Name: a flow cytometry-based cytotoxicity assay for the assessment of human nk cell activity
Uploaded: 2017-08-09T14:00:00
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우리는 나 르 시 소 질, ucla의 Immunogenetics 센터, 원고 준비와 그녀의 지원에 대 한 감사 하 고 싶습니다.

Samples were collected according to the ethical guidelines established by the UCLA Human Research Protection Program and IRB approved.
1. Preparation of reagents
NOTE: Unless otherwise stated, all reagents should be allowed to equilibrate at room temperature prior to use. All reagents must remain sterile.
<ol>
	<li>Prepare a 2x working solution of Tween-20 (i.e., 0.2%) by adding 10&#160;&#181;L of Tween-20 solution to 5 mL of phosphate-buffered saline (PBS) withou...

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	<li>Iannello, A., Debbeche, O., Samarani, S., Ahmad, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antiviral+NK+cell+responses+in+HIV+infection:+I.+NK+cell+receptor+genes+as+determinants+of+HIV+resistance+and+progression+to+AIDS.">Antiviral NK cell responses in HIV infection: I. NK cell receptor genes as determinants of HIV resistance and progression to AIDS.</a> J Leukoc Biol. 84 (1), 1-26 (2008).</li><li>Caligiuri, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+natural+killer+cells.">Human natural killer cells.</a> Blood. 112 (3), 461-469 (2008).</li><li>Topham, N. J., Hewitt, E. 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M., Willemze, R., Falkenburg, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+CFSE-based+assay+to+determine+susceptibility+to+lysis+by+cytotoxic+T+cells+of+leukemic+precursor+cells+within+a+heterogeneous+target+cell+population.">New CFSE-based assay to determine susceptibility to lysis by cytotoxic T cells of leukemic precursor cells within a heterogeneous target cell population.</a> Blood. 103 (7), 2677-2682 (2004).</li><li>Lecoeur, H., Fevrier, M., Garcia, S., Riviere, Y., Gougeon, M. 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S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Practical+NK+cell+phenotyping+and+variability+in+healthy+adults.">Practical NK cell phenotyping and variability in healthy adults.</a> Immunol Res. 62 (3), 341-356 (2015).</li><li>Zons, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+europium+and+chromium+release+assays:+cytotoxicity+in+healthy+individuals+and+patients+with+cervical+carcinoma.">Comparison of europium and chromium release assays: cytotoxicity in healthy individuals and patients with cervical carcinoma.</a> Clin Diagn Lab Immunol. 4 (2), 202-207 (1997).</li><li>Yovel, G., Shakhar, K., Ben-Eliyahu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+sex,+menstrual+cycle,+and+oral+contraceptives+on+the+number+and+activity+of+natural+killer+cells.">The effects of sex, menstrual cycle, and oral contraceptives on the number and activity of natural killer cells.</a> Gynecol Oncol. 81 (2), 254-262 (2001).</li><li>Laue, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+NK+cell+function+in+obese+healthy+humans.">Altered NK cell function in obese healthy humans.</a> BMC Obes. 2, 1 (2015).</li><li>Hazeldine, J., Lord, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+ageing+on+natural+killer+cell+function+and+potential+consequences+for+health+in+older+adults.">The impact of ageing on natural killer cell function and potential consequences for health in older adults.</a> Ageing Res Rev. 12 (4), 1069-1078 (2013).</li></ol>

여기 설명 하는 방법을 NK 세포의 세포 독성 활동을 평가 하기 위해 전통적인 51Cr 자료 분석 결과에 대 한 간단 하 고 비용 효율적인 대안을 제공 합니다. 이 방법은, 재현성, 민감하고 CRA, 같은 이전 표준 방법 보다 적게 시간이 걸리는 임상 모두에 사용할 수 있습니다 이며 응용 연구.
동안 분석 결과 총 PBMCs와 풍부한 NK 세포, 세포 인구를 정화 필요 없이 PBMCs을 사용 하 ...

