Name: sample preparation and analysis of rnaseq-based gene expression data from zebrafish
Uploaded: 2017-10-27T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Sample Preparation and Analysis of RNASeq-based Gene Expression Data from Zebrafish at JoVE.com

इस काम को R01DK102001 (N.A.Z.), P30DK072488 (N.A.Z.), और T32DK098107 (T.L.H. और J.E.N.) ने सपोर्ट किया था ।

नीचे उल्लिखित सभी पशु प्रोटोकॉल के अनुसार और मैरीलैंड संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) के विश्वविद्यालय द्वारा अनुमोदित कर रहे हैं । 
 1. भ्रूण वडा <ol> <li> प्राकृतिक सहवास के माध्यम...

<ol>
	<li>Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Zebrafish. , (2002).</li><li>Detrich, H. W., Zon, L., Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Zebrafish: Disease Models and Chemical Screens. , (2017).</li><li>Detrich, H. W., Zon, L. I., Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Zebrafish: Genetics, Genomics, and Transcriptomics. , (2016).</li><li>Detrich, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Zebrafish: Genetics, Genomics and Informatics. , (2011).</li><li>Avdesh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regular+care+and+maintenance+of+a+zebrafish+(Danio+rerio)+laboratory:+an+introduction.">Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction.</a> J Vis Exp. (69), e4196 (2012).</li><li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+zebrafish+embryos+to+analyze+gene+function.">Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function.</a> J Vis Exp. (25), (2009).</li><li>Hwang, W. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+genome+editing+in+zebrafish+using+a+CRISPR-Cas+system.">Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system.</a> Nat Biotechnol. 31 (3), 227-229 (2013).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2000).</li><li>Rossi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+compensation+induced+by+deleterious+mutations+but+not+gene+knockdowns.">Genetic compensation induced by deleterious mutations but not gene knockdowns.</a> Nature. 524 (7564), 230-233 (2015).</li><li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish.">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).</li><li>Samsa, L. A., Fleming, N., Magness, S., Qian, L., Liu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Characterization+of+Single+Cells+from+Zebrafish+Embryos.">Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos.</a> J Vis Exp. (109), (2016).</li><li>. IDT Primerquest Tool Available from: <a target="_blank" href="https://www.idtdna.com/Primerquest/Home/Index">https://www.idtdna.com/Primerquest/Home/Index</a> (2017)</li><li>Heid, C. A., Stevens, J., Livak, K. J., Williams, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real+time+quantitative+PCR.">Real time quantitative PCR.</a> Genome Res. 6 (10), 986-994 (1996).</li><li>Leitch, C. C., Lodh, S., Prieto-Echague, V., Badano, J. L., Zaghloul, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basal+body+proteins+regulate+Notch+signaling+through+endosomal+trafficking.">Basal body proteins regulate Notch signaling through endosomal trafficking.</a> J Cell Sci. 127 (Pt 11), 2407-2419 (2014).</li><li>Lodh, S., Hostelley, T. L., Leitch, C. C., O'Hare, E. A., Zaghloul, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+effects+on+beta-cell+mass+by+disruption+of+Bardet-Biedl+syndrome+or+Alstrom+syndrome+genes.">Differential effects on beta-cell mass by disruption of Bardet-Biedl syndrome or Alstrom syndrome genes.</a> Hum Mol Genet. 25 (1), 57-68 (2016).</li><li>Hostelley, T. L., Lodh, S., Zaghloul, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+organism+transcriptome+analysis+of+zebrafish+models+of+Bardet-Biedl+Syndrome+and+Alstrom+Syndrome+provides+mechanistic+insight+into+shared+and+divergent+phenotypes.">Whole organism transcriptome analysis of zebrafish models of Bardet-Biedl Syndrome and Alstrom Syndrome provides mechanistic insight into shared and divergent phenotypes.</a> BMC Genomics. 17, 318 (2016).</li></ol>

इस प्रोटोकॉल में वर्णित दृष्टिकोण एक अपेक्षाकृत तेजी से और पूरे पशुओं या विशिष्ट हल कोशिका आबादी के transcriptome स्तर के विश्लेषण के लिए लागत प्रभावी रणनीति प्रदान करता है । zebrafish क्योंकि आसानी और शुरू करने की ?...

