Name: sample preparation and analysis of rnaseq-based gene expression data from zebrafish
Uploaded: 2017-10-27T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Sample Preparation and Analysis of RNASeq-based Gene Expression Data from Zebrafish at JoVE.com

この作品は、T32DK098107、P30DK072488 (N.A.Z.) R01DK102001 (N.A.Z.) によって支えられた (T.L.H. および J.E.N.)。

以下の通り動物のすべてのプロトコルに従い、メリーランド州機関動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) の大学によって承認します。
 1 胚の準備 <ol><li>生成の胚を自然交配 <ol><li>、生後 3 か月に培養胚生殖成熟 5 , 8。.</li>
		<li>は採卵の前に、の晩に分割交尾タンクに目的のひずみからアダルト オスとメス魚を分離...

<ol>
	<li>Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Zebrafish. , (2002).</li><li>Detrich, H. W., Zon, L., Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Zebrafish: Disease Models and Chemical Screens. , (2017).</li><li>Detrich, H. W., Zon, L. I., Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Zebrafish: Genetics, Genomics, and Transcriptomics. , (2016).</li><li>Detrich, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Zebrafish: Genetics, Genomics and Informatics. , (2011).</li><li>Avdesh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regular+care+and+maintenance+of+a+zebrafish+(Danio+rerio)+laboratory:+an+introduction.">Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction.</a> J Vis Exp. (69), e4196 (2012).</li><li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+zebrafish+embryos+to+analyze+gene+function.">Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function.</a> J Vis Exp. (25), (2009).</li><li>Hwang, W. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+genome+editing+in+zebrafish+using+a+CRISPR-Cas+system.">Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system.</a> Nat Biotechnol. 31 (3), 227-229 (2013).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2000).</li><li>Rossi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+compensation+induced+by+deleterious+mutations+but+not+gene+knockdowns.">Genetic compensation induced by deleterious mutations but not gene knockdowns.</a> Nature. 524 (7564), 230-233 (2015).</li><li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish.">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).</li><li>Samsa, L. A., Fleming, N., Magness, S., Qian, L., Liu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Characterization+of+Single+Cells+from+Zebrafish+Embryos.">Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos.</a> J Vis Exp. (109), (2016).</li><li>. IDT Primerquest Tool Available from: <a target="_blank" href="https://www.idtdna.com/Primerquest/Home/Index">https://www.idtdna.com/Primerquest/Home/Index</a> (2017)</li><li>Heid, C. A., Stevens, J., Livak, K. J., Williams, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real+time+quantitative+PCR.">Real time quantitative PCR.</a> Genome Res. 6 (10), 986-994 (1996).</li><li>Leitch, C. C., Lodh, S., Prieto-Echague, V., Badano, J. L., Zaghloul, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basal+body+proteins+regulate+Notch+signaling+through+endosomal+trafficking.">Basal body proteins regulate Notch signaling through endosomal trafficking.</a> J Cell Sci. 127 (Pt 11), 2407-2419 (2014).</li><li>Lodh, S., Hostelley, T. L., Leitch, C. C., O'Hare, E. A., Zaghloul, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+effects+on+beta-cell+mass+by+disruption+of+Bardet-Biedl+syndrome+or+Alstrom+syndrome+genes.">Differential effects on beta-cell mass by disruption of Bardet-Biedl syndrome or Alstrom syndrome genes.</a> Hum Mol Genet. 25 (1), 57-68 (2016).</li><li>Hostelley, T. L., Lodh, S., Zaghloul, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+organism+transcriptome+analysis+of+zebrafish+models+of+Bardet-Biedl+Syndrome+and+Alstrom+Syndrome+provides+mechanistic+insight+into+shared+and+divergent+phenotypes.">Whole organism transcriptome analysis of zebrafish models of Bardet-Biedl Syndrome and Alstrom Syndrome provides mechanistic insight into shared and divergent phenotypes.</a> BMC Genomics. 17, 318 (2016).</li></ol>

このプロトコルで記述されているアプローチでは、全体の動物または特定のソートされた細胞集団のトランスクリプトーム レベル分析のため比較的迅速かつコスト効果の高い戦略を提供しています。ゼブラフィッシュのため使いやすさと出発物質、遺伝の実装の容易さや実験環境と大規模な可用性の大量の生成で、急速に研究のこのタイプの有利なモデルを提供します。細胞型の特定および...

