben Vorbereitung der RNA aus ganzen Embryonen oder Zell-Populationen mit Zelle Sortierung bei transgenen Tieren erzielt. Wir beschreiben auch einen Ansatz zur Analyse von RNASeq Daten, angereicherte Wege und Gene Ontology (gehen Sie) Begriffe im globalen gen Ausdruck Datensätze zu identifizieren. Zu guter Letzt bieten wir ein Protokoll für die Validierung von Veränderungen der Genexpression mit quantitative Reverse Transkriptase PCR (qRT-PCR). Diese Protokolle können für die vergleichende Analyse der Steuerung und experimentellen Gruppen von Zebrafisch verwendet werden, um Veränderungen der neuartigen Genexpression zu identifizieren und molekulare Einblick in Phänotypen von Interesse.

Sortierung der differenziell ausgedrückt Gene:
Wir gezielte Ermittlung differentiell exprimierten Gene im Larvenstadium von Zebrafisch-Modellen von Alström-Syndrom und Bardet-Bardet-Syndrom (BBS), entweder alms1 oder bbs1 Abschriften durch die Injektion von zuvor validiert Spleiß-blocking MOs in Wildtyp Zebrafish Embryos16,17. 5 Tage nach Befruchtung (D...

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Sample Preparation and Analysis of RNASeq-based Gene Expression Data from Zebrafish

Probenvorbereitung und Analyse der RNASeq-basierte Genexpressionsdaten von Zebrafisch

Dieses Protokoll stellt einen Ansatz für die ganze Transkriptom-Analyse von Zebrafisch-Embryonen, Larven, oder Zellen sortiert. Wir gehören Isolierung von RNA, Pathway-Analyse von RNASeq Daten und qRT-PCR-basierte Validierung von Veränderungen der Genexpression.

The analysis of global gene expression changes is a valuable tool for identifying novel pathways underlying observed phenotypes. The zebrafish is an ...

Research

JoVE Journal

Genetics

Parallel Measurement of Circadian Clock Gene Expression and Hormone Secretion in Human Primary Cell Cultures

Parallel Messung von Circadian Clock Genexpression und Hormon-Sekretion in primären humanen Zellkulturen

Circadian clocks are functional in all light-sensitive organisms, allowing for an adaptation to the external world by anticipating daily environmental ...

Forschung

Genetik

Single-cell Gene Expression Profiling Using FACS and qPCR with Internal Standards

Einzellige Genexpressionsprofile mittels FACS und qPCR mit internen Standards

Gene expression measurements from bulk populations of cells can obscure the considerable transcriptomic variation of individual cells within those ...

Studying Cell Cycle-regulated Gene Expression by Two Complementary Cell Synchronization Protocols

Das Studium der Zellzyklus-regulierten Genexpression durch zwei komplementäre Zellsynchronisationsprotokolle

The gene expression program of the cell cycle represents a critical step for understanding cell cycle-dependent processes and their role in diseases such ...

Bidirectional Retroviral Integration Site PCR Methodology and Quantitative Data Analysis Workflow

Bidirektionale Retrovirale Integrationsstelle PCR Methodik und quantitative Datenanalyse Workflow

Integration Site (IS) assays are a critical component of the study of retroviral integration sites and their biological significance. In recent retroviral ...

Measuring Gene Expression in Bombarded Barley Aleurone Layers with Increased Throughput

Messung der Genexpression in bombardierten Gerste Aleuronschicht Schichten mit erhöhter Durchsatz

The aleurone layer of barley grains is an important model system for hormone-regulated gene expression in plants. In aleurone cells, genes required for ...

An Optogenetic Method to Control and Analyze Gene Expression Patterns in Cell-to-cell Interactions

Eine optogenetische Methode zu kontrollieren und analysieren gen Expressionsmuster in Zell-Zell-Interaktionen

Cells should respond properly to temporally changing environments, which are influenced by various factors from surrounding cells. The Notch signaling ...

An Ecdysone Receptor-based Singular Gene Switch for Deliberate Expression of Transgene with Robustness, Reversibility, and Negligible Leakiness

Ein Ecdyson Rezeptor-basierte singuläre Genschalter für bewusste Expression des Transgens mit Robustheit, Reversibilität und vernachlässigbar Undichtigkeit

Precise control of transgene expression is desirable in biological and clinical studies. However, because the binary feature of currently employed gene ...

Exploring the Root Microbiome: Extracting Bacterial Community Data from the Soil, Rhizosphere, and Root Endosphere

Die Wurzel Mikrobiom zu erkunden: Extrahieren von Bakteriengemeinschaft Daten aus dem Boden, die Rhizosphäre und die Wurzel Endosphere

The intimate interaction between plant host and associated microorganisms is crucial in determining plant fitness, and can foster improved tolerance to ...

Informatic Analysis of Sequence Data from Batch Yeast 2-Hybrid Screens

Informatischen Analyse von Sequenzdaten von Batch-Hefe-2-Hybrid-Bildschirme

We have adapted the yeast 2-hybrid assay to simultaneously uncover dozens of transient and static protein interactions within a single screen utilizing ...

Maintaining Biological Cultures and Measuring Gene Expression in Aphis nerii: A Non-model System for Plant-insect Interactions

Maintaining Biological Cultures and Measuring Gene Expression in Aphis nerii: A Non-model System for Plant-insect Interactions

Aufrechterhaltung der biologischen Kulturen und Messung der Genexpression in Aphis Nerii: Non-Modellsystem für Pflanzen-Insekten-Interaktionen

Aphids are excellent experimental models for a variety of biological questions ranging from the evolution of symbioses and the development of polyphenisms ...