자연적인 살인자 (NK) 세포는 virally 감염 된 세포, 변형 된 세포, 그리고 다른 병원 성 위협 1,2의 제거에서 비판적으로 관련 된 인간의 타고 난 세포의 정교한 부분 집합. NK 세포 용균성 립 집 perforin 등 granzymes 세포 독성 단백질. 활성화, NK 세포는 직접 대상 세포 세포의 용 해 및 apoptosis, cytokine 및 chemokine 릴리스 함께 결과로 이러한 cytolytic 분자 로컬로 출시 되 면 면역 시 냅 스로 알려진 그들의 목표와 복잡 한 상호 작용을 형성 하 고 궁극적으로 염증의 유도에서 상태 1,,34.
NK 세포 활성화 활성화의 복잡 한 문자열을 포함 하 고 억제 상호작용 NK 세포 수용 체와 ligands 단단히 규제 시스템을 형성 하는 대상 셀의 표면에 표현. NK 세포 활성화의 가장 공부 메커니즘 중 하나는 "누락 자가"입니다. 사실, 내가 중요 한 조직 적합성 복잡 한 (MHC), 또는 인간 백혈구 항 원 (HLA) 분자에 클래스의 탐지의 부족 감염 또는 변형 세포 트리거 NK 세포 세포 독성. 종양과 바이러스 감염 세포 일반적으로 downregulate T 세포 중재 면역, 따라서 기본 NK 지 고 탈출이 항 원 셀 대상 1,,34.
NK 세포의 기능에 대 한 평가 주로 degranulation 또는 세포 독성으로 분류 분석 실험. 그러나, degranulation 관련 마커 CD107a의 흐름 cytometric 감지와 같은 degranulation 분석 실험, NK 세포 활성화 그리고 그들의 궁극적인 기능, 대상 셀 5,6,,78의 직접적인 살인의 아닙니다 나타내는 있습니다. 따라서,이 제한 더 이야기 하 고 더 직접적인 대안으로 세포 독성 분석 실험에 조사를 받고 있다.
T와 NK 세포의 세포 독성 활동 셀 중재를 평가 하기 위한 오랜 "금 표준" 크롬 방출 분석 결과 (CRA) 이다. CRA 포함 방사성 51Cr 대상 셀의 라벨 공동 effector 세포 배양. 이 분석 결과 세포 세포의 용 해 단백질 바인딩 51Cr 감마 계산에 의해 측정 될 수 있는 상쾌한에의 릴리스 결과 원리에 가득한은. 효과적인, 반면이 분석 결과 여러 가지 이유로 문제가: 높은 물자 비용, 처리 및 방사성 51Cr의 처리, 51Cr의 자발적인 릴리스 및 어려운 표준화-그건 전부 허무 9,10.
다양 한 형광 라벨, 효소 릴리스, 그리고 심지어 생물 발광, 관련 된 비 방사능 분석 실험 이후 CRA 11,12,,1314대 안으로 개발 되었다. 여기의 NK 세포 세포 독성 활동 K562 대상 셀에, 민감한, 간단 하 고 재현성 있는 측정 흐름 cytometry 기반 방법을 설명 합니다. K562 세포는 인간의 erythroleukemic 셀 라인 감소 표현의 HLA 클래스와 내가 그들을 특히 NK 세포 독성 세포 중재 15에 취약 하 게 activatory NK 수용 체에 ligands의 과장 된 표현. 이 분석 결과에서 K562 셀 carboxyfluorescein diacetate succinimidyl 에스테 르 (CFSE) 표시 미리 어느 주변 혈액 단 세포 (PBMCs)와 함께 다양 한 비율에서 공동 경작 또는 NK 세포 1정화. CFSE는 안정, 단백질 바인딩 형광 염료 이펙터 NK 세포 16,17에서 대상 셀의 차별 수 있습니다. 공동 부 화 후 특히 permeating 죽은 세포의 막, 핵 산 얼룩 살해 대상 세포 (재료의 표 참조)를 식별 하는 데 사용 됩니다. 샘플은 죽은 (즉, 얼룩 +)의 비율을 결정 하는 흐름 cytometer에 취득 CFSE + 대상 셀.
이 분석 결과는 약 30 알려진된 결함 기능 또는 고전적인 NK 세포 결핍을 일으키는 원인이 되는 NK 세포 구획에 영향을 미치는 monogenic 결함에 대 한 및 기본 또는 보조 hemophagocytic lymphohistiocytosis에 대 한 일상적인 진단 심사로 사용할 수 있습니다. 그것은 또한 기초 연구 응용 프로그램의 호스트에 대 한 조 혈 모 세포 이식 또는 게시물 immunomodulatory 치료 18,,1920다음 면역 재구성을 평가 하기 위해 재발, 심한 헤 르 페 스 바이러스 감염 환자에서 NK 세포 활동을 조사 하는 데 유용.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered Saline (1x, w/o Ca2+ and Mg2+)</td>
			<td>Corning (Cellgro)</td>
			<td>21-040-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll-Paque PLUS</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-1440-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>BP337-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Media</td>
			<td>Corning (Cellgro)</td>
			<td>10-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat-inactivated Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Omega Scientific</td>
			<td>FB-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140-163</td>
			<td>Stock solution at 10,000 U/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-2</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>202-IL-050</td>
			<td>Lyophilized from a 0.2 &#956;m filtered solution in Acetonitrile and TFA with BSA as a carrier protein. Reconstitute with 500 ul at 100 &#956;g/mL in sterile 100 mM Acetic Acid containing at least 0.1% bovine serum albumin (2.1x10E6 IU/ml)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K562 Cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-243</td>
			<td>Cancer cell line&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-75 cell culture flasks</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431464</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFSE cell proliferation kit</td>
			<td>Life Technologies (CellTrace)</td>
			<td>C34554</td>
			<td>Reconstitute I vial with 18 ul DMSO to prepare a 5mM stock solution. Do not freeze/thaw.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sytox Red</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>S34859</td>
			<td>Stock solution is provided at 5 &#956;M in 1 mL DMSO. The DMSO solution may be subjected to multiple freeze-thaw cycles without reagent degradation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium/lithium heparin blood collection tubes</td>
			<td>BD</td>
			<td>02-687-95</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-bottom 96-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS3897</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipettes</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene round-bottom tubes (5mL)</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>14959-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL polypropylene conical tube</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL polypropylene conical tube</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent reservoir</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>2321-2230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human NK cell enrichment cocktail</td>
			<td>StemCell Technologies (RosetteSep)</td>
			<td>15065</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a flow cytometry-based cytotoxicity assay for the assessment of human nk cell activity