遺伝子発現の比較分析、観察された表現型に貢献する新規の遺伝子を識別するために貴重なツールです。そのような分析は通常トラン スクリプトの豊富な比較実験の定量的評価に依存し、サンプルを制御します。QRT PCR など、ターゲットを絞ったアプローチが比較的迅速かつ単一遺伝子発現変動の調査のため正確です。RNA シーケンス (RNASeq) ことが今このような調査のための標準実験システム間でサンプル間の遺伝子発現の重要な変更を識別するために広い、無料の仮説のアプローチを提供しています。
ゼブラフィッシュは、多くの病気の分野で著名なモデルとして浮上しています。もともと彼らの高い多産と比較的低コスト、メンテナンスのための発生生物学研究でのユーティリティ ゼブラフィッシュの実験的使用として同様の大人の段階に胚から表現の広い範囲を含むように進化している、1,2,3の試金の分子の広い配列。確かに、これらの利点は、分子機構の研究は急速な人生のすべての段階で遺伝と環境両方の操作のしやすさと材料の大きい量を獲得しやすいのためコスト効果の高い結合します。さらに、ゼブラフィッシュの胚・仔魚の透過的な性質作る離散セル人口4の生体内可視化を許可する細胞と組織特異遺伝子改変レポーター行を生成するために理想的。このような行の搾取レポーター遺伝子発現に基づく特定の孤立セル型グローバル遺伝子発現解析が可能です。
ゼブラフィッシュ胚の培養後 RNASeq を使用して世界的な遺伝子発現解析のための包括的なプロトコルをご紹介します。Morpholino (MO) を含む遺伝子の実験操作-ベースの一過的遺伝子ノックダウンや CRISPR を介したゲノム編集、提示されている他5,6,7。したがって、全体の胚からの RNA の隔離のための詳しいプロトコルに焦点を当てるまたは経路ツールと遺伝子の ontology (GO) の用語を使用して RNASeq 結果の簡単な解析に続いてトランスジェニック レポーター発現細胞を並べ替えられます。最後に、我々 は定量的逆転写 PCR (qRT PCR) による遺伝子発現変動の検証のための戦略を含まれています。これらのプロトコルは、ゼブラフィッシュ胚の遺伝的変異体または環境条件の比較を含む、実験の条件の広い範囲を受けるに適用されます。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Commercial Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TriZol</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>15596026</td>
			<td>lysis reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12604013</td>
			<td>dissociation buffer 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSMax</td>
			<td>Genlantis</td>
			<td>T200100</td>
			<td>dissociation buffer 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC-treated water</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>95284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FirstStrand cDNA conversion</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>K1621</td>
			<td>cDNA conversion kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2X SYBR Green Master Mix</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4707516001</td>
			<td>qRT-PCR Master Mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS buffer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-105-9042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chloroform</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>288306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium acetate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S2889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zebrafish Strains</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tuebingen</td>
			<td>ZIRC</td>
			<td>ZL57</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ins2a:mCherry</td>
			<td>ZIRC</td>
			<td>ZL1483</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 micron cell strainer</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>CLS431750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS tube</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hemocytometer</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z359629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illumina HiSeq</td>
			<td>Illumina</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 480</td>
			<td>Roche</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mating tanks 1.0L Crossing Tank Set</td>
			<td>Aquaneering</td>
			<td>ZHCT100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS tube 5 mL polypropylene tube</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Consensus Path DB</td>
			<td>http://cpdb.molgen.mpg.de/</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GO Enrichment Analysis</td>
			<td colspan="2">http://geneontology.org/page/go-enrichment-analysis</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sample preparation and analysis of rnaseq-based gene expression data from zebrafish

グローバル遺伝子発現変動の解析は、観察された表現型の基になる新規経路を識別するための貴重なツールです。ゼブラフィッシュは動物の多数からの RNA の隔離のしやすさのため全体動物または個々 の細胞集団から全体のトランスクリプトームの迅速な評価の優れたモデルです。ここで RNA シーケンス (RNASeq) を用いたゼブラフィッシュ胚におけるグローバル遺伝子発現解析のためのプロトコルが表示されます。我々 は胚やトランスジェニック動物の細胞を用いての細胞集団から RNA の準備について説明します。濃縮経路と Gene Ontology (GO) 用語的遺伝子発現データセットを識別するために RNASeq データの解析のためのアプローチについて述べる。最後に、定量的逆転写 PCR (qRT PCR) を用いた遺伝子発現変動の検証のためのプロトコルを提供します。これらのプロトコルは、新規遺伝子発現変動を識別するためにコントロールの比較分析およびゼブラフィッシュの実験セットを使用ことができ、興味の表現型への分子洞察力を提供します。

遺伝子を発現特異的の並べ替え。
ゼブラフィッシュ モデル Alström 症候群とバルデ-ビードル症候群 (BBS) の幼虫の段階で発現が異なる遺伝子を識別するためには、いずれかのalms1を対象としたまたは注入によってbbs1の成績証明書は以前に MOs のスプライス ブロックを検証野生型のゼブラフィッシュの胚の<sup class...

