Name: simple elimination of background fluorescence in formalin-fixed human brain tissue for immunofluorescence microscopy
Uploaded: 2017-09-03T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Simple Elimination of Background Fluorescence in Formalin-Fixed Human Brain Tissue for Immunofluorescence Microscopy at JoVE.com

Denne undersøgelse blev støttet i hele eller en del af den canadiske konsortium af Neurodegeneration og aldring (CCNA), det canadiske Institut for sundhed Research (CIHR), ALS Society of Canada (ALS Canada) og Alzheimers samfund i Canada (ASC). Forfatterne vil gerne takke Sultan Darvesh og Andrew Reid fra Maritime hjernen væv banken til at yde FTLD hjernen væv, Milano Ganguly fra programmet Spatio-temporale målretning og forstærkning af stråling svar (STTARR) og dens tilknyttede finansiering agenturer for væv indlejring og skæring tjenester, og den avancerede Optisk mikroskopi facilitet (AOMF) for at give mikroskopi instrumenter. Kevin Hadley er takkede for kritisk gennemgang af håndskriftet.

Bemærk: arbejde præsenteret blev udført i overensstemmelse med anerkendte internationale standarder, herunder den internationale konference om harmonisering (ICH), Rådet for internationale organisationer af medicinske videnskaber (CIOMS) , og principperne i Helsinki-erklæringen. Brugen af menneskelige væv blev med godkendelse af University Health Network forskningsudvalg etik. De menneskelige hjerne prøver blev indsamlet som en del af den Maritime hjernen væv Bank. På tidspunktet for indsamlingen, informeret sa...

<ol>
	<li>Banerjee, B., Miedema, B. E., Chandrasekhar, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+basement+membrane+collagen+and+elastin+in+the+autofluorescence+spectra+of+the+colon.">Role of basement membrane collagen and elastin in the autofluorescence spectra of the colon.</a> J Investig Med. 47 (6), 326-332 (1999).</li><li>Terman, A., Brunk, U. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipofuscin+.">Lipofuscin .</a> Int J Biochem Cell Biol. 36 (8), 1400-1404 (2004).</li><li>Del Castillo, P., Llorente, A. R., Stockert, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+fixation,+exciting+light+and+section+thickness+on+the+primary+fluorescence+of+samples+for+microfluorometric+analysis.">Influence of fixation, exciting light and section thickness on the primary fluorescence of samples for microfluorometric analysis.</a> Basic Appl Histochem. 33 (3), 251-257 (1989).</li><li>Ottis, P., Koppe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+and+rat+brain+lipofuscin+proteome.">Human and rat brain lipofuscin proteome.</a> Proteomics. 12 (15-16), 2445-2454 (2012).</li><li>Sun, Y., Chakrabartty, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cost-effective+elimination+of+lipofuscin+fluorescence+from+formalin-fixed+brain+tissue+by+white+phosphor+light+emitting+diode+array.">Cost-effective elimination of lipofuscin fluorescence from formalin-fixed brain tissue by white phosphor light emitting diode array.</a> Biochem Cell Biol. 94 (6), 545-550 (2016).</li><li>Davis, A. S., Richter, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+and+Diminishing+Autofluorescence+in+Formalin-fixed+Paraffin-embedded+Human+Respiratory+Tissue.">Characterizing and Diminishing Autofluorescence in Formalin-fixed Paraffin-embedded Human Respiratory Tissue.</a> J Histochem Cytochem. 62 (6), 405-423 (2014).</li><li>Zimmermann, T., Rietdorf, J., Pepperkok, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectral+imaging+and+its+applications+in+live+cell+microscopy.">Spectral imaging and its applications in live cell microscopy.</a> FEBS Lett. 546 (1), 87-92 (2003).</li><li>Duong, H., Han, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multispectral+LED+array+for+the+reduction+of+background+autofluorescence+in+brain+tissue.">A multispectral LED array for the reduction of background autofluorescence in brain tissue.</a> J Neurosci Methods. 220 (1), 46-54 (2013).</li><li>Albeanu, D. F., Soucy, E., Sato, T. F., Meister, M., Murthy, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LED+arrays+as+cost+effective+and+efficient+light+sources+for+widefield+microscopy.">LED arrays as cost effective and efficient light sources for widefield microscopy.</a> PLoS One. 3 (5), 1-7 (2008).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Robertson, J. B., Zhang, Y., Johnson, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-emitting+diode+flashlights+as+effective+and+inexpensive+light+sources+for+fluorescence+microscopy.">Light-emitting diode flashlights as effective and inexpensive light sources for fluorescence microscopy.</a> J Microsc. 236 (1), 1-4 (2009).</li><li>Mackenzie, I. R. A., Neumann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+neuropathology+of+frontotemporal+dementia:+insights+into+disease+mechanisms+from+postmortem+studies.">Molecular neuropathology of frontotemporal dementia: insights into disease mechanisms from postmortem studies.</a> J Neurochem. 138 (S1), 54-70 (2016).</li><li>Kouri, N., Whitwell, J. L., Josephs, K. A., Rademakers, R., Dickson, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Corticobasal+degeneration:+a+pathologically+distinct+4R+tauopathy.">Corticobasal degeneration: a pathologically distinct 4R tauopathy.</a> Nat Rev Neurol. 7 (5), 263-272 (2011).</li></ol>

