Name: simple elimination of background fluorescence in formalin-fixed human brain tissue for immunofluorescence microscopy
Uploaded: 2017-09-03T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Simple Elimination of Background Fluorescence in Formalin-Fixed Human Brain Tissue for Immunofluorescence Microscopy at JoVE.com

Denna studie stöds helt eller delvis av den kanadensiska konsortium för Neurodegeneration och åldrande (CCNA), det kanadensiska Institutet för hälsa forskning (CIHR), ALS samhället av Kanada (ALS Kanada) och Alzheimers samhället av Kanada (ASC). Författarna vill tacka Sultan Darvesh och Andrew Reid från Maritime Brain vävnad Bank för att ge FTLD hjärnan vävnaderna, Milano Ganguly från plats och tid inriktning och förstärkning av strålning svar (STTARR) program och dess anslutna finansiärer för vävnad inbäddning och snittning tjänster och den avancerad optisk mikroskopi Facility (AOMF) för att tillhandahålla mikroskopi instrument. Kevin Hadley är tackade för kritisk granskning av manuskriptet.

Obs: arbetet presenteras utförs i enlighet med erkända internationella normer, inklusive den internationella konferensen om harmonisering (ICH), rådet för internationella organisationer av Medical Sciences (CIOMS) , och principerna i Helsingforsdeklarationen. Användning av mänsklig vävnad var med godkännande av universitetsstyrelsen hälsa nätverk forskning etik. De mänskliga hjärnan proverna samlades in som en del av maritima Brain vävnad Bank. Vid tidpunkten för insamling, informerat samtycke erhållits f...

<ol>
	<li>Banerjee, B., Miedema, B. E., Chandrasekhar, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+basement+membrane+collagen+and+elastin+in+the+autofluorescence+spectra+of+the+colon.">Role of basement membrane collagen and elastin in the autofluorescence spectra of the colon.</a> J Investig Med. 47 (6), 326-332 (1999).</li><li>Terman, A., Brunk, U. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipofuscin+.">Lipofuscin .</a> Int J Biochem Cell Biol. 36 (8), 1400-1404 (2004).</li><li>Del Castillo, P., Llorente, A. R., Stockert, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+fixation,+exciting+light+and+section+thickness+on+the+primary+fluorescence+of+samples+for+microfluorometric+analysis.">Influence of fixation, exciting light and section thickness on the primary fluorescence of samples for microfluorometric analysis.</a> Basic Appl Histochem. 33 (3), 251-257 (1989).</li><li>Ottis, P., Koppe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+and+rat+brain+lipofuscin+proteome.">Human and rat brain lipofuscin proteome.</a> Proteomics. 12 (15-16), 2445-2454 (2012).</li><li>Sun, Y., Chakrabartty, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cost-effective+elimination+of+lipofuscin+fluorescence+from+formalin-fixed+brain+tissue+by+white+phosphor+light+emitting+diode+array.">Cost-effective elimination of lipofuscin fluorescence from formalin-fixed brain tissue by white phosphor light emitting diode array.</a> Biochem Cell Biol. 94 (6), 545-550 (2016).</li><li>Davis, A. S., Richter, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+and+Diminishing+Autofluorescence+in+Formalin-fixed+Paraffin-embedded+Human+Respiratory+Tissue.">Characterizing and Diminishing Autofluorescence in Formalin-fixed Paraffin-embedded Human Respiratory Tissue.</a> J Histochem Cytochem. 62 (6), 405-423 (2014).</li><li>Zimmermann, T., Rietdorf, J., Pepperkok, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectral+imaging+and+its+applications+in+live+cell+microscopy.">Spectral imaging and its applications in live cell microscopy.</a> FEBS Lett. 546 (1), 87-92 (2003).</li><li>Duong, H., Han, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multispectral+LED+array+for+the+reduction+of+background+autofluorescence+in+brain+tissue.">A multispectral LED array for the reduction of background autofluorescence in brain tissue.</a> J Neurosci Methods. 220 (1), 46-54 (2013).</li><li>Albeanu, D. F., Soucy, E., Sato, T. F., Meister, M., Murthy, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LED+arrays+as+cost+effective+and+efficient+light+sources+for+widefield+microscopy.">LED arrays as cost effective and efficient light sources for widefield microscopy.</a> PLoS One. 3 (5), 1-7 (2008).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Robertson, J. B., Zhang, Y., Johnson, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-emitting+diode+flashlights+as+effective+and+inexpensive+light+sources+for+fluorescence+microscopy.">Light-emitting diode flashlights as effective and inexpensive light sources for fluorescence microscopy.</a> J Microsc. 236 (1), 1-4 (2009).</li><li>Mackenzie, I. R. A., Neumann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+neuropathology+of+frontotemporal+dementia:+insights+into+disease+mechanisms+from+postmortem+studies.">Molecular neuropathology of frontotemporal dementia: insights into disease mechanisms from postmortem studies.</a> J Neurochem. 138 (S1), 54-70 (2016).</li><li>Kouri, N., Whitwell, J. L., Josephs, K. A., Rademakers, R., Dickson, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Corticobasal+degeneration:+a+pathologically+distinct+4R+tauopathy.">Corticobasal degeneration: a pathologically distinct 4R tauopathy.</a> Nat Rev Neurol. 7 (5), 263-272 (2011).</li></ol>

