Name: sample preparation and analysis of rnaseq-based gene expression data from zebrafish
Uploaded: 2017-10-27T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Sample Preparation and Analysis of RNASeq-based Gene Expression Data from Zebrafish at JoVE.com

Este trabajo fue apoyado por R01DK102001 (N.A.Z.), P30DK072488 (N.A.Z.) y T32DK098107 (T.L.H. y J.E.N.).

animal todos los protocolos se detallan a continuación están de acuerdo con y aprobado por la Universidad de Maryland institucional Animal Care y el Comité uso (IACUC).
 1. preparación de embriones <ol><li>generar embriones a través de monta natural <ol><li>embriones de cultura a 3 meses de edad reproductiva madurez 5 , 8 .</li>
		<li>Separar peces adultos macho y hembra de la cepa deseada en tanques de acopl...

<ol>
	<li>Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Zebrafish. , (2002).</li><li>Detrich, H. W., Zon, L., Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Zebrafish: Disease Models and Chemical Screens. , (2017).</li><li>Detrich, H. W., Zon, L. I., Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Zebrafish: Genetics, Genomics, and Transcriptomics. , (2016).</li><li>Detrich, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Zebrafish: Genetics, Genomics and Informatics. , (2011).</li><li>Avdesh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regular+care+and+maintenance+of+a+zebrafish+(Danio+rerio)+laboratory:+an+introduction.">Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction.</a> J Vis Exp. (69), e4196 (2012).</li><li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+zebrafish+embryos+to+analyze+gene+function.">Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function.</a> J Vis Exp. (25), (2009).</li><li>Hwang, W. 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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+effects+on+beta-cell+mass+by+disruption+of+Bardet-Biedl+syndrome+or+Alstrom+syndrome+genes.">Differential effects on beta-cell mass by disruption of Bardet-Biedl syndrome or Alstrom syndrome genes.</a> Hum Mol Genet. 25 (1), 57-68 (2016).</li><li>Hostelley, T. L., Lodh, S., Zaghloul, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+organism+transcriptome+analysis+of+zebrafish+models+of+Bardet-Biedl+Syndrome+and+Alstrom+Syndrome+provides+mechanistic+insight+into+shared+and+divergent+phenotypes.">Whole organism transcriptome analysis of zebrafish models of Bardet-Biedl Syndrome and Alstrom Syndrome provides mechanistic insight into shared and divergent phenotypes.</a> BMC Genomics. 17, 318 (2016).</li></ol>

El enfoque se describe en este protocolo ofrece una estrategia relativamente rápida y rentable para el análisis a nivel de transcriptoma de animales enteros o de poblaciones celulares específicas ordenadas. El pez cebra proporciona un modelo ventajoso para este tipo de estudio debido a la facilidad y rapidez en la generación de grandes cantidades de a partir de material, la facilidad de la aplicación de genética o ambientales condiciones experimentales y la disponibilidad de una gran espectro de líneas transgénic...

Análisis comparativo de expresión génica global es una herramienta valiosa para identificar nuevos genes que contribuyen a los fenotipos observados. Tales análisis normalmente dependen de evaluación cuantitativa de la abundancia de transcripción comparada entre experimentales y control de muestras. Enfoques específicos, tales como qRT-PCR son relativamente rápido y preciso para la investigación de los cambios de expresión de gen único. La secuencia de RNA (RNASeq) ofrece un enfoque amplio, libre de hipótesis para identificar cambios significativos en la expresión génica entre las muestras, lo que es ahora el estándar para tales investigaciones a través de sistemas experimentales.
Pez cebra han surgido como un modelo prominente en muchas áreas de la enfermedad. Originalmente desarrollado para su utilidad en estudios de Biología del desarrollo, debido a su alta fecundidad y relativamente bajo costo de mantenimiento, uso experimental del pez cebra ha evolucionado para incluir una amplia gama de fenotipos de embrionario a etapas adultas así como un amplia gama de molecular ensayos de1,2,3. De hecho, estas ventajas hacen estudios mecanísticos moleculares rápido y rentable debido a la facilidad de adquirir grandes cantidades de material combinado con la facilidad de manipulación genética y ambiental en todas las etapas de la vida. Por otra parte, la naturaleza transparente de larvas y embriones de pez cebra lo hacen ideal para la generación de células y tejidos específicos reportero transgénicos líneas visualización en vivo de células discretas las poblaciones4. Explotación de dichas líneas permite análisis de expresión génica global en tipos específicos de la célula aislados basados en la expresión del gen reportero.
Aquí presentamos un protocolo integral para análisis de expresión génica global usando RNASeq después de cultivo de embriones de pez cebra. Manipulación genética experimental, incluyendo morfolino (MO)-caída de base gen transitoria o la edición del genoma mediada por CRISPR, se presentan en otras partes5,6,7. Por lo tanto, centrarse en un protocolo detallado para el aislamiento del ARN de embriones enteros o clasificado transgénicas células expresando reportero seguidas por simple análisis computacional de resultados RNASeq utilizando herramientas de la vía y términos de gene ontology (GO). Por último, hemos incluido una estrategia para la validación de los cambios de expresión génica por PCR (qRT-PCR) de la transcriptasa inversa cuantitativa. Estos protocolos son aplicables a los embriones de pez cebra sujetados a una amplia gama de condiciones experimentales, incluyendo comparación de mutantes genéticos o las condiciones ambientales.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Commercial Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TriZol</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>15596026</td>
			<td>lysis reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12604013</td>
			<td>dissociation buffer 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSMax</td>
			<td>Genlantis</td>
			<td>T200100</td>
			<td>dissociation buffer 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC-treated water</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>95284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FirstStrand cDNA conversion</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>K1621</td>
			<td>cDNA conversion kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2X SYBR Green Master Mix</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4707516001</td>
			<td>qRT-PCR Master Mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS buffer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-105-9042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chloroform</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>288306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium acetate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S2889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zebrafish Strains</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tuebingen</td>
			<td>ZIRC</td>
			<td>ZL57</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ins2a:mCherry</td>
			<td>ZIRC</td>
			<td>ZL1483</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 micron cell strainer</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>CLS431750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS tube</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hemocytometer</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z359629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illumina HiSeq</td>
			<td>Illumina</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 480</td>
			<td>Roche</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mating tanks 1.0L Crossing Tank Set</td>
			<td>Aquaneering</td>
			<td>ZHCT100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS tube 5 mL polypropylene tube</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Consensus Path DB</td>
			<td>http://cpdb.molgen.mpg.de/</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GO Enrichment Analysis</td>
			<td colspan="2">http://geneontology.org/page/go-enrichment-analysis</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sample preparation and analysis of rnaseq-based gene expression data from zebrafish