वैश्विक जीन अभिव्यक्ति के तुलनात्मक विश्लेषण के लिए एक महत्वपूर्ण उपंयास को मनाया phenotypes योगदान जीन की पहचान उपकरण है । इस तरह के विश्लेषण आम तौर पर प्रयोगात्मक और नियंत्रण के नमूनों के बीच की तुलना में प्रतिलिपि की मात्रात्मक मूल्यांकन पर निर्भर हैं । लक्षित दृष्टिकोण, जैसे qRT-पीसीआर अपेक्षाकृत तेजी से और सटीक एकल जीन अभिव्यक्ति परिवर्तन की जांच के लिए कर रहे हैं । आरएनए अनुक्रमण (RNASeq) नमूनों के बीच जीन अभिव्यक्ति में महत्वपूर्ण परिवर्तन की पहचान करने के लिए एक व्यापक, परिकल्पना मुक्त दृष्टिकोण प्रदान करता है, यह अब प्रयोगात्मक प्रणालियों में इस तरह की जांच के लिए मानक बना ।
Zebrafish कई रोग क्षेत्रों में एक प्रमुख मॉडल के रूप में उभरा है । मूलतः विकास जीव विज्ञान के अध्ययन में उनकी उपयोगिता के लिए विकसित की है, उनके उच्च fecundity और रखरखाव के अपेक्षाकृत कम लागत के कारण, zebrafish के प्रायोगिक उपयोग के लिए भ्रूण से phenotypes की एक व्यापक रेंज वयस्क चरणों के रूप में शामिल करने के लिए विकसित किया गया है के रूप में अच्छी तरह से एक आणविक परख के वाइड सरणी1,2,3। दरअसल, इन फायदों आणविक यंत्रवत अध्ययन तेजी से और लागत प्रभावी सामग्री की बड़ी मात्रा में दोनों आनुवंशिक और पर्यावरण हेरफेर के जीवन के सभी चरणों में आसानी के साथ संयुक्त प्राप्त करने में आसानी की वजह से । इसके अलावा, zebrafish भ्रूण और लार्वा की पारदर्शी प्रकृति कोशिका पैदा करने और ऊतक-विशिष्ट ट्रांसजेनिक रिपोर्टर असतत कोशिका आबादी4के vivo दृश्य में अनुमति देने के लिए आदर्श बनाते हैं । इस तरह की लाइनों के शोषण रिपोर्टर जीन अभिव्यक्ति के आधार पर विशिष्ट पृथक कोशिका प्रकार में वैश्विक जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण परमिट ।
यहां हम वैश्विक जीन अभिव्यक्ति zebrafish भ्रूण की संस्कृति के बाद RNASeq का उपयोग विश्लेषण के लिए एक व्यापक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं । आनुवंशिक प्रयोगात्मक जोड़तोड़, morpholino सहित (एमओ)-क्षणिक जीन पछाड़ना या CRISPR मध्यस्थता जीनोम संपादन आधारित है, कहीं प्रस्तुत किया गया है5,6,7. इसलिए हम पूरे भ्रूण से आरएनए के अलगाव के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल पर ध्यान केंद्रित करने या ट्रांसजेनिक रिपोर्टर व्यक्त कोशिकाओं मार्ग उपकरण और जीन आंटलजी (जाओ) शर्तों का उपयोग कर RNASeq परिणामों के सरल गणनात्मक विश्लेषण द्वारा पीछा किया । अंत में, हम मात्रात्मक रिवर्स transcriptase पीसीआर (qRT-पीसीआर) द्वारा जीन अभिव्यक्ति परिवर्तन के सत्यापन के लिए एक रणनीति शामिल है । इन प्रोटोकॉल zebrafish आनुवंशिक म्यूटेंट या पर्यावरणीय स्थितियों की तुलना सहित प्रयोगात्मक शर्तों की एक विस्तृत श्रृंखला के अधीन भ्रूण के लिए लागू कर रहे हैं ।

