Name: precise, high-throughput analysis of bacterial growth
Uploaded: 2017-09-19T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Precise, High-throughput Analysis of Bacterial Growth at JoVE.com

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

1. forberede vækstmediet NOTE: den kemiske sammensætning af minimal medium M63 er som følger: 62 mM K 2 HPO 4, 39 mM KH 2 PO 4, 15 mM (NH 4) 2 SO 4, 1,8 µM FeSO 4, 15 µM thiamin-HCl, 0,2 mM MgSO 4 og 22 mM glukose. M63 er lavet ved at blande tre stamopløsninger: fem X løsning, 20% glucose og MgSO 4 thiamin løsning. Opbevar alle løsninger ved 4 ° C.
<ol><li>Forbereder fem...

<ol>
	<li>Kovarova-Kovar, K., Egli, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+kinetics+of+suspended+microbial+cells:+from+single-substrate-controlled+growth+to+mixed-substrate+kinetics.">Growth kinetics of suspended microbial cells: from single-substrate-controlled growth to mixed-substrate kinetics.</a> Microbiol Mol Biol Rev. 62 (3), 646-666 (1998).</li><li>Soupene, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+studies+of+Escherichia+coli+strain+MG1655:+growth+defects+and+apparent+cross-regulation+of+gene+expression.">Physiological studies of Escherichia coli strain MG1655: growth defects and apparent cross-regulation of gene expression.</a> J Bacteriol. 185 (18), 5611-5626 (2003).</li><li>Sezonov, G., Joseleau-Petit, D., D'Ari, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escherichia+coli+physiology+in+Luria-Bertani+broth.">Escherichia coli physiology in Luria-Bertani broth.</a> J Bacteriol. 189 (23), 8746-8749 (2007).</li><li>Egli, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+growth+and+physiology:+a+call+for+better+craftsmanship.">Microbial growth and physiology: a call for better craftsmanship.</a> Front Microbiol. 6, 287 (2015).</li><li>Kurokawa, M., Seno, S., Matsuda, H., Ying, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+between+genome+reduction+and+bacterial+growth.">Correlation between genome reduction and bacterial growth.</a> DNA Res. 23 (6), 517-525 (2016).</li><li>Matsumoto, Y., Murakami, Y., Tsuru, S., Ying, B. W., Yomo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+rate-coordinated+transcriptome+reorganization+in+bacteria.">Growth rate-coordinated transcriptome reorganization in bacteria.</a> BMC Genomics. 14, 808 (2013).</li><li>Nahku, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+growth+rate+dependent+transcriptome+profiling+of+Escherichia+coli+K12+MG1655+in+accelerostat+cultures.">Specific growth rate dependent transcriptome profiling of Escherichia coli K12 MG1655 in accelerostat cultures.</a> J Biotechnol. 145 (1), 60-65 (2010).</li><li>Dai, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduction+of+translating+ribosomes+enables+Escherichia+coli+to+maintain+elongation+rates+during+slow+growth.">Reduction of translating ribosomes enables Escherichia coli to maintain elongation rates during slow growth.</a> Nat Microbiol. 2, 16231 (2016).</li><li>Madrid, R. E., Felice, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+biomass+estimation.">Microbial biomass estimation.</a> Crit Rev Biotechnol. 25 (3), 97-112 (2005).</li><li>Harris, C. M., Kell, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+estimation+of+microbial+biomass.">The estimation of microbial biomass.</a> Biosensors. 1 (1), 17-84 (1985).</li><li>Yates, G. T., Smotzer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+lag+phase+and+initial+decline+of+microbial+growth+curves.">On the lag phase and initial decline of microbial growth curves.</a> J Theor Biol. 244 (3), 511-517 (2007).</li><li>Kargi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Re-interpretation+of+the+logistic+equation+for+batch+microbial+growth+in+relation+to+Monod+kinetics.">Re-interpretation of the logistic equation for batch microbial growth in relation to Monod kinetics.</a> Lett Appl Microbiol. 48 (4), 398-401 (2009).</li><li>Peleg, M., Corradini, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+growth+curves:+what+the+models+tell+us+and+what+they+cannot.">Microbial growth curves: what the models tell us and what they cannot.</a> Crit Rev Food Sci Nutr. 51 (10), 917-945 (2011).</li><li>Sprouffske, K., Wagner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growthcurver:+an+R+package+for+obtaining+interpretable+metrics+from+microbial+growth+curves.">Growthcurver: an R package for obtaining interpretable metrics from microbial growth curves.</a> BMC Bioinformatics. 17, 172 (2016).</li><li>Hall, B. G., Acar, H., Nandipati, A., Barlow, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+rates+made+easy.">Growth rates made easy.</a> Mol Biol Evol. 31 (1), 232-238 (2014).</li><li>Hermsen, R., Okano, H., You, C., Werner, N., Hwa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+growth-rate+composition+formula+for+the+growth+of+E.coli+on+co-utilized+carbon+substrates.">A growth-rate composition formula for the growth of E.coli on co-utilized carbon substrates.</a> Mol Syst Biol. 11 (4), 801 (2015).</li><li>Engen, S., Saether, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=r-+and+K-selection+in+fluctuating+populations+is+determined+by+the+evolutionary+trade-off+between+two+fitness+measures:+Growth+rate+and+lifetime+reproductive+success.">r- and K-selection in fluctuating populations is determined by the evolutionary trade-off between two fitness measures: Growth rate and lifetime reproductive success.</a> Evolution. 71 (1), 167-173 (2017).</li></ol>