Fotoblekning förbehandling av vävnader som beskrivs i detta manuskript möjliggör effektiv eliminering av autofluorescens med off-the-shelf komponenter. Protokollet beskrivs immunofluorescens avbildning av fosforylerade tau aggregat i formalin-fast mänsklig hjärnvävnad som använder sekundära antikroppar konjugerat till Alexa 488 och Texas röd, med DAPI som en nukleär motfärg. För att tillämpa metoden på andra vävnader, rekommenderar vi att utföra en 48 h fotoblekning förbehandling i urvalet som utgångsp...

Fluorescensmikroskopi använder antikroppar riktade specifika proteiner används rutinmässigt att visualisera proteiner av intresse i cellkultur och vävnader. En betydande komplikation till förvärvet av tydliga och slutgiltiga bilder i immunofluorescens är autofluorescens, vilket kan orsakas endogent i däggdjursvävnader genom den ålder pigment lipofuscin och proteiner såsom elastin och kollagen1, 2. Andra källor till autofluorescens kan införas genom provberedningssteg som aldehyd fixering3. Lipofuscin granulat, består främst av oxidativt modifierat protein och lipid nedbrytning rester, ackumuleras i lång-levande celler med ökad ålder2. Detta orsakar svårigheter i imaging postmitotic vävnader såsom hjärnan och hjärt- eller skelett muskler, som fluorescens emissionsspektrum av lipofuscin är breda och varierande, ofta sammanfaller med utsläpp våglängden av gemensamma fluorophores används för märkning4. Dessa faktorer gör avbildning av mänsklig hjärnvävnad från fall av sen debut neurodegenerativa sjukdomar som frontotemporal lobar degeneration (FTLD) särskilt utmanande.
För att minska autofluorescens, har vi utarbetat en teknik där vi bestråla avsnitten bild monterade vävnad med en vit ljusavgivande diod (LED)-matris med en hushållens skrivbord lampa5. Denna enkla teknik ger ett alternativ till tekniker som använder kemiska quenchers såsom CuSO4 i ammoniumacetat, eller kommersiellt tillgängliga snabbkylning färgämnen som Sudan svart B och eriokromsvart T6. Det har också betydande kostnadsbesparingar över Multispektrala LED lampa fotoblekning tekniker och undviker komplikationer och artefakter som genereras från digital autofluorescens borttagning metoder såsom spektrala un-blandning7,8. Vit fosfor lysdioder har en bred emissionsspektrum, hög ljusstyrka och låga tillverkningskostnaden, vilket gör dem idealiska som en off-the-shelf komponent för fotoblekning en mängd chromophores5,9.
I detta protokoll, vi visar byggandet av en fotoblekning apparatur med hjälpmedelskomponenter och gälla ett fall av FTLD vävnad innehållande tau-positiv inneslutningar (FTLD-T) med hjälp av en antikropp specifik för fosforyleras tau fotoblekning. Vi visar effekten av fotoblekning på imaging fluorescently-märkt antikroppar sysselsätter två vanliga chromophores: Alexa 488 och Texas Red. Effekten av fotoblekning jämfört med obehandlade sektioner eller dem som behandlades med en kommersiella kemiska törstsläckare är kvantifierade och jämfört. Detta fotoblekning förbehandling kan införlivas i alla standard immunofluorescens färgning protokoll bort autofluorescens i ett biologiskt prov.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="999">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:328px;">Trizma Base</td>
			<td style="width:167px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">T6066</td>
			<td style="width:400px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sodium Choloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Hydrochloric Acid</td>
			<td>Caledon Laboratory Chemicals</td>
			<td>1506656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sodium Azide</td>
			<td>BioShop Canada</td>
			<td>SAZ001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">100 mm x 100 mm x 20 mm Pitri dish</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>82.9923.422</td>
			<td>All components of photobleacher can be substituted based on availability</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">6 W LED Dimmable Desk Lamp</td>
			<td>DBPower</td>
			<td>DS501</td>
			<td>All components of photobleacher can be substituted based on availability</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Citric Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C-2404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ethylenediaminetetraacetic acid&#160;(EDTA)</td>
			<td>BioShop Canada</td>
			<td>EDT001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P-7949</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sodium Hydroxide</td>
			<td>BioShop Canada</td>
			<td>SHY700.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Water bath</td>
			<td>Haake Fisons</td>
			<td>K15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Slide collector</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>12-587-17B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Staining Jar</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>E94</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Orbital Shaker</td>
			<td>Bellco Glass</td>
			<td>&#160;7744-08115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T7878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Bovine Serum Albumin</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>BP1600-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Normal Goat Serum</td>
			<td>Aurion</td>
			<td>905.002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Hydrophobic pen</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z672548-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Phospho-Tau (Ser202, Thr205) Monoclonal Antibody (AT8)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>MN1020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Goat anti-Mouse Secondary Antibody, Texas Red-X</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>T862</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Goat anti-Mouse Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A-11029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Mounting medium</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>28-600-42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Glass soverslip</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Confocal Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Imaging software ZEN 2012 Black Edition 11.0</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM710</td>
			<td>Software accompanies the Confocal Microscope</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ImageJ</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td>https://imagej.nih.gov/ij/download.html</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RGB Profile Tools macro</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td>https://imagej.nih.gov/ij/macros/tools/RGBProfilesTool.txt</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Commercial chemical quencher</td>
			<td>Biotum</td>
			<td>23007</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simple elimination of background fluorescence in formalin-fixed human brain tissue for immunofluorescence microscopy