타고 난 면역 계통 내에서 이펙터 세포 자연 킬러 (NK) 세포로 알려진 탈 선 셀, 구체적으로 종양을 제거 하 고 virally 감염 된 세포에 대 한 호스트 방어에 필수적인 역할을 재생할. 다른 병 적인 상태의 호스트 함께 약 30 알려진된 monogenic 결함 발생 기능 또는 고전적인 NK 세포 결핍에서 만들어 낸 감소 또는 세포 독성 활동을 결 석. 역사적으로, 세포 독성은, 비싼 복잡 하 고 잠재적으로 위험한 방사성 방법 조사 하고있다. 이 문서는 NK 세포의 세포 독성 활동을 계량 유선형, 임상 적용 흐름 cytometry 기반 메서드를 설명 합니다. 이 분석 결과에 주변 혈액 단 세포 (PBMCs) 또는 순화 된 NK 세포 준비는 다른 비율에서 공동 incubated NK 세포 중재 된 세포 독성 (NKCC)에 민감한 것으로 알려져 대상 종양 세포 라인. 대상 세포는 효과 기 세포 (NK 세포)에서 그들의 차별 수 있도록 형광 염료와 사전 분류. 잠복기, 후 살해 대상 세포 특히 죽은 세포를 침투 하는 핵 산 얼룩에 의해 식별 됩니다. 이 방법은 의무가 모두 진단 및 연구 애플리케이션과, cytometry의 다중 매개 변수 기능에 감사 합니다는, 잠재적으로 NK 세포 표현 형 및 기능에 대 한 깊은 분석의 추가한 이점이 있다.

분석 결과 설정 하기 전에 NK 셀 내용 선택의 이펙터 인구에 평가 될 것이 좋습니다. 그림 1 에 일반적인 CD56 얼룩 (밝은 파란색) 전에 나와 (빨간색) NK 세포 농축 후. NK 세포 PBMCs의 최대 15% 고 농축 후 순수 80% 이상 이어야 한다.
흐름 cytometric 분석이 분석이 결과에 두 개의 매개 변수 검색 포함: CFSE, FITC;로 ?...

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A Flow Cytometry-Based Cytotoxicity Assay for the Assessment of Human NK Cell Activity

양적 인간의 자연 킬러 세포의 세포 독성 활동을 결정 하는 흐름 cytometry 기반 방법은 여기에 표시 됩니다.

인간 NK 세포 활동의 평가 대 한 흐름 Cytometry 기반 세포 독성 분석 실험

Within the innate immune system, effector lymphocytes known as natural killer (NK) cells play an essential role in host defense against aberrant cells, ...

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Natural killer (NK) cells play an important role in immune surveillance against a variety of infectious microorganisms and tumors. Limited availability of ...

연구

면역학 및 감염병학

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

사람의 체외에서</em면역 불균형의 초기 국가의 인정을위한 심사 도구를> 억제

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response ...

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Cytolytic activity of CD8+ T cells is rarely evaluated. We describe here a new cell-based assay to measure the capacity of antigen-specific CD8+ T cells ...

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Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

망막 미세 아교 식세포의 기능을 평가<em&gt; 생체</em&gt;은 유동 세포 계측법 기반 분석을 사용하여

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NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

Dextran Enhances the Lentiviral Transduction Efficiency of Murine and Human Primary NK Cells

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Cas9 Ribonucleoproteins를 사용 하 여 노크 아웃 기본 및 확장 된 인간 NK 세포의 생성

CRISPR/Cas9 technology is accelerating genome engineering in many cell types, but so far, gene delivery and stable gene modification have been challenging ...