Kritiske trin i protokollen omfatter udarbejdelse af en fælles bestand af eksponentielt voksende celler og replikering af de samme prøver i flere brønde på forskellige positioner på en mikrotiterplade. Tidligere, mikrobiologer startede kulturen fra en overnatning før kultur. Denne metode kan reducere tidsforsinkelsen for bakteriel vækst, men det er vanskeligt at opnå reproducerbare vækstkurver. Som vist i figur 2, resulterede de uafhængige målinger ved hjælp af de fælles glycero...

Mikrobiologiske undersøgelser starte ofte med kulturen i bakterieceller og vurderingen af bakterievækst kurver, som repræsenterer et grundlæggende fænomen for bakteriel fysiologi1,2,3. Grundlæggende kultur principper er bredt tilgængelige i offentliggjort forskningslitteratur og lærebøger, fordi bakteriekulturen er en grundlæggende metode. På niveauet bænk betydelig opmærksomhed har traditionelt været fokuseret på optimering vækst medier og dyrkning betingelser, men kontrollerer vækstraten, der vil sandsynligvis give endnu større forståelse af mikrobiel fysiologi, har ikke været grundigt undersøgte4. For eksponentielt voksende bakterier, er en vigtigste parameter i den cellulære stat den vækstrate, der er blevet rapporteret at være samordnet med den genom og transkriptom, proteom5,6,7,8 . Kvantitative evaluering af bakteriel vækst er således afgørende for forståelsen af mikrobiel fysiologi.
For at evaluere bakterievækst, eksperimentelle metoder til at anslå biomasse er veletableret9,10 og er baseret på påvisning af biokemiske, fysiske eller biologiske parametre, såsom optiske turbiditet. Derudover er de analysemetoder, der anvendes til at fange de dynamiske egenskaber af væksten ændringer almindeligt baseret på etablerede ikke-lineære modeller11,12,13, eksempelvis logistic ligninger. Vækst dynamics er generelt erhvervet timet stikprøveanalyse af cellevækst i kultur af enten måling optisk turbiditet eller udfører kolonidannende enhed (CFU) assays. Begrænsning af disse dyrkning og påvisning metoder er at datapunkterne ikke er et sandt billede af populationsdynamikken, fordi måling intervaller er ofte i timer og kultur betingelse (f.eks.ændringer i temperatur og beluftning) er forstyrret på tidspunktet for prøveudtagningen. Kultur og analyse teknikker skal opdateres ved hjælp af den seneste udvikling i teknologi og forståelse. De seneste fremskridt i mikrotiterplade læsere giver mulighed for real-time observation af bakterievækst og betydeligt reducere omkostninger til arbejdsløn. Brug disse avancerede enheder, har de seneste undersøgelser på bakteriel vækst rapporteret analysemetoder til høj overførselshastighed målinger14,15.
Formålet med denne protokol er at vurdere den præcise vækst dynamik i en høj overførselshastighed måde, som vil være værdifuld for kvantitative undersøgelser, der i sidste ende løse spørgsmålene om hvordan væksten bestemmes og hvilke faktorer påvirker vækstraten. Protokollen adresser alle faktorer, der bør tages hensyn til den gentagelig og præcis kvantificering af bakterievækst. Den eksperimentelle metode og analyse er beskrevet i detaljer i hovedteksten. Denne metode tillader den nøjagtige og reproducerbare analyse af bakterievækst i en høj overførselshastighed måde. Mikrobiologer kan bruge denne protokol til at udlede yderligere kvantitative resultater fra deres eksperimentelle bevismateriale. Denne protokol kan også bruges til studier i systembiologi, der forsøger at drage grundlæggende konklusioner eller at opnå en teoretisk overblik over vækst.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>Wako</td>
			<td>164-04295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Wako</td>
			<td>166-04255</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(NH4)2SO4</td>
			<td>Wako</td>
			<td>019-03435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4-7H2O</td>
			<td>Wako</td>
			<td>138-00415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiamine-HCl</td>
			<td>Wako</td>
			<td>201-00852</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glucose</td>
			<td>Wako</td>
			<td>049-31165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Wako</td>
			<td>080-01066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iron (II) sulfate heptahydrate (FeSO4-7H2O)</td>
			<td>Wako</td>
			<td>094-01082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH</td>
			<td>Wako</td>
			<td>168-21815</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Wako</td>
			<td>075-00611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tube (50 mL, sterilized)</td>
			<td>WATSON</td>
			<td>1342-050S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips, 200 &#181;L</td>
			<td>WATSON</td>
			<td>110-705Y</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips, 1000 &#181;L</td>
			<td>WATSON</td>
			<td>110-8040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtube (1.5 mL)</td>