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Commercial Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TriZol</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>15596026</td>
			<td>lysis reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12604013</td>
			<td>dissociation buffer 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSMax</td>
			<td>Genlantis</td>
			<td>T200100</td>
			<td>dissociation buffer 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC-treated water</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>95284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FirstStrand cDNA conversion</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>K1621</td>
			<td>cDNA conversion kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2X SYBR Green Master Mix</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4707516001</td>
			<td>qRT-PCR Master Mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS buffer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-105-9042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chloroform</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>288306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium acetate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S2889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zebrafish Strains</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tuebingen</td>
			<td>ZIRC</td>
			<td>ZL57</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ins2a:mCherry</td>
			<td>ZIRC</td>
			<td>ZL1483</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 micron cell strainer</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>CLS431750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS tube</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hemocytometer</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z359629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illumina HiSeq</td>
			<td>Illumina</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 480</td>
			<td>Roche</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mating tanks 1.0L Crossing Tank Set</td>
			<td>Aquaneering</td>
			<td>ZHCT100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS tube 5 mL polypropylene tube</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Consensus Path DB</td>
			<td>http://cpdb.molgen.mpg.de/</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GO Enrichment Analysis</td>
			<td colspan="2">http://geneontology.org/page/go-enrichment-analysis</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sample preparation and analysis of rnaseq-based gene expression data from zebrafish

वैश्विक जीन अभिव्यक्ति परिवर्तन के विश्लेषण मनाया phenotypes अंतर्निहित उपंयास रास्ते की पहचान के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण है । zebrafish पूरे पशु या व्यक्तिगत सेल पशुओं की बड़ी संख्या से आरएनए के अलगाव की आसानी के कारण आबादी से पूरे transcriptome के तेजी से मूल्यांकन के लिए एक उत्कृष्ट मॉडल है । यहां आरएनए अनुक्रमण (RNASeq) का उपयोग कर zebrafish भ्रूण में वैश्विक जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया है । हम पूरे भ्रूण से या सेल आबादी ट्रांसजेनिक पशुओं में छंटाई सेल का उपयोग प्राप्त से आरएनए की तैयारी का वर्णन । हम भी वैश्विक जीन अभिव्यक्ति डेटा सेट में समृद्ध रास्ते और जीन आंटलजी (GO) शब्दों की पहचान करने के लिए RNASeq डेटा के विश्लेषण के लिए एक दृष्टिकोण का वर्णन । अंत में, हम मात्रात्मक रिवर्स transcriptase पीसीआर (qRT-पीसीआर) का उपयोग जीन अभिव्यक्ति परिवर्तन के सत्यापन के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं । इन प्रोटोकॉल नियंत्रण और zebrafish के प्रयोगात्मक सेट के तुलनात्मक विश्लेषण के लिए उपंयास जीन अभिव्यक्ति परिवर्तन की पहचान के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, और ब्याज की phenotypes में आणविक अंतर्दृष्टि प्रदान करते हैं ।

विभेदक व्यक्त जीन की छंटाई:
Alström सिंड्रोम और Bardet-Biedl सिंड्रोम (किउ) के zebrafish मॉडल के लार्वा चरण में अंतर व्यक्त जीन की पहचान करने के लिए, हम पहले से मांय ब्याह इंजेक्शन द्वारा ...

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Sample Preparation and Analysis of RNASeq-based Gene Expression Data from Zebrafish

नमूना तैयारी और Zebrafish से RNASeq आधारित जीन अभिव्यक्ति डेटा का विश्लेषण

इस प्रोटोकॉल zebrafish भ्रूण, लार्वा, या हल कोशिकाओं से पूरे transcriptome विश्लेषण के लिए एक दृष्टिकोण प्रस्तुत करता है । हम आरएनए के अलगाव, RNASeq डेटा के मार्ग विश्लेषण शामिल हैं, और qRT-पीसीआर-जीन अभिव्यक्ति परिवर्तन के सत्यापन आधारित है ।

The analysis of global gene expression changes is a valuable tool for identifying novel pathways underlying observed phenotypes. The zebrafish is an ...