Immunofluorescens är en vanlig metod som används för att visualisera subcellulär fack och att bestämma localizationen av specifika proteiner inom ett vävnadsprov. Ett stort hinder för förvärv av högkvalitativa immunofluorescens bilder är endogena autofluorescens den vävnad som orsakas av åldrande pigment såsom lipofuscin eller gemensamma prov förberedelse processer såsom aldehyd fixering. Det här protokollet beskriver hur bakgrunden fluorescens kan minskas kraftigt genom fotoblekning med vit fosfor ljusavgivande diod (LED) matriser före behandling med fluorescerande sonder. Solskyddskrämen utsläpp av vit fosfor lysdioder tillåter blekning av fluorophores inom en rad olika utsläpp toppar. Fotoblekning apparaten kan konstrueras från off-the-shelf komponenter till mycket låg kostnad och erbjuder ett tillgängligt alternativ till kommersiellt tillgängliga kemiska quenchers. En fotoblekning förbehandling av vävnaden följt av konventionella immunofluorescens färgning genererar bilder gratis bakgrund autofluorescens. Jämfört till etablerade kemiska quenchers vilket minskade sond samt bakgrund signaler, fotoblekning behandling hade ingen effekt på sonden fluorescensintensiteten medan det effektivt minska bakgrund och lipofuscin fluorescens. Fotoblekning kräver mer tid för förbehandling, kan högre intensitet LED matriser användas för att minska fotoblekning tid. Den här enkla metoden kan potentiellt användas till en mängd olika vävnader, särskilt postmitotic vävnader som ansamlas lipofuscin såsom hjärnan och hjärt- eller skelett muskler.