Photobleaching forbehandling af væv, der er beskrevet i dette håndskrift giver mulighed for effektiv fjernelse af autofluorescence ved hjælp af off-the-shelf komponenter. Protokollen beskriver immunofluorescens billeddannelse af fosforyleres tau aggregater i formalin-fast menneskelige hjernevæv ved hjælp af sekundære antistoffer konjugeret til Alexa 488 og Texas rød, med DAPI som en nuklear kontrastfarve. For at anvende metoden til andre væv, anbefaler vi udfører en 48 h photobleaching forbehandling til prøven ...

Fluorescens mikroskopi af antistoffer rettet mod specifikke proteiner bruges rutinemæssigt til at visualisere proteiner af interesse i cellekultur og væv. En væsentlig komplikation til erhvervelse af klare og endelige billeder i immunofluorescens er autofluorescence, som kan være forårsaget endogent i pattedyrvæv alder pigment lipofuscin og proteiner som elastin og kollagen1, 2. Andre kilder til autofluorescence kan indføres gennem prøven forberedelsestrin såsom aldehyd fiksering3. Lipofuscin granulat, sammensat primært af oxidativt modificerede proteiner og lipid nedbrydning restkoncentrationer, ophobes i lang-levende celler med øget alder2. Dette medfører vanskeligheder i imaging postmitotic væv af hjerne og hjerte eller skelet muskler, som fluorescens emission spektrum af lipofuscin er bred og variable, ofte sammenfaldende med emission bølgelængde af fælles fluorophores anvendes til mærkning4. Disse faktorer gør billeddannelse af menneskelige hjernevæv fra tilfælde af sent indsættende neurodegenerative sygdomme som frontotemporal lobar degeneration (FTLD) især udfordrende.
For at reducere autofluorescence, har vi udviklet en teknik, hvor vi bestråle afsnittene slide-monteret væv med en hvid lysemitterende (LED) diodearray ved brug af en husholdnings desk lamp5. Denne enkle teknik giver et alternativ til teknikker, der bruger kemiske quenchers såsom CuSO4 ammoniumacetat, eller kommercielt tilgængelige quenching farvestoffer som Sudan Black B og Eriochromsort sort T6. Det har også betydelige besparelser over multispektrale LED lampe photobleaching teknikker og undgår komplikationer og artefakter genereret fra digital autofluorescence fjernelse metoder såsom spektrale un-blanding7,8. Hvid fosfor lysdioder har en bred emission spektrum, høj lysstyrke og lave produktionsomkostninger, hvilket gør dem ideelle som en off-the-shelf komponent for photobleaching en række lysopfangende5,9.
I denne protokol, vi demonstrere opførelsen af et photobleaching apparat ved hjælp af tilgængelige komponenter og anvende photobleaching på en sag af FTLD væv indeholdende tau-positive indeslutninger (FTLD-T) ved hjælp af en antistof specifik for fosforyleres tau. Vi demonstrere effekten af photobleaching på imaging fluorescently mærket antistoffer beskæftiger to almindeligt anvendte lysopfangende: Alexa 488 og Texas rød. Effekten af photobleaching versus ubehandlet sektioner eller disse blev behandlet med en kommerciel kemiske quencher er kvantificeret og sammenlignet. Denne photobleaching forbehandling kan indarbejdes i enhver standard immunofluorescens farvnings-protokollen til at fjerne autofluorescence i en biologisk prøve.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="999">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:328px;">Trizma Base</td>
			<td style="width:167px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">T6066</td>
			<td style="width:400px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sodium Choloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Hydrochloric Acid</td>
			<td>Caledon Laboratory Chemicals</td>
			<td>1506656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sodium Azide</td>
			<td>BioShop Canada</td>
			<td>SAZ001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">100 mm x 100 mm x 20 mm Pitri dish</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>82.9923.422</td>
			<td>All components of photobleacher can be substituted based on availability</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">6 W LED Dimmable Desk Lamp</td>
			<td>DBPower</td>
			<td>DS501</td>
			<td>All components of photobleacher can be substituted based on availability</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Citric Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C-2404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ethylenediaminetetraacetic acid&#160;(EDTA)</td>
			<td>BioShop Canada</td>
			<td>EDT001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P-7949</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sodium Hydroxide</td>
			<td>BioShop Canada</td>
			<td>SHY700.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Water bath</td>
			<td>Haake Fisons</td>
			<td>K15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Slide collector</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>12-587-17B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Staining Jar</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>E94</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Orbital Shaker</td>
			<td>Bellco Glass</td>
			<td>&#160;7744-08115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T7878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Bovine Serum Albumin</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>BP1600-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Normal Goat Serum</td>
			<td>Aurion</td>
			<td>905.002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Hydrophobic pen</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z672548-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Phospho-Tau (Ser202, Thr205) Monoclonal Antibody (AT8)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>MN1020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Goat anti-Mouse Secondary Antibody, Texas Red-X</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>T862</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Goat anti-Mouse Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A-11029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Mounting medium</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>28-600-42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Glass soverslip</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Confocal Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Imaging software ZEN 2012 Black Edition 11.0</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM710</td>
			<td>Software accompanies the Confocal Microscope</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ImageJ</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td>https://imagej.nih.gov/ij/download.html</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RGB Profile Tools macro</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td>https://imagej.nih.gov/ij/macros/tools/RGBProfilesTool.txt</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Commercial chemical quencher</td>
			<td>Biotum</td>
			<td>23007</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simple elimination of background fluorescence in formalin-fixed human brain tissue for immunofluorescence microscopy