Research

JoVE Journal

Genetics

Parallel Measurement of Circadian Clock Gene Expression and Hormone Secretion in Human Primary Cell Cultures

मानव प्राथमिक सेल संस्कृतियों में circadian घड़ी जीन अभिव्यक्ति और हार्मोन के स्राव के समानांतर मापन

Circadian clocks are functional in all light-sensitive organisms, allowing for an adaptation to the external world by anticipating daily environmental ...

Single-cell Gene Expression Profiling Using FACS and qPCR with Internal Standards

एकल कोशिका जीन अभिव्यक्ति की रूपरेखा आंतरिक मानकों के साथ FACS और qPCR का उपयोग

Gene expression measurements from bulk populations of cells can obscure the considerable transcriptomic variation of individual cells within those ...

Studying Cell Cycle-regulated Gene Expression by Two Complementary Cell Synchronization Protocols

दो पूरक सेल तुल्यकालन प्रोटोकॉल द्वारा सेल चक्र-विनियमित जीन अभिव्यक्ति का अध्ययन करना

The gene expression program of the cell cycle represents a critical step for understanding cell cycle-dependent processes and their role in diseases such ...

Bidirectional Retroviral Integration Site PCR Methodology and Quantitative Data Analysis Workflow

द्विदिश रेट्रोवायरल इंटीग्रेशन साइट पीसीआर क्रियाविधि और मात्रात्मक डेटा विश्लेषण वर्कफ़्लो

Integration Site (IS) assays are a critical component of the study of retroviral integration sites and their biological significance. In recent retroviral ...

Measuring Gene Expression in Bombarded Barley Aleurone Layers with Increased Throughput

वृद्धि का प्रवाह के साथ बमबारी जौ Aleurone परतों में जीन अभिव्यक्ति मापने

The aleurone layer of barley grains is an important model system for hormone-regulated gene expression in plants. In aleurone cells, genes required for ...

An Optogenetic Method to Control and Analyze Gene Expression Patterns in Cell-to-cell Interactions

एक Optogenetic विधि को नियंत्रित करने और सेल में जीन अभिव्यक्ति पैटर्न का विश्लेषण करने वाली सेल बातचीत

Cells should respond properly to temporally changing environments, which are influenced by various factors from surrounding cells. The Notch signaling ...

An Ecdysone Receptor-based Singular Gene Switch for Deliberate Expression of Transgene with Robustness, Reversibility, and Negligible Leakiness

एक Ecdysone रिसेप्टर-मजबूती, Reversibility, और नगण्य Leakiness के साथ Transgene की जानबूझकर अभिव्यक्ति के लिए विलक्षण जीन स्विच आधारित

Precise control of transgene expression is desirable in biological and clinical studies. However, because the binary feature of currently employed gene ...

Exploring the Root Microbiome: Extracting Bacterial Community Data from the Soil, Rhizosphere, and Root Endosphere

जड़ Microbiome की खोज: मिट्टी, Rhizosphere से बैक्टीरियल समुदाय डेटा निकालने, और जड़ Endosphere

The intimate interaction between plant host and associated microorganisms is crucial in determining plant fitness, and can foster improved tolerance to ...

Informatic Analysis of Sequence Data from Batch Yeast 2-Hybrid Screens

बैच खमीर 2 से अनुक्रम डेटा का स्वरूप विश्लेषण-संकर स्क्रीन

We have adapted the yeast 2-hybrid assay to simultaneously uncover dozens of transient and static protein interactions within a single screen utilizing ...

Maintaining Biological Cultures and Measuring Gene Expression in Aphis nerii: A Non-model System for Plant-insect Interactions

Maintaining Biological Cultures and Measuring Gene Expression in Aphis nerii: A Non-model System for Plant-insect Interactions

जैविक संस्कृतियों को बनाए रखने और Aphis neriiमें जीन अभिव्यक्ति को मापने: संयंत्र के लिए एक गैर मॉडल प्रणाली-कीट बातचीत

Aphids are excellent experimental models for a variety of biological questions ranging from the evolution of symbioses and the development of polyphenisms ...