Name: a flow cytometry-based cytotoxicity assay for the assessment of human nk cell activity
Uploaded: 2017-08-09T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Flow Cytometry-Based Cytotoxicity Assay for the Assessment of Human NK Cell Activity at JoVE.com

हम उसकी सहायता पांडुलिपि की तैयारी के लिए जिल Narciso, UCLA Immunogenetics केंद्र, शुक्रिया अदा करना चाहूँगा।

Samples were collected according to the ethical guidelines established by the UCLA Human Research Protection Program and IRB approved.
1. Preparation of reagents
NOTE: Unless otherwise stated, all reagents should be allowed to equilibrate at room temperature prior to use. All reagents must remain sterile.
<ol>
	<li>Prepare a 2x working solution of Tween-20 (i.e., 0.2%) by adding 10&#160;&#181;L of Tween-20 solution to 5 mL of phosphate-buffered saline (PBS) withou...

<ol>
	<li>Iannello, A., Debbeche, O., Samarani, S., Ahmad, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antiviral+NK+cell+responses+in+HIV+infection:+I.+NK+cell+receptor+genes+as+determinants+of+HIV+resistance+and+progression+to+AIDS.">Antiviral NK cell responses in HIV infection: I. NK cell receptor genes as determinants of HIV resistance and progression to AIDS.</a> J Leukoc Biol. 84 (1), 1-26 (2008).</li><li>Caligiuri, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+natural+killer+cells.">Human natural killer cells.</a> Blood. 112 (3), 461-469 (2008).</li><li>Topham, N. J., Hewitt, E. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+enzyme-release+assay+for+natural+cytotoxicity.">An enzyme-release assay for natural cytotoxicity.</a> J Immunol Methods. 64 (3), 313-320 (1983).</li><li>Karimi, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+cytotoxicity+by+bioluminescence+imaging+outperforms+the+standard+chromium-51+release+assay.">Measuring cytotoxicity by bioluminescence imaging outperforms the standard chromium-51 release assay.</a> PLoS One. 9 (2), e89357 (2014).</li><li>Oppenheim, D. 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M., Willemze, R., Falkenburg, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+CFSE-based+assay+to+determine+susceptibility+to+lysis+by+cytotoxic+T+cells+of+leukemic+precursor+cells+within+a+heterogeneous+target+cell+population.">New CFSE-based assay to determine susceptibility to lysis by cytotoxic T cells of leukemic precursor cells within a heterogeneous target cell population.</a> Blood. 103 (7), 2677-2682 (2004).</li><li>Lecoeur, H., Fevrier, M., Garcia, S., Riviere, Y., Gougeon, M. 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H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Application+of+Natural+Killer+Cell+Immunotherapy+for+the+Treatment+of+Cancer.">The Application of Natural Killer Cell Immunotherapy for the Treatment of Cancer.</a> Front Immunol. 6, 578 (2015).</li><li>Angelo, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Practical+NK+cell+phenotyping+and+variability+in+healthy+adults.">Practical NK cell phenotyping and variability in healthy adults.</a> Immunol Res. 62 (3), 341-356 (2015).</li><li>Zons, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+europium+and+chromium+release+assays:+cytotoxicity+in+healthy+individuals+and+patients+with+cervical+carcinoma.">Comparison of europium and chromium release assays: cytotoxicity in healthy individuals and patients with cervical carcinoma.</a> Clin Diagn Lab Immunol. 4 (2), 202-207 (1997).</li><li>Yovel, G., Shakhar, K., Ben-Eliyahu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+sex,+menstrual+cycle,+and+oral+contraceptives+on+the+number+and+activity+of+natural+killer+cells.">The effects of sex, menstrual cycle, and oral contraceptives on the number and activity of natural killer cells.</a> Gynecol Oncol. 81 (2), 254-262 (2001).</li><li>Laue, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+NK+cell+function+in+obese+healthy+humans.">Altered NK cell function in obese healthy humans.</a> BMC Obes. 2, 1 (2015).</li><li>Hazeldine, J., Lord, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+ageing+on+natural+killer+cell+function+and+potential+consequences+for+health+in+older+adults.">The impact of ageing on natural killer cell function and potential consequences for health in older adults.</a> Ageing Res Rev. 12 (4), 1069-1078 (2013).</li></ol>

यहाँ वर्णित विधि एन सेल साइटोटोक्सिक गतिविधि का आकलन करने के लिए पारंपरिक 51करोड़ रिलीज परख के लिए एक सीधा और लागत प्रभावी विकल्प प्रदान करता है। इस विधि संवेदनशील, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य ह?...