Immunfluorescens er en fælles metode, der bruges til at visualisere subcellulært rum og bestemme lokalisering af specifikke proteiner inden en vævsprøve. En stor hindring for erhvervelsen af høj kvalitet immunofluorescens billeder er endogene autofluorescence af væv forårsaget af ældning pigmenter såsom lipofuscin eller fælles prøve forberedelse processer såsom aldehyd fiksering. Denne protokol beskriver, hvordan baggrunden fluorescens kan være stærkt reduceret gennem photobleaching ved hjælp af hvid fosfor light emitting diode (LED) arrays inden behandling med fluorescerende sonder. Bredspektret emission af hvid fosfor lysdioder giver mulighed for blegning af fluorophores på tværs af en vifte af emission toppe. Photobleaching apparat kan være fremstillet af off-the-shelf komponenter til en meget lav pris og giver en tilgængelige alternativ til kommercielt tilgængelige kemiske quenchers. En photobleaching forbehandling af vævet efterfulgt af konventionelle immunofluorescens farvning genererer billeder gratis baggrund autofluorescence. I forhold til etableret kemiske quenchers, som reducerede sonde samt baggrund signaler, photobleaching behandling havde ingen effekt på sonden fluorescens intensitet, mens det effektivt reduceret baggrund og lipofuscin fluorescens. Selvom photobleaching kræver mere tid til forbehandling, kan højere intensitet LED arrays bruges til at reducere photobleaching tid. Denne enkle metode kan potentielt anvendes til en bred vifte af væv, især postmitotic væv, der ophobes lipofuscin som hjernen, og hjerte- eller skelet muskler.

Photobleaching forbehandling trin kan føjes til en standard immunofluorescens protokollen umiddelbart før antigen hentning og immunfarvning (figur 1A). Montering af photobleaching apparater kan også udføres ved hjælp af forskellige, billig, off-the-shelf komponenter (figur 1B). Emission spektrum af hvid fosfor lysdioder dækker en bred vifte af bølgelængder, hvilket gør dem egnet til bred vifte photobleaching, enig med ti...

Watch this Scientific Journal Video about Simple Elimination of Background Fluorescence in Formalin-Fixed Human Brain Tissue for Immunofluorescence Microscopy at JoVE.com

Simple Elimination of Background Fluorescence in Formalin-Fixed Human Brain Tissue for Immunofluorescence Microscopy

Simpel fjernelse af baggrunden fluorescens i Formalin-fast menneskelige hjernevæv til immunofluorescens mikroskopi

Baggrund autofluorescence biologiske prøver komplicerer ofte fluorescens-baserede Billeddannende teknikker, især i alderen postmitotic væv. Denne protokol beskriver hvordan autofluorescence fra disse prøver kan fjernes effektivt ved hjælp af en kommercielt tilgængelig lysemitterende diode lys kilde til photobleach prøven før immunfarvning.

Immunofluorescence is a common method used to visualize subcellular compartments and to determine the localization of specific proteins within a tissue ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Optimized Protocol for the Extraction of Proteins from the Human Mitral Valve

Optimeret protokol til ekstraktion af proteiner fra humanmitralventilen

Analysis of the cellular proteome can help to elucidate the molecular mechanisms underlying diseases due to the development of technologies that permit ...

Optimal Preparation of Formalin Fixed Samples for Peptide Based Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry Imaging Workflows

Optimal forberedelse af Formalin fast prøver for peptid baseret Matrix Assisted Laser Desorption/Ionisation massespektrometri Imaging arbejdsprocesser

The use of matrix-assisted laser desorption/ionization, mass spectrometry imaging (MALDI MSI) has rapidly expanded, since this technique analyzes a host ...

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

En simpel metode til High Throughput kemisk Screening i Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

Høj følsomhed måling af transskription faktor-DNA bindende tilhørsforhold ved konkurrencedygtige titrering med Fluorescens mikroskopi

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

An All-in-one Sample Holder for Macromolecular X-ray Crystallography with Minimal Background Scattering

En all-in-One-prøve holder til makromolekylær røntgenkrystallografi med minimal baggrunds spredning

Macromolecular X-ray crystallography (MX) is the most prominent method to obtain high-resolution three-dimensional knowledge of biological macromolecules. ...

Mitochondria and Endoplasmic Reticulum Imaging by Correlative Light and Volume Electron Microscopy

Mitokondrier og Endoplasmic reticulum Imaging af Korrelativ lys og volumen elektronmikroskopi

Cellular organelles, such as mitochondria and endoplasmic reticulum (ER), create a network to perform a variety of functions. These highly curved ...

Interactions with and Membrane Permeabilization of Brain Mitochondria by Amyloid Fibrils

Interaktioner med og membran Permeabilisering af hjernen mitochondrier af amyloid Fibrils

A growing body of evidence indicates that membrane permeabilization, including internal membranes such as mitochondria, is a common feature and primary ...

Production of Dynein and Kinesin Motor Ensembles on DNA Origami Nanostructures for Single Molecule Observation

Produktion af dynein og Kinesin motor ensembler på DNA origami nanostrukturer til observation af et enkelt molekyle

Cytoskeletal motors are responsible for a wide variety of functions in eukaryotic cells, including mitosis, cargo transport, cellular motility, and ...

Myosin-Specific Adaptations of In vitro Fluorescence Microscopy-Based Motility Assays

Myosin-specifikke tilpasninger af In vitro Fluorescens Mikroskopi-Baserede Motilitet Assays

Myosin proteins bind and interact with filamentous actin (F-actin) and are found in organisms across the phylogenetic tree. Their structure and enzymatic ...

Continuous Fluorescence-Based Endonuclease-Coupled DNA Methylation Assay to Screen for DNA Methyltransferase Inhibitors

Kontinuerlig fluorescensbaseret endonukleasekoblet DNA-methyleringsassay til screening for DNA-methyltransferasehæmmere

DNA methylation, a form of epigenetic gene regulation, is important for normal cellular function. In cells, proteins called DNA methyltransferases (DNMTs) ...