Name: precise, high-throughput analysis of bacterial growth
Uploaded: 2017-09-19T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Precise, High-throughput Analysis of Bacterial Growth at JoVE.com

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

1. préparer le milieu de culture Remarque : la composition chimique des M63 moyenne minimale est la suivante : 62 mM K 2 HPO 4, 39 mM KH 2 PO 4, 15 mM (NH 4) 2 SO 4 1,8 µM FeSO 4, 15 µM thiamine-HCl, 0,2 mM MgSO 4 et 22 mM de glucose. M63 est fabriqué en mélangeant trois solutions mères : solution X cinq, 20 % de glucose et MgSO 4 solution de thiamine. Conserver toutes les so...

<ol>
	<li>Kovarova-Kovar, K., Egli, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+kinetics+of+suspended+microbial+cells:+from+single-substrate-controlled+growth+to+mixed-substrate+kinetics.">Growth kinetics of suspended microbial cells: from single-substrate-controlled growth to mixed-substrate kinetics.</a> Microbiol Mol Biol Rev. 62 (3), 646-666 (1998).</li><li>Soupene, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+studies+of+Escherichia+coli+strain+MG1655:+growth+defects+and+apparent+cross-regulation+of+gene+expression.">Physiological studies of Escherichia coli strain MG1655: growth defects and apparent cross-regulation of gene expression.</a> J Bacteriol. 185 (18), 5611-5626 (2003).</li><li>Sezonov, G., Joseleau-Petit, D., D'Ari, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escherichia+coli+physiology+in+Luria-Bertani+broth.">Escherichia coli