El análisis de los cambios de expresión génica global es una herramienta valiosa para la identificación de nuevas vías subyacen fenotipos observados. El pez cebra es un excelente modelo para la evaluación rápida de transcriptoma conjunto de poblaciones de todo animal o individuales de la célula debido a la facilidad de aislamiento de ARN de grandes cantidades de animales. Aquí se presenta un protocolo para el análisis de expresión génica global en embriones de pez cebra, mediante secuenciación del RNA (RNASeq). Se describe la preparación del ARN de embriones enteros o de poblaciones celulares obtenidas mediante célula clasificación en animales transgénicos. También se describe un enfoque para el análisis de datos RNASeq identificar vías enriquecidas y términos de Ontology del Gene (vaya) en conjuntos de datos de expresión génica global. Por último, proporcionamos un protocolo para la validación de los cambios de expresión génica utilizando transcriptasa inversa cuantitativa PCR (qRT-PCR). Estos protocolos pueden utilizarse para el análisis comparativo de control y grupos experimentales del pez cebra para identificar cambios de expresión de gene nuevo y proporcionan la penetración molecular en fenotipos de interés.

Clasificación de diferencialmente expresados Genes:
Para identificar genes diferencialmente expresados en la etapa larvaria del pez cebra modelos de síndrome de Alström y de síndrome de Bardet-Biedl (BBS), dirigido cualquiera alms1 o transcripciones bbs1 inyectando previamente validaron MOs En bloqueo de empalme embriones de pez cebra de tipo salvaje de16,17...

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Sample Preparation and Analysis of RNASeq-based Gene Expression Data from Zebrafish

Preparación de muestras y análisis de datos de expresión basada en RNASeq gen de pez cebra

Este protocolo presenta un enfoque para el análisis del transcriptoma completo de embriones de pez cebra, larvas, o clasificar las células. Se incluyen aislamiento de RNA, análisis de la vía de datos RNASeq y qRT-PCR-based validación de los cambios de expresión génica.

The analysis of global gene expression changes is a valuable tool for identifying novel pathways underlying observed phenotypes. The zebrafish is an ...

Research

JoVE Journal

Genetics

Parallel Measurement of Circadian Clock Gene Expression and Hormone Secretion in Human Primary Cell Cultures

La medición paralela de la expresión de genes circadianos del reloj y Hormona en cultivos celulares primarios humanos

Circadian clocks are functional in all light-sensitive organisms, allowing for an adaptation to the external world by anticipating daily environmental ...

Investigación

Genética

Single-cell Gene Expression Profiling Using FACS and qPCR with Internal Standards

Una sola célula de perfiles de expresión génica El uso de FACS y qPCR con las Normas Internas

Gene expression measurements from bulk populations of cells can obscure the considerable transcriptomic variation of individual cells within those ...

Studying Cell Cycle-regulated Gene Expression by Two Complementary Cell Synchronization Protocols

Estudio de la expresión genética regulada por el ciclo celular mediante dos protocolos complementarios de sincronización celular

The gene expression program of the cell cycle represents a critical step for understanding cell cycle-dependent processes and their role in diseases such ...

Bidirectional Retroviral Integration Site PCR Methodology and Quantitative Data Analysis Workflow

Sitio de Integración Retroviral Bidireccional Metodología de PCR y Flujo de Trabajo de Análisis de Datos Cuantitativos

Integration Site (IS) assays are a critical component of the study of retroviral integration sites and their biological significance. In recent retroviral ...

Measuring Gene Expression in Bombarded Barley Aleurone Layers with Increased Throughput

Medir la expresión génica en capas de aleurona de cebada bombardeado con mayor rendimiento

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