			<td>WATSON</td>
			<td>131-715C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8 multichannel-pipette</td>
			<td>WATSON</td>
			<td>NT-8200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PASORINA STIRRER</td>
			<td>AS ONE</td>
			<td>2-4990-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass cylinder (200 mL)</td>
			<td>AS ONE</td>
			<td>1-8562-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision pH mater</td>
			<td>AS ONE</td>
			<td>AS800 / 1-054-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman P-200</td>
			<td>GILSON</td>
			<td>1-6855-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman P-1000</td>
			<td>GILSON</td>
			<td>1-6855-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Serolocical Pipettes (10 mL)</td>
			<td>SANPLATEC</td>
			<td>SAN27014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Serolocical Pipettes (25 mL)</td>
			<td>SANPLATEC</td>
			<td>SAN27015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtube stand</td>
			<td>BM Bio</td>
			<td>801-02Y</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>BM Bio</td>
			<td>BM-V1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Costar 96-well microplate with lid (Flat bottom, Clear)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Corning, 3370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Costar reagent reservoir (50 mL)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Corning, 4870</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stericup GV PVDF (250 mL, 0.22 &#181;M)</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>SCGVU02RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet-Aid XP</td>
			<td>DRUMMOND</td>
			<td>4-000-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioshaker (BR-23UM MR)</td>
			<td>TAITEC</td>
			<td>0053778-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposal cell (1.5 mL)</td>
			<td>Kartell</td>
			<td>1938 / 2-478-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DU 730 Life Science UV/Vis Spectrophotometer</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A23616</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EPOCH2</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>2014-EP2-002 / EPOCH2T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beaker (500 mL)</td>
			<td>IWAKI</td>
			<td>82-0008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BIO clean bench</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>MCV-B131F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass tubes</td>
			<td>NICHIDEN RIKA GLASS</td>
			<td>P-10M~P-30 /101019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone rubber stoppers</td>
			<td>ShinEtsu Polymer</td>
			<td>T-19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacterial strains</td>
			<td>Strain bank organization; National Bio Resource Project (NBRP) in Japan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

precise, high-throughput analysis of bacterial growth

Bakterievækst er et centralt begreb i udviklingen af moderne mikrobiel fysiologi samt i undersøgelsen af cellulære dynamics på systemer plan. Nylige undersøgelser har rapporteret korrelationer mellem bakterievækst og genome-wide begivenheder, såsom genom reduktion og transkriptom reorganisering. Korrekt analysere bakterievækst er afgørende for at forstå den vækst-afhængige koordinering af genet funktioner og cellulære komponenter. Det er derfor nødvendigt præcis kvantitativ evaluering af bakteriel vækst på en måde, høj overførselshastighed. Nye teknologiske udvikling tilbyder nye eksperimentelle værktøjer, der tillader opdateringer af de benyttede metoder til at studere bakterievækst. I protokollen indføres her beskæftiger en mikrotiterplade læseren med en stærkt optimeret eksperimentel procedure for den reproducerbare og præcis vurdering af bakterievækst. Denne protokol blev brugt til at evaluere vækst af flere tidligere beskrevet Escherichia coli stammer. De vigtigste trin i protokollen er som følger: udarbejdelse af et stort antal celle bestande i små hætteglas for gentagne forsøg med reproducerbare resultater, brug af 96-brønd plader for høj overførselshastighed vækst evaluering og manuel beregning af to store parametre (dvs., maksimal vækst sats og befolkningen tæthed) repræsenterer vækst dynamics. I forhold til den traditionelle kolonidannende enhed (CFU) analyse, som tæller de celler, der er kulturperler i glasrør over tid på agar plader, den nuværende metode er mere effektiv og giver mere nøjagtige tidsmæssige optegnelser over vækst ændringer, men har en strengere detektionsgrænsen på lav befolkningstæthed. I Resumé er den beskrevne metode fordelagtig for den nøjagtige og reproducerbare høj overførselshastighed analyse af bakteriel vækst, som kan bruges til konceptuelle konklusioner eller at gøre teoretiske betragtninger.