प्राकृतिक हत्यारा (एन) कोशिकाओं मानव सहज लिम्फोसाइटों गंभीर virally संक्रमित कोशिकाओं, रूपांतरित कोशिकाओं, और अन्य रोगजनक खतरों 1,2के उन्मूलन में शामिल का एक परिष्कृत सबसेट हैं। एन सेल lytic granules साइटोटोक्सिक प्रोटीन, perforin और granzymes जैसे घर। सक्रियण पर, एन. के. कोशिकाओं प्रत्यक्ष लक्ष्य सेल lysis और apoptosis, cytokine और chemokine रिलीज के साथ में जिसके परिणामस्वरूप प्रतिरक्षाविज्ञानी synapse, जिसके तहत इन cytolytic अणुओं स्थानीय रूप से रिलीज़ किए गए हैं, के रूप में जाना जाता है अपने लक्ष्य के साथ एक जटिल सहभागिता फार्म और अंततः एक सूजन की प्रेरण में 1,3,4राज्य।
एन सेल सक्रियण को सक्रिय करने की एक जटिल स्ट्रिंग शामिल है और एन. के. बीच निरोधात्मक बातचीत कक्ष रिसेप्टर्स और ligands लक्ष्य कोशिकाओं, एक कसकर नियंत्रित प्रणाली बनाने की सतह पर व्यक्त की। एन सेल सक्रियण के सबसे अधिक अध्ययन तंत्र में से एक 'अनुपलब्ध स्व' है। वास्तव में, मैं histocompatibility जटिल (MHC), या मानव श्वेताणु प्रतिजन (एचएलए) अणुओं, पर प्रमुख वर्ग का पता लगाने की कमी संक्रमित या कोशिकाओं ट्रिगर्स एन सेल cytotoxicity में तब्दील हो। ट्यूमर और वायरस-संक्रमित कोशिकाओं आम तौर पर downregulate टी सेल-मध्यस्थता प्रतिरक्षा, इस प्रकार प्राथमिक NK बनने से बचने के लिए इन एंटीजन सेल लक्ष्य 1,3,4।
एन. के. cell फ़ंक्शन का मूल्यांकन degranulation या cytotoxicity में मुख्य रूप से वर्गीकृत है assays. हालांकि, degranulation assays, प्रवाह cytometric degranulation जुड़े मार्कर CD107a, का पता लगाने जैसे केवल सांकेतिक एन सेल सक्रियण और उनके परम काम, लक्ष्य कक्षों के 5,6,7,8सीधा हत्या का नहीं है। इसलिए, इस सीमा के जांचकर्ताओं cytotoxicity assays करने के लिए एक अधिक कह और अधिक प्रत्यक्ष विकल्प के रूप में आकर्षित किया है।
लंबे समय तक "गोल्ड सेल-मध्यस्थता साइटोटोक्सिक गतिविधि दोनों टी और एन. के. कोशिकाओं का आकलन करने के लिए मानक" क्रोमियम रिलीज परख (सीआरए) है। सीआरए radioactively 51Cr के साथ लक्ष्य कक्षों की लेबलिंग और उन्हें effector कोशिकाओं के साथ सह incubating शामिल है। इस परख प्रोटीन-बाउंड का 51करोड़ तैरनेवाला, जो गामा की गिनती द्वारा मापा जा सकता है में रिलीज में परिणाम है कि सेल lysis सिद्धांत में डूबी है। इस परख, प्रभावी है, जबकि विभिन्न कारणों के लिए समस्याग्रस्त है: उच्च सामग्री लागत, हैंडलिंग और रेडियोधर्मी 51करोड़ का निपटान, 51करोड़ की सहज रिहाई और मुश्किल मानकीकरण - यह पूरी तरह अव्यावहारिक 9,10बनाने।
गैर-रेडियोधर्मी assays, फ्लोरोसेंट लेबलिंग, एंजाइम रिलीज, और यहां तक कि bioluminescence, शामिल की एक संख्या के बाद से सीआरए 11,12,13,14करने के लिए विकल्प के रूप में विकसित किया गया है। हम यहाँ सरल, संवेदनशील और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है कि एन सेल साइटोटोक्सिक गतिविधि पर K562 लक्ष्य कक्षों की माप के लिए एक प्रवाह cytometry-आधारित विधि का वर्णन। एक मानव erythroleukemic सेल लाइन एचएलए वर्ग की कम अभिव्यक्ति के साथ मैं और जो उन्हें एन सेल-मध्यस्थता cytotoxicity 15करने के लिए विशेष रूप से अतिसंवेदनशील बनाता है बढ़ अभिव्यक्ति activatory NK रिसेप्टर्स, के लिए ligands की K562 कोशिकाओं रहे हैं। इस परख में K562 कोशिकाओं carboxyfluorescein diacetate succinimidyl एस्टर (CFSE) के साथ पूर्व लेबल किए गए हैं और या तो परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं (PBMCs) के साथ विभिन्न अनुपात में सह-सुसंस्कृत या एन. के. कोशिकाओं 1शुद्ध। CFSE भेदभाव effector एन. के. कोशिकाओं 16,17से लक्ष्य कक्षों की अनुमति देता है एक स्थिर, प्रोटीन-बाइंडिंग फ्लोरोसेंट रंजक है। सह ऊष्मायन के बाद, विशेष रूप से मृत कोशिकाओं की झिल्ली permeating, एक न्यूक्लिक अम्ल दाग (सामग्री की तालिका देखें) मारे गए लक्ष्य कोशिकाओं की पहचान करने के लिए उपयोग किया जाता है। नमूने तो मृत (यानी, दाग +) का प्रतिशत निर्धारित करने के लिए एक प्रवाह cytometer पर प्राप्त कर रहे हैं CFSE + लक्ष्य कोशिकाओं।
इस परख monogenic दोष लगभग 30 ज्ञात दोष एन सेल की कमी या तो कार्यात्मक या क्लासिक के कारण हैं, जो की एन सेल डिब्बे, को प्रभावित करने के लिए और प्राथमिक या द्वितीयक hemophagocytic lymphohistiocytosis के लिए एक नियमित नैदानिक जांच के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता। यह भी बारम्बार, गंभीर दाद वायरल संक्रमण प्रतिरक्षा पुनर्गठन hematopoietic कोशिका प्रत्यारोपण या पोस्ट प्रतिरक्षण निश्चायक थेरेपी 18,19,20, के बाद का मूल्यांकन करने के लिए, के साथ और बुनियादी अनुसंधान अनुप्रयोगों के एक मेजबान के लिए रोगियों में एन सेल गतिविधि की जांच करने के लिए उपयोगी है।

