Name: simple elimination of background fluorescence in formalin-fixed human brain tissue for immunofluorescence microscopy
Uploaded: 2017-09-03T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Simple Elimination of Background Fluorescence in Formalin-Fixed Human Brain Tissue for Immunofluorescence Microscopy at JoVE.com

Denne studien ble støttet helt eller delvis av den kanadiske Consortium av Neurodegeneration og aldring (CCNA), Canadian Institute for Health Research (CIHR), den ALS Society of Canada (ALS Canada) og Alzheimers Society av Canada (ASC). Forfatterne gjerne takke Sultan Darvesh og Andrew Reid fra Maritime hjernen vev banken for å gi FTLD hjernen vev, Milan Ganguly fra programmet Spatio-Temporal målretting og forsterkning av stråling svar (STTARR) og dens tilknyttede finansiering etater for vev innebygging og snitting tjenester og den avanserte optiske mikroskopi anlegg (AOMF) for å gi mikroskopi instrumenter. Kevin Hadley er takket for kritisk gjennomgang av manuskriptet.

Merk: arbeidet presentert ble utført i samsvar med anerkjente internasjonale standarder, inkludert den internasjonale konferansen om harmonisering (ICH), Rådet for internasjonale organisasjoner av medisinsk vitenskap (CIOMS) , og prinsippene for deklarasjon i Helsinki. Bruk av menneskelig vev var med godkjenning av universitetet helse nettverk forskning etikk kortet. Menneskelige hjerne prøvene ble samlet som en del av Maritime hjernen vev Bank. På tiden av samlingen, samtykke ble innhentet fra alle pasienter.
<...

<ol>
	<li>Banerjee, B., Miedema, B. E., Chandrasekhar, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+basement+membrane+collagen+and+elastin+in+the+autofluorescence+spectra+of+the+colon.">Role of basement membrane collagen and elastin in the autofluorescence spectra of the colon.</a> J Investig Med. 47 (6), 326-332 (1999).</li><li>Terman, A., Brunk, U. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipofuscin+.">Lipofuscin .</a> Int J Biochem Cell Biol. 36 (8), 1400-1404 (2004).</li><li>Del Castillo, P., Llorente, A. R., Stockert, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+fixation,+exciting+light+and+section+thickness+on+the+primary+fluorescence+of+samples+for+microfluorometric+analysis.">Influence of fixation, exciting light and section thickness on the primary fluorescence of samples for microfluorometric analysis.</a> Basic Appl Histochem. 33 (3), 251-257 (1989).</li><li>Ottis, P., Koppe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+and+rat+brain+lipofuscin+proteome.">Human and rat brain lipofuscin proteome.</a> Proteomics. 12 (15-16), 2445-2454 (2012).</li><li>Sun, Y., Chakrabartty, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cost-effective+elimination+of+lipofuscin+fluorescence+from+formalin-fixed+brain+tissue+by+white+phosphor+light+emitting+diode+array.">Cost-effective elimination of lipofuscin fluorescence from formalin-fixed brain tissue by white phosphor light emitting diode array.</a> Biochem Cell Biol. 94 (6), 545-550 (2016).</li><li>Davis, A. S., Richter, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+and+Diminishing+Autofluorescence+in+Formalin-fixed+Paraffin-embedded+Human+Respiratory+Tissue.">Characterizing and Diminishing Autofluorescence in Formalin-fixed Paraffin-embedded Human Respiratory Tissue.</a> J Histochem Cytochem. 62 (6), 405-423 (2014).</li><li>Zimmermann, T., Rietdorf, J., Pepperkok, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectral+imaging+and+its+applications+in+live+cell+microscopy.">Spectral imaging and its applications in live cell microscopy.</a> FEBS Lett. 546 (1), 87-92 (2003).</li><li>Duong, H., Han, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multispectral+LED+array+for+the+reduction+of+background+autofluorescence+in+brain+tissue.">A multispectral LED array for the reduction of background autofluorescence in brain tissue.</a> J Neurosci Methods. 220 (1), 46-54 (2013).</li><li>Albeanu, D. F., Soucy, E., Sato, T. F., Meister, M., Murthy, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LED+arrays+as+cost+effective+and+efficient+light+sources+for+widefield+microscopy.">LED arrays as cost effective and efficient light sources for widefield microscopy.</a> PLoS One. 3 (5), 1-7 (2008).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Robertson, J. B., Zhang, Y., Johnson, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-emitting+diode+flashlights+as+effective+and+inexpensive+light+sources+for+fluorescence+microscopy.">Light-emitting diode flashlights as effective and inexpensive light sources for fluorescence microscopy.</a> J Microsc. 236 (1), 1-4 (2009).</li><li>Mackenzie, I. R. A., Neumann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+neuropathology+of+frontotemporal+dementia:+insights+into+disease+mechanisms+from+postmortem+studies.">Molecular neuropathology of frontotemporal dementia: insights into disease mechanisms from postmortem studies.</a> J Neurochem. 138 (S1), 54-70 (2016).</li><li>Kouri, N., Whitwell, J. L., Josephs, K. A., Rademakers, R., Dickson, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Corticobasal+degeneration:+a+pathologically+distinct+4R+tauopathy.">Corticobasal degeneration: a pathologically distinct 4R tauopathy.</a> Nat Rev Neurol. 7 (5), 263-272 (2011).</li></ol>