Den beskrevne metode giver mulighed for at fange dynamisk bakterievækst i en kontinuerlig, høj overførselshastighed måde ved at udnytte en 96-brønds format læser, der tager flere ekstinktionen målinger ved forskellige tidsintervaller (fra minutter til timer til dage). Vækstkurver af et sortiment af E. coli stammer udtrykker forskellige genomer kan netop erhvervet i et enkelt eksperiment (figur 1A). I forhold til den beskrevne metode, den trad...

Watch this Scientific Journal Video about Precise, High-throughput Analysis of Bacterial Growth at JoVE.com

Precise, High-throughput Analysis of Bacterial Growth

Præcis, høj overførselshastighed analyse af bakterievækst

Kvantitative evaluering af bakteriel vækst er nødvendigt for at forstå mikrobiel fysiologi som en systemniveau fænomen. En protokol til eksperimentelle manipulation og en analytisk tilgang introduceres, giver mulighed for præcis, høj overførselshastighed analyse af bakteriel vækst, som er et centralt emne af interesse i systembiologi.

Bacterial growth is a central concept in the development of modern microbial physiology, as well as in the investigation of cellular dynamics at the ...

Research

JoVE Journal

Biology

High-throughput Yeast Plasmid Overexpression Screen

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a powerful model system for defining fundamental mechanisms of many important cellular processes, ...

High Throughput Microinjections of Sea Urchin Zygotes

High Throughput Microinjections af søpindsvin Zygoter

Microinjection into cells and embryos is a common technique that is used to study a wide range of biological processes. In this method a small amount of ...

A High Throughput MHC II Binding Assay for Quantitative Analysis of Peptide Epitopes

En High Throughput MHC II Bindende Assay til kvantitativ analyse af peptidepitoper

Biochemical assays with recombinant human MHC II molecules can provide rapid, quantitative insights into immunogenic epitope identification, deletion, or ...

Recovery of Adult Zebrafish Hearts for High-throughput Applications

Inddrivelse af voksne zebrafisk Hearts for high-throughput applikationer

Use of the zebrafish model system for studying development, regeneration, and disease is expanding toward use of adult hearts for cell dissociation and ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

High-throughput screening for kemiske modulatorer af post-transkriptionelt regulerede gener

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

qPCRTag Analysis - A High Throughput, Real Time PCR Assay for Sc2.0 Genotyping

qPCRTag Analyse - En High Throughput, Real Time PCR-analysen for Sc2.0 Genotypebestemmelse

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic ...

Automated Modular High Throughput Exopolysaccharide Screening Platform Coupled with Highly Sensitive Carbohydrate Fingerprint Analysis

Automatiseret Modular High Throughput exopolysaccharid Screening Platform Sammen med Highly Sensitive Kulhydrat Fingerprint Analysis

Many microorganisms are capable of producing and secreting exopolysaccharides (EPS), which have important implications in medical fields, food ...

High Throughput Danio Rerio Energy Expenditure Assay

High Throughput Danio Rerio Energy Expenditure Assay

High throughput<em&gt; Danio rerio</em&gt; Energi Udgifter Assay

Zebrafish are an important model organism with inherent advantages that have the potential to make zebrafish a widely applied model for the study of ...

Applications of pHluorin for Quantitative, Kinetic and High-throughput Analysis of Endocytosis in Budding Yeast

Anvendelser af pHluorin Kvantitative, Kinetic og High-throughput Analyse af Endocytose i Spirende gær

Green fluorescent protein (GFP) and its variants are widely used tools for studying protein localization and dynamics of events such as cytoskeletal ...

Isolation, Characterization, And High Throughput Extracellular Flux Analysis of Mouse Primary Renal Tubular Epithelial Cells

Isolation, karakterisering og High Throughput ekstracellulære Flux analyse af musen primær Renal tubulær epitelceller

Mitochondrial dysfunction in the renal tubular epithelial cells (TECs) can lead to renal fibrosis, a major cause of&#160;chronic kidney disease (CKD). ...