Steget fotoblekning förbehandling kan läggas till ett standard immunofluorescens protokoll omedelbart före antigen retrieval och immunfärgning (figur 1A). Montering av fotoblekning apparaten kan också utföras med olika, billig, off-the-shelf komponenter (figur 1B). Emissionsspektrum av vit fosfor lysdioder omfattar ett brett spektrum av våglängder vilket gör dem lämpliga för bred-range fotoblekning, instämmer med för...

Watch this Scientific Journal Video about Simple Elimination of Background Fluorescence in Formalin-Fixed Human Brain Tissue for Immunofluorescence Microscopy at JoVE.com

Simple Elimination of Background Fluorescence in Formalin-Fixed Human Brain Tissue for Immunofluorescence Microscopy

Enkel eliminering av bakgrunden fluorescens i Formalin-fast mänsklig hjärnvävnad för immunofluorescens mikroskopi

Bakgrunden autofluorescens biologiska prover komplicerar ofta fluorescens-baserade avbildningstekniker, särskilt i åldern postmitotic vävnader. Det här protokollet beskriver hur autofluorescens från dessa prover kan avlägsnas effektivt med hjälp av en kommersiellt tillgänglig ljusavgivande diod ljus källa till photobleach provet före immunfärgning.

Immunofluorescence is a common method used to visualize subcellular compartments and to determine the localization of specific proteins within a tissue ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Optimized Protocol for the Extraction of Proteins from the Human Mitral Valve

Optimerat protokoll för extraktion av proteiner från humanmitralventilen

Analysis of the cellular proteome can help to elucidate the molecular mechanisms underlying diseases due to the development of technologies that permit ...

Optimal Preparation of Formalin Fixed Samples for Peptide Based Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry Imaging Workflows

Optimal förberedelse av formalinbeständiga prover för peptid baserat Matrix assisterad Laser Desorption/jonisering masspektrometri Imaging arbetsflöden

The use of matrix-assisted laser desorption/ionization, mass spectrometry imaging (MALDI MSI) has rapidly expanded, since this technique analyzes a host ...

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

En enkel metod för hög genomströmning kemisk Screening i Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

Hög känslighet mätning av transkription faktorn-DNA bindande samhörighet genom konkurrenskraftiga titrering med fluorescensmikroskopi

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

An All-in-one Sample Holder for Macromolecular X-ray Crystallography with Minimal Background Scattering

En allt-i-ett-provhållare för makro molekyl ära röntgenkristallografi med minimal bakgrunds spridning

Macromolecular X-ray crystallography (MX) is the most prominent method to obtain high-resolution three-dimensional knowledge of biological macromolecules. ...

Mitochondria and Endoplasmic Reticulum Imaging by Correlative Light and Volume Electron Microscopy

Mitokona-och endoplasmatiska Retikulum avbildning av korrelat ljus och Volymelektronmikroskopi

Cellular organelles, such as mitochondria and endoplasmic reticulum (ER), create a network to perform a variety of functions. These highly curved ...

Interactions with and Membrane Permeabilization of Brain Mitochondria by Amyloid Fibrils

Interaktioner med och membran permeabilisering av hjärnans Mitokona av amyloid fibriller

A growing body of evidence indicates that membrane permeabilization, including internal membranes such as mitochondria, is a common feature and primary ...

Production of Dynein and Kinesin Motor Ensembles on DNA Origami Nanostructures for Single Molecule Observation

Produktion av dynein och Kinesin motor ensembler på DNA origami nanostrukturer för enkel molekyl observation

Cytoskeletal motors are responsible for a wide variety of functions in eukaryotic cells, including mitosis, cargo transport, cellular motility, and ...

Myosin-Specific Adaptations of In vitro Fluorescence Microscopy-Based Motility Assays

Myosinspecifika anpassningar av in vitro-fluorescensmikroskopibaserade motilitetsanalyser

Myosin proteins bind and interact with filamentous actin (F-actin) and are found in organisms across the phylogenetic tree. Their structure and enzymatic ...

Continuous Fluorescence-Based Endonuclease-Coupled DNA Methylation Assay to Screen for DNA Methyltransferase Inhibitors

Kontinuerlig fluorescensbaserad endonukleaskopplad DNA-metyleringsanalys för att screena för DNA-metyltransferashämmare

DNA methylation, a form of epigenetic gene regulation, is important for normal cellular function. In cells, proteins called DNA methyltransferases (DNMTs) ...