Photobleaching før behandling av vev beskrevet i dette manuskriptet gir effektiv eliminasjon av autofluorescence bruke sokkel komponenter. Protokollen beskriver immunofluorescence imaging av fosforylert tau aggregater i formalin-fast hjernevev med sekundær antistoffer konjugert til Alexa 488 og Texas rødt, med DAPI som en kjernefysisk counterstain. For å bruke metoden andre vev, anbefaler vi utfører en 48t photobleaching behandling til prøven som utgangspunkt. Når photobleaching, utføre den standard immunofluores...

Fluorescens mikroskopi bruker antistoffer rettet mot spesifikke proteiner brukes rutinemessig visualisere proteiner av interesse i cellekultur og vev. En stor komplikasjon til anskaffelsen av klare og definitive bilder i immunofluorescence er autofluorescence, som kan skyldes endogenously i pattedyr vev ved alder pigment lipofuscin og proteiner som elastin og kollagen1, 2. Andre kilder til autofluorescence kan bli introdusert gjennom eksempel klargjøringstrinn som aldehyd fiksering3. Lipofuscin korn, består hovedsakelig av oxidatively endret protein og lipid fornedrelse rester, akkumuleres i lang-levende celler med økt alder2. Dette skaper problemer i imaging postmitotic vev som hjernen og hjerte- eller skjelettlidelser muskler, som fluorescens utslipp spektrum av lipofuscin er bred og variabel, ofte sammenfallende med utslipp bølgelengden til felles fluorophores brukes for merking4. Disse faktorene gjør imaging hjernen vev fra tilfeller av sen-utbruddet nevrodegenerative sykdommer som frontotemporal lobar degenerasjon (FTLD) spesielt utfordrende.
For å redusere autofluorescence, har vi utviklet en teknikk der vi irradiate delene lysbilde montert vev med hvitt lys emitting diode (LED) matrise med en husholdning pulten lampen5. Denne enkle teknikken gir et alternativ til teknikker bruke kjemiske quenchers som CuSO4 ammonium acetate, eller kommersielt tilgjengelige slukke fargestoffer som Sudan svart B og Eriochrome svart T6. Det har også betydelig kostnadsbesparende over multispectral ledet lampe photobleaching teknikker og unngår komplikasjoner og gjenstander fra digitale autofluorescence fjerning metoder som spectral un blande7,8. Hvitt fosfor lysdioder har en bred utslipp spektrum, høy lysstyrke og lav produksjon kostnader, noe som gjør dem ideelle som en sokkel komponent for photobleaching en rekke chromophores5,9.
Denne protokollen, vi viser byggingen av en photobleaching apparater bruker tilgjengelige komponenter og bruke photobleaching på et tilfelle av FTLD vev som inneholder tau-positive Inneslutninger (FTLD-T) bruker et antistoff bestemt fosforylert tau. Vi viser effekten av photobleaching på imaging fluorescently-merket antistoffer ansette to vanlige chromophores: Alexa 488 og Texas rød. Effekten av photobleaching versus ubehandlet deler eller disse behandlet med en kommersiell kjemiske avsluttes er kvantifisert og sammenlignet. Denne photobleaching før behandling kan innlemmes i alle standard immunofluorescence fargeprotokoll fjerne autofluorescence i et biologiske utvalg.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="999">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:328px;">Trizma Base</td>
			<td style="width:167px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">T6066</td>
			<td style="width:400px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sodium Choloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Hydrochloric Acid</td>
			<td>Caledon Laboratory Chemicals</td>
			<td>1506656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sodium Azide</td>
			<td>BioShop Canada</td>
			<td>SAZ001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">100 mm x 100 mm x 20 mm Pitri dish</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>82.9923.422</td>
			<td>All components of photobleacher can be substituted based on availability</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">6 W LED Dimmable Desk Lamp</td>
			<td>DBPower</td>
			<td>DS501</td>
			<td>All components of photobleacher can be substituted based on availability</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Citric Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C-2404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ethylenediaminetetraacetic acid&#160;(EDTA)</td>
			<td>BioShop Canada</td>
			<td>EDT001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P-7949</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sodium Hydroxide</td>
			<td>BioShop Canada</td>
			<td>SHY700.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Water bath</td>
			<td>Haake Fisons</td>
			<td>K15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Slide collector</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>12-587-17B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Staining Jar</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>E94</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Orbital Shaker</td>
			<td>Bellco Glass</td>
			<td>&#160;7744-08115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T7878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Bovine Serum Albumin</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>BP1600-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Normal Goat Serum</td>
			<td>Aurion</td>
			<td>905.002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Hydrophobic pen</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z672548-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Phospho-Tau (Ser202, Thr205) Monoclonal Antibody (AT8)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>MN1020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Goat anti-Mouse Secondary Antibody, Texas Red-X</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>T862</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Goat anti-Mouse Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A-11029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Mounting medium</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>28-600-42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Glass soverslip</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Confocal Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Imaging software ZEN 2012 Black Edition 11.0</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM710</td>
			<td>Software accompanies the Confocal Microscope</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ImageJ</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td>https://imagej.nih.gov/ij/download.html</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RGB Profile Tools macro</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td>https://imagej.nih.gov/ij/macros/tools/RGBProfilesTool.txt</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Commercial chemical quencher</td>
			<td>Biotum</td>
			<td>23007</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simple elimination of background fluorescence in formalin-fixed human brain tissue for immunofluorescence microscopy