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered Saline (1x, w/o Ca2+ and Mg2+)</td>
			<td>Corning (Cellgro)</td>
			<td>21-040-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll-Paque PLUS</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-1440-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>BP337-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Media</td>
			<td>Corning (Cellgro)</td>
			<td>10-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat-inactivated Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Omega Scientific</td>
			<td>FB-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140-163</td>
			<td>Stock solution at 10,000 U/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-2</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>202-IL-050</td>
			<td>Lyophilized from a 0.2 &#956;m filtered solution in Acetonitrile and TFA with BSA as a carrier protein. Reconstitute with 500 ul at 100 &#956;g/mL in sterile 100 mM Acetic Acid containing at least 0.1% bovine serum albumin (2.1x10E6 IU/ml)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K562 Cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-243</td>
			<td>Cancer cell line&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-75 cell culture flasks</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431464</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFSE cell proliferation kit</td>
			<td>Life Technologies (CellTrace)</td>
			<td>C34554</td>
			<td>Reconstitute I vial with 18 ul DMSO to prepare a 5mM stock solution. Do not freeze/thaw.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sytox Red</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>S34859</td>
			<td>Stock solution is provided at 5 &#956;M in 1 mL DMSO. The DMSO solution may be subjected to multiple freeze-thaw cycles without reagent degradation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium/lithium heparin blood collection tubes</td>
			<td>BD</td>
			<td>02-687-95</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-bottom 96-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS3897</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipettes</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene round-bottom tubes (5mL)</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>14959-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL polypropylene conical tube</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL polypropylene conical tube</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent reservoir</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>2321-2230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human NK cell enrichment cocktail</td>
			<td>StemCell Technologies (RosetteSep)</td>
			<td>15065</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a flow cytometry-based cytotoxicity assay for the assessment of human nk cell activity