Watch this Scientific Journal Video about Sample Preparation and Analysis of RNASeq-based Gene Expression Data from Zebrafish at JoVE.com

Sample Preparation and Analysis of RNASeq-based Gene Expression Data from Zebrafish

サンプル準備およびゼブラフィッシュから RNASeq による遺伝子発現データの解析

このプロトコルは、ゼブラフィッシュの胚は、幼虫から全体のトランスクリプトーム解析手法を提案またはセルを並べ替えられます。我々 には、RNA の隔離、RNASeq データの経路解析と遺伝子発現変動の qRT PCR による検証。

The analysis of global gene expression changes is a valuable tool for identifying novel pathways underlying observed phenotypes. The zebrafish is an ...

Research

JoVE Journal

Genetics

Parallel Measurement of Circadian Clock Gene Expression and Hormone Secretion in Human Primary Cell Cultures

ヒト初代細胞培養物における概日時計遺伝子発現やホルモン分泌のパラレル測定

Circadian clocks are functional in all light-sensitive organisms, allowing for an adaptation to the external world by anticipating daily environmental ...

Single-cell Gene Expression Profiling Using FACS and qPCR with Internal Standards

内部標準でFACSおよび定量PCRを用いた単一細胞遺伝子発現プロファイリング

Gene expression measurements from bulk populations of cells can obscure the considerable transcriptomic variation of individual cells within those ...

Studying Cell Cycle-regulated Gene Expression by Two Complementary Cell Synchronization Protocols

2つの相補的細胞同期プロトコルによる細胞周期制御遺伝子発現の研究

The gene expression program of the cell cycle represents a critical step for understanding cell cycle-dependent processes and their role in diseases such ...

Bidirectional Retroviral Integration Site PCR Methodology and Quantitative Data Analysis Workflow

双方向レトロウイルスの統合サイトPCRの方法論と定量的データ解析ワークフロー

Integration Site (IS) assays are a critical component of the study of retroviral integration sites and their biological significance. In recent retroviral ...

Measuring Gene Expression in Bombarded Barley Aleurone Layers with Increased Throughput

スループットを向上させると衝撃されたオオムギ糊粉層における遺伝子発現を測定

The aleurone layer of barley grains is an important model system for hormone-regulated gene expression in plants. In aleurone cells, genes required for ...

An Optogenetic Method to Control and Analyze Gene Expression Patterns in Cell-to-cell Interactions

制御、細胞間相互作用における遺伝子発現パターンを分析して光遺伝学的方法

Cells should respond properly to temporally changing environments, which are influenced by various factors from surrounding cells. The Notch signaling ...

An Ecdysone Receptor-based Singular Gene Switch for Deliberate Expression of Transgene with Robustness, Reversibility, and Negligible Leakiness

脱皮ホルモン受容体を介した特異遺伝子スイッチ意図的な堅牢性、可逆性、ごくわずかな水漏れしたためと遺伝子発現の

Precise control of transgene expression is desirable in biological and clinical studies. However, because the binary feature of currently employed gene ...

Exploring the Root Microbiome: Extracting Bacterial Community Data from the Soil, Rhizosphere, and Root Endosphere

探索ルート マイクロバイ: 土、根、およびルート Endosphere から細菌群集のデータを抽出

The intimate interaction between plant host and associated microorganisms is crucial in determining plant fitness, and can foster improved tolerance to ...

Informatic Analysis of Sequence Data from Batch Yeast 2-Hybrid Screens

バッチ酵母 2 ハイブリッド スクリーンからシーケンス データの情報解析

We have adapted the yeast 2-hybrid assay to simultaneously uncover dozens of transient and static protein interactions within a single screen utilizing ...

Maintaining Biological Cultures and Measuring Gene Expression in Aphis nerii: A Non-model System for Plant-insect Interactions

Maintaining Biological Cultures and Measuring Gene Expression in Aphis nerii: A Non-model System for Plant-insect Interactions

生物学的文化とワタアブラムシ neriiの遺伝子発現を測定を維持する: 植物・昆虫間の相互作用の非モデル系

Aphids are excellent experimental models for a variety of biological questions ranging from the evolution of symbioses and the development of polyphenisms ...