Name: simple elimination of background fluorescence in formalin-fixed human brain tissue for immunofluorescence microscopy
Uploaded: 2017-09-03T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Simple Elimination of Background Fluorescence in Formalin-Fixed Human Brain Tissue for Immunofluorescence Microscopy at JoVE.com

Deze studie werd ondersteund in geheel of gedeeltelijk door de Canadese Consortium van neurodegeneratie en veroudering (CCNA), het Canadese Instituut van gezondheid onderzoek (CIHR), de ALS Society of Canada (ALS Canada), en de maatschappij van Alzheimer van Canada (ASC). De auteurs bedank Sultan Darvesh en Andrew Reid van de maritieme weefselbank van de hersenen voor het verstrekken van de FTLD hersenen weefsels, Milaan Ganguly uit de Spatio-temporele Targeting en versterking van straling reactie (STTARR) programma en haar verbonden financiering van agentschappen voor weefsel insluiten en segmenteren van diensten, en de geavanceerde optische microscopie Facility (AOMF) voor het verstrekken van microscopie instrumenten. Kevin Hadley is bedankte voor kritische evaluatie van het manuscript.

Opmerking: het werk gepresenteerd werd uitgevoerd in overeenstemming met erkende internationale normen, met inbegrip van de internationale conferentie voor harmonisatie (ICH), de Raad voor internationale organisaties van medische wetenschappen (CIOMS) , en de beginselen van de verklaring van Helsinki. Gebruik van menselijk weefsel was met de goedkeuring van University Health Network onderzoek Ethics Board. De menselijke hersenen monsters werden verzameld als onderdeel van de maritieme weefselbank van de hersenen. Op het...

<ol>
	<li>Banerjee, B., Miedema, B. E., Chandrasekhar, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+basement+membrane+collagen+and+elastin+in+the+autofluorescence+spectra+of+the+colon.">Role of basement membrane collagen and elastin in the autofluorescence spectra of the colon.</a> J Investig Med. 47 (6), 326-332 (1999).</li><li>Terman, A., Brunk, U. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipofuscin+.">Lipofuscin .</a> Int J Biochem Cell Biol. 36 (8), 1400-1404 (2004).</li><li>Del Castillo, P., Llorente, A. R., Stockert, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+fixation,+exciting+light+and+section+thickness+on+the+primary+fluorescence+of+samples+for+microfluorometric+analysis.">Influence of fixation, exciting light and section thickness on the primary fluorescence of samples for microfluorometric analysis.</a> Basic Appl Histochem. 33 (3), 251-257 (1989).</li><li>Ottis, P., Koppe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+and+rat+brain+lipofuscin+proteome.">Human and rat brain lipofuscin proteome.</a> Proteomics. 12 (15-16), 2445-2454 (2012).</li><li>Sun, Y., Chakrabartty, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cost-effective+elimination+of+lipofuscin+fluorescence+from+formalin-fixed+brain+tissue+by+white+phosphor+light+emitting+diode+array.">Cost-effective elimination of lipofuscin fluorescence from formalin-fixed brain tissue by white phosphor light emitting diode array.</a> Biochem Cell Biol. 94 (6), 545-550 (2016).</li><li>Davis, A. S., Richter, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+and+Diminishing+Autofluorescence+in+Formalin-fixed+Paraffin-embedded+Human+Respiratory+Tissue.">Characterizing and Diminishing Autofluorescence in Formalin-fixed Paraffin-embedded Human Respiratory Tissue.</a> J Histochem Cytochem. 62 (6), 405-423 (2014).</li><li>Zimmermann, T., Rietdorf, J., Pepperkok, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectral+imaging+and+its+applications+in+live+cell+microscopy.">Spectral imaging and its applications in live cell microscopy.</a> FEBS Lett. 546 (1), 87-92 (2003).</li><li>Duong, H., Han, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multispectral+LED+array+for+the+reduction+of+background+autofluorescence+in+brain+tissue.">A multispectral LED array for the reduction of background autofluorescence in brain tissue.</a> J Neurosci Methods. 220 (1), 46-54 (2013).</li><li>Albeanu, D. F., Soucy, E., Sato, T. F., Meister, M., Murthy, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LED+arrays+as+cost+effective+and+efficient+light+sources+for+widefield+microscopy.">LED arrays as cost effective and efficient light sources for widefield microscopy.</a> PLoS One. 3 (5), 1-7 (2008).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Robertson, J. B., Zhang, Y., Johnson, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-emitting+diode+flashlights+as+effective+and+inexpensive+light+sources+for+fluorescence+microscopy.">Light-emitting diode flashlights as effective and inexpensive light sources for fluorescence microscopy.</a> J Microsc. 236 (1), 1-4 (2009).</li><li>Mackenzie, I. R. A., Neumann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+neuropathology+of+frontotemporal+dementia:+insights+into+disease+mechanisms+from+postmortem+studies.">Molecular neuropathology of frontotemporal dementia: insights into disease mechanisms from postmortem studies.</a> J Neurochem. 138 (S1), 54-70 (2016).</li><li>Kouri, N., Whitwell, J. L., Josephs, K. A., Rademakers, R., Dickson, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Corticobasal+degeneration:+a+pathologically+distinct+4R+tauopathy.">Corticobasal degeneration: a pathologically distinct 4R tauopathy.</a> Nat Rev Neurol. 7 (5), 263-272 (2011).</li></ol>