सहज प्रतिरक्षा प्रणाली के भीतर, effector लिम्फोसाइटों प्राकृतिक हत्यारा (एन. के.) कक्षों के रूप में जाना जाता है एक आवश्यक भूमिका न्यायपालिका कोशिकाओं के खिलाफ विशेष रूप से टुमोरल को नष्ट करने और virally संक्रमित कोशिकाओं, में होस्ट रक्षा खेल। लगभग 30 ज्ञात monogenic दोष, अन्य रोग स्थितियों की एक मेजबान के साथ पैदा में प्रकट या तो कार्यात्मक या क्लासिक एन सेल की कमी, कम या अनुपस्थित साइटोटोक्सिक गतिविधि। ऐतिहासिक दृष्टि से, cytotoxicity रेडियोधर्मी विधियों, जो बोझिल, महंगे और संभावित रूप से खतरनाक हैं के साथ जांच की गई है। यह आलेख एन सेल साइटोटोक्सिक गतिविधि मात्रा ठहराना करने के लिए एक सुव्यवस्थित, चिकित्सकीय लागू प्रवाह cytometry-आधारित विधि का वर्णन करता है। इस परख में, परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं (PBMCs) या शुद्ध एन सेल तैयारी एन सेल-मध्यस्थता cytotoxicity करने के लिए (NKCC) संवेदनशील हो जाना एक लक्ष्य ट्यूमर कोशिका लाइन के साथ सह-अलग अनुपात में incubated हैं। लक्ष्य कक्ष पूर्व उनके भेदभाव effector कोशिकाओं (एन. के. कोशिकाओं) से अनुमति देने के लिए एक फ्लोरोसेंट रंजक के साथ लेबल किए गए हैं। ऊष्मायन अवधि के बाद, मारे गए लक्ष्य कक्ष एक न्यूक्लिक अम्ल दाग, जो विशेष रूप से व्याप्त मृत कोशिकाओं द्वारा पहचाने जाते हैं। इस विधि दोनों नैदानिक और अनुसंधान अनुप्रयोगों और, प्रवाह cytometry की मल्टी-पैरामीटर क्षमताओं करने के लिए धन्यवाद करने के लिए उत्तरदायी है, संभवतः एन सेल phenotype और समारोह के एक गहरे विश्लेषण को सक्षम करने के जोड़ा लाभ है।

परख अप सेट करने से पहले, यह उच्च अनुशंसित है कि एन सेल सामग्री पसंद की effector जनसंख्या में मूल्यांकन किया। चित्रा 1 से पता चलता है एक ठेठ CD56 धुंधला हो (पहले हल्का नीला) और (लाल) एन सेल संव?...

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A Flow Cytometry-Based Cytotoxicity Assay for the Assessment of Human NK Cell Activity

मात्रात्मक मानव प्राकृतिक किलर कोशिकाओं की साइटोटोक्सिक गतिविधि निर्धारित करने के लिए एक प्रवाह cytometry-आधारित विधि यहाँ दिखाया गया है।

एक प्रवाह Cytometry-आधारित Cytotoxicity परख मानव एन सेल गतिविधि के मूल्यांकन के लिए

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