Immunofluorescence er en felles metode som brukes til å visualisere subcellular rom og bestemme lokaliseringen av spesifikke proteiner i en Vevsprøve. En stor hindring oppkjøpet av høykvalitets immunofluorescence bilder er endogene autofluorescence av vev forårsaket av aldring pigmenter som lipofuscin eller vanlig eksempel forberedelse prosesser som aldehyd fiksering. Denne protokollen beskriver hvordan bakgrunnen fluorescens kan reduseres betraktelig gjennom photobleaching bruker hvit fosfor lys emitting diode (LED) matriser før behandling med fluorescerende sonder. Bredt spekter utslipp av hvitt fosfor lysdioder tillate bleking av fluorophores gjennom en rekke utslipp topper. Photobleaching apparatet kan konstrueres fra sokkel komponenter til meget lav pris og tilbyr et tilgjengelig alternativ til kommersielt tilgjengelige kjemiske quenchers. En photobleaching behandling av vev etterfulgt av konvensjonelle immunofluorescence flekker genererer bilder uten bakgrunn autofluorescence. Forhold etablert kjemiske quenchers som redusert sonde som bakgrunn signaler, photobleaching behandling hadde ingen effekt på sonde fluorescens intensitet mens det effektivt redusert bakgrunn og lipofuscin fluorescens. Selv om photobleaching krever mer tid for forbehandling, kan høyere intensitet LED matriser brukes til å redusere photobleaching. Denne enkle metoden kan potensielt brukes til en rekke vev, spesielt postmitotic vev som samler lipofuscin som hjernen og hjerte- eller skjelettlidelser muskler.

Photobleaching forbehandling trinnet kan legges til en standard immunofluorescence protokoll umiddelbart før antigen henting og immunostai-(figur 1A). Montering av photobleaching apparater kan også utføres ved hjelp av ulike, billig, sokkel komponenter (figur 1B). Utslipp spekteret av hvitt fosfor lysdioder dekker et bredt spekter av bølgelengder som gjør dem egnet for bredt photobleaching, enige med tidligere rapporter (<st...

Watch this Scientific Journal Video about Simple Elimination of Background Fluorescence in Formalin-Fixed Human Brain Tissue for Immunofluorescence Microscopy at JoVE.com

Simple Elimination of Background Fluorescence in Formalin-Fixed Human Brain Tissue for Immunofluorescence Microscopy

Enkel fjerning av bakgrunn fluorescens i Formalin-fast hjernevev for Immunofluorescence mikroskopi

Bakgrunn autofluorescence av biologiske prøver kompliserer ofte fluorescens-baserte Bildeteknikker, særlig i alderen menneskelig postmitotic vev. Denne protokollen beskriver hvordan autofluorescence fra disse prøvene effektivt kan fjernes ved hjelp av en kommersielt tilgjengelig lys emitting diode lys kilde photobleach prøven før immunostaining.

Immunofluorescence is a common method used to visualize subcellular compartments and to determine the localization of specific proteins within a tissue ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Optimized Protocol for the Extraction of Proteins from the Human Mitral Valve

Optimalisert protokoll for ekstraksjon av proteiner fra Human Mitral Valve

Analysis of the cellular proteome can help to elucidate the molecular mechanisms underlying diseases due to the development of technologies that permit ...

Optimal Preparation of Formalin Fixed Samples for Peptide Based Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry Imaging Workflows

Optimal utarbeidelse av Formalin fast prøver for peptid basert Matrix assistert Laser desorpsjon/ionisering massespektrometri Imaging arbeidsflyter

The use of matrix-assisted laser desorption/ionization, mass spectrometry imaging (MALDI MSI) has rapidly expanded, since this technique analyzes a host ...

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

En enkel metode for høy gjennomstrømning kjemiske Screening i Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

Høy følsomhet måling av transkripsjon faktor-DNA Binding slektskap av konkurransedyktige titrering bruker fluorescens mikroskopi

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

An All-in-one Sample Holder for Macromolecular X-ray Crystallography with Minimal Background Scattering

En alt-i-ett sample holder for makro molekylære X-ray Crystallography med minimal bakgrunn spredning

Macromolecular X-ray crystallography (MX) is the most prominent method to obtain high-resolution three-dimensional knowledge of biological macromolecules. ...

Mitochondria and Endoplasmic Reticulum Imaging by Correlative Light and Volume Electron Microscopy

Mitokondrier og endoplasmatiske retikulum Imaging av correlative Light og Volume Electron mikroskopi

Cellular organelles, such as mitochondria and endoplasmic reticulum (ER), create a network to perform a variety of functions. These highly curved ...

Interactions with and Membrane Permeabilization of Brain Mitochondria by Amyloid Fibrils

Interaksjoner med og membran Permeabilization av Brain mitokondrier av amyloid fibrils

A growing body of evidence indicates that membrane permeabilization, including internal membranes such as mitochondria, is a common feature and primary ...

Production of Dynein and Kinesin Motor Ensembles on DNA Origami Nanostructures for Single Molecule Observation

Produksjon av Dynein og Kinesin motor ensembler på DNA Origami nanostrukturer for single molekyl observasjon

Cytoskeletal motors are responsible for a wide variety of functions in eukaryotic cells, including mitosis, cargo transport, cellular motility, and ...

Myosin-Specific Adaptations of In vitro Fluorescence Microscopy-Based Motility Assays

Myosinspesifikke tilpasninger av in vitro fluorescensmikroskopibaserte motilitetsanalyser

Myosin proteins bind and interact with filamentous actin (F-actin) and are found in organisms across the phylogenetic tree. Their structure and enzymatic ...

Continuous Fluorescence-Based Endonuclease-Coupled DNA Methylation Assay to Screen for DNA Methyltransferase Inhibitors

Kontinuerlig fluorescensbasert endonukleasekoblet DNA-metyleringsanalyse for å screene for DNA-metyltransferasehemmere

DNA methylation, a form of epigenetic gene regulation, is important for normal cellular function. In cells, proteins called DNA methyltransferases (DNMTs) ...