De photobleaching voorbehandeling van weefsels die worden beschreven in dit manuscript zorgt voor effectieve eliminatie van autofluorescence overal verkrijgbare componenten gebruiken. Het protocol beschrijft immunofluorescentie beeldvorming van gefosforyleerd tau aggregaten in formaline-vaste menselijk hersenweefsel met behulp van secundaire antilichamen zijn geconjugeerd met Alexa 488 en Texas rood, met DAPI als een nucleaire counterstain. Om de methode toepassen op andere weefsels, is het raadzaam voor het uitvoeren va...

Microscopie van de fluorescentie met antilichamen gericht op specifieke proteïnen is routinematig gebruikt om te visualiseren van eiwitten van belang in celkweek en weefsels. Een belangrijke complicatie voor de verwerving van duidelijke en definitieve afbeeldingen in immunofluorescentie is autofluorescence, die kan worden veroorzaakt endogeen in zoogdieren weefsel door de leeftijd pigment lipofuscin en eiwitten zoals elastine en collageen1, 2. Andere bronnen van autofluorescence kunnen worden ingevoerd door monster voorbereiding stappen zoals aldehyde fixatie3. Lipofuscin korrels, voornamelijk samengesteld uit oxidatively gemodificeerd eiwit en de residuen van de afbraak van de lipide, accumuleren in lange-levende cellen met toenemende leeftijd2. Dit veroorzaakt problemen in imaging postmitotic weefsels zoals de hersenen en cardiale of skelet spieren, zoals de fluorescentie emissiespectrum van lipofuscin is breed en variabele, vaak samenvalt met de golflengte van de emissie van gemeenschappelijke fluorophores gebruikt voor labelen van4. Deze factoren maken beeldvorming van menselijk hersenweefsel van gevallen van late-onset neurodegeneratieve ziekten zoals Frontotemporale lobar degeneratie (FTLD) bijzonder uitdagend.
Verklein autofluorescence en hebben we een techniek waarbij we de dia gemonteerde weefselsecties bestralen met een wit licht emitterende diode (LED) array gebruikmakend van een huishoudelijke desk lamp5bedacht. Deze eenvoudige techniek biedt een alternatief voor technieken die gebruik maken van chemische quenchers zoals CuSO4 in ammoniumacetaat, of in de handel verkrijgbare blussen kleurstoffen zoals Soedan zwart B en eriochroomzwart T6. Het heeft ook aanzienlijke kostenbesparende over multispectrale LED lamp photobleaching technieken en vermijdt complicaties en artefacten die zijn gegenereerd op basis van digitale autofluorescence verwijdermethoden zoals spectrale un-mix7,8. Witte fosfor LEDs hebben een breed emissiespectrum, hoge helderheid en lage productiekosten, waardoor ze ideaal zijn als een off-the-shelf component voor photobleaching een verscheidenheid van chromophores5,9.
In dit protocol, we aantonen dat de bouw van een photobleaching-apparaat met behulp van toegankelijke componenten en photobleaching gelden voor een geval van FTLD weefsel bevattende tau-positieve insluitsels (FTLD-T) met behulp van een antilichaam specifiek voor gefosforyleerd tau. We tonen het effect van photobleaching op imaging fluorescently gelabelde antilichamen met twee veelgebruikte chromophores: Alexa 488 en Texas rood. Het effect van photobleaching ten opzichte van de onbehandelde secties of degenen met een commerciële chemische quencher behandeld worden gekwantificeerd en vergeleken. Deze voorbehandeling photobleaching kan worden opgenomen in elk standaard immunofluorescentie kleuring protocol te verwijderen van de autofluorescence in een biologische steekproef.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="999">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:328px;">Trizma Base</td>
			<td style="width:167px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">T6066</td>
			<td style="width:400px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sodium Choloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Hydrochloric Acid</td>
			<td>Caledon Laboratory Chemicals</td>
			<td>1506656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sodium Azide</td>
			<td>BioShop Canada</td>
			<td>SAZ001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">100 mm x 100 mm x 20 mm Pitri dish</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>82.9923.422</td>
			<td>All components of photobleacher can be substituted based on availability</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">6 W LED Dimmable Desk Lamp</td>
			<td>DBPower</td>
			<td>DS501</td>
			<td>All components of photobleacher can be substituted based on availability</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Citric Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C-2404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ethylenediaminetetraacetic acid&#160;(EDTA)</td>
			<td>BioShop Canada</td>
			<td>EDT001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P-7949</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sodium Hydroxide</td>
			<td>BioShop Canada</td>
			<td>SHY700.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Water bath</td>
			<td>Haake Fisons</td>
			<td>K15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Slide collector</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>12-587-17B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Staining Jar</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>E94</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Orbital Shaker</td>
			<td>Bellco Glass</td>
			<td>&#160;7744-08115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T7878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Bovine Serum Albumin</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>BP1600-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Normal Goat Serum</td>
			<td>Aurion</td>
			<td>905.002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Hydrophobic pen</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z672548-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Phospho-Tau (Ser202, Thr205) Monoclonal Antibody (AT8)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>MN1020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Goat anti-Mouse Secondary Antibody, Texas Red-X</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>T862</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Goat anti-Mouse Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A-11029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Mounting medium</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>28-600-42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Glass soverslip</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Confocal Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Imaging software ZEN 2012 Black Edition 11.0</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM710</td>
			<td>Software accompanies the Confocal Microscope</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ImageJ</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td>https://imagej.nih.gov/ij/download.html</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RGB Profile Tools macro</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td>https://imagej.nih.gov/ij/macros/tools/RGBProfilesTool.txt</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Commercial chemical quencher</td>
			<td>Biotum</td>
			<td>23007</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simple elimination of background fluorescence in formalin-fixed human brain tissue for immunofluorescence microscopy

Immunofluorescentie is een gemeenschappelijke methode gebruikt om te visualiseren subcellular compartimenten en om te bepalen van de lokalisatie van specifieke proteïnen binnen een weefsel monster. Een grote belemmering voor de overname van afbeeldingen van hoge kwaliteit immunofluorescentie is endogene autofluorescence van het weefsel veroorzaakt door veroudering pigmenten zoals lipofuscin of door gemeenschappelijke monster preparatietechnieken zoals fixatie van de aldehyde. Dit protocol beschrijft hoe achtergrond fluorescentie kan sterk worden verminderd door photobleaching gebruik van witte fosfor lichtemitterende diode (LED) arrays voorafgaand aan de behandeling met fluorescerende sondes. De breedspectrum uitstoot van witte fosfor LEDs zorgen voor het bleken van fluorophores in een heel scala van emissie pieken. De photobleaching apparatuur kan worden geconstrueerd van off-the-shelf onderdelen tegen zeer lage kosten en biedt een toegankelijk alternatief voor commercieel beschikbare chemische quenchers. Een photobleaching voorbehandeling van het weefsel gevolgd door conventionele immunofluorescentie kleuring produceert beelden gratis achtergrond autofluorescence. In vergelijking tot stand gebracht van chemische quenchers die verminderd sonde evenals achtergrond signalen, photobleaching behandeling had geen effect op de sonde fluorescentie intensiteit terwijl het effectief verminderd achtergrond en lipofuscin fluorescentie. Hoewel photobleaching meer tijd voor voorbehandeling vereist, kunnen hogere intensiteit LED-arrays worden gebruikt om photobleaching tijd te verminderen. Deze eenvoudige methode kan mogelijk worden toegepast op een verscheidenheid van weefsels, met name postmitotic weefsels die zich ophopen van lipofuscin zoals de hersenen en cardiale of skelet spieren.

De stap van de voorbehandeling photobleaching kan worden toegevoegd aan een standaard immunofluorescentie protocol onmiddellijk voorafgaand aan de herwinning van het antigeen en immunokleuring (figuur 1A). Vergadering van het photobleaching apparaat kan ook worden uitgevoerd met behulp van diverse, goedkoop, overal verkrijgbare componenten (figuur 1B). Het emissiespectrum van witte fosfor LEDs bestrijkt een breed scala van golfle...

Watch this Scientific Journal Video about Simple Elimination of Background Fluorescence in Formalin-Fixed Human Brain Tissue for Immunofluorescence Microscopy at JoVE.com

Simple Elimination of Background Fluorescence in Formalin-Fixed Human Brain Tissue for Immunofluorescence Microscopy

Eenvoudige verwijdering van achtergrond fluorescentie in formaline-vaste menselijk hersenweefsel voor immunofluorescentie microscopie

Achtergrond autofluorescence van biologische monsters bemoeilijkt vaak fluorescentie gebaseerde beeldvormingstechnieken, vooral in de leeftijd postmitotic weefsels. Dit protocol beschrijft hoe de autofluorescence van deze monsters effectief kan worden verwijderd met behulp van een commercieel beschikbare licht emitterende diode licht het monster vóór immunokleuring photobleach bron.

Immunofluorescence is a common method used to visualize subcellular compartments and to determine the localization of specific proteins within a tissue ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Optimized Protocol for the Extraction of Proteins from the Human Mitral Valve

Geoptimaliseerd Protocol voor de Extractie van Proteïnen uit de Human Mitral Valve

Analysis of the cellular proteome can help to elucidate the molecular mechanisms underlying diseases due to the development of technologies that permit ...

Optimal Preparation of Formalin Fixed Samples for Peptide Based Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry Imaging Workflows

Optimale voorbereiding van formaline vaste monsters voor Peptide Matrix gebaseerde bijgestaan Laser desorptie/ionisatie massaspectrometrie Imaging Workflows

The use of matrix-assisted laser desorption/ionization, mass spectrometry imaging (MALDI MSI) has rapidly expanded, since this technique analyzes a host ...

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Een eenvoudige methode voor High Throughput chemische Screening in Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

Hoge gevoeligheid meten van transcriptie Factor-DNA-bindende affiniteiten concurrerende getitreerd wordt met behulp van fluorescentie microscopie

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

An All-in-one Sample Holder for Macromolecular X-ray Crystallography with Minimal Background Scattering

Een alles-in-een monsterhouder voor macromoleculaire X-Ray kristallografie met minimale achtergrond verstrooiing

Macromolecular X-ray crystallography (MX) is the most prominent method to obtain high-resolution three-dimensional knowledge of biological macromolecules. ...

Mitochondria and Endoplasmic Reticulum Imaging by Correlative Light and Volume Electron Microscopy

Mitochondriën en Endoplasmisch reticulum beeldvorming door Correlatief licht en volume elektronenmicroscopie

Cellular organelles, such as mitochondria and endoplasmic reticulum (ER), create a network to perform a variety of functions. These highly curved ...

Interactions with and Membrane Permeabilization of Brain Mitochondria by Amyloid Fibrils

Interacties met en membraan Permeabilization van de mitochondriën van de hersenen door amyloid fibrils

A growing body of evidence indicates that membrane permeabilization, including internal membranes such as mitochondria, is a common feature and primary ...

Production of Dynein and Kinesin Motor Ensembles on DNA Origami Nanostructures for Single Molecule Observation

Productie van Dynein en Kinesin motor ensembles op DNA origami nanostructuren voor observatie van enkelvoudige moleculen

Cytoskeletal motors are responsible for a wide variety of functions in eukaryotic cells, including mitosis, cargo transport, cellular motility, and ...

Myosin-Specific Adaptations of In vitro Fluorescence Microscopy-Based Motility Assays

Myosine-specifieke aanpassingen van in vitro fluorescentiemicroscopie-gebaseerde motiliteitstesten

Myosin proteins bind and interact with filamentous actin (F-actin) and are found in organisms across the phylogenetic tree. Their structure and enzymatic ...

Continuous Fluorescence-Based Endonuclease-Coupled DNA Methylation Assay to Screen for DNA Methyltransferase Inhibitors

Continue fluorescentie-gebaseerde endonuclease-gekoppelde DNA-methylatietest om te screenen op DNA-methyltransferaseremmers

DNA methylation, a form of epigenetic gene regulation, is important for normal cellular function. In cells, proteins called DNA methyltransferases (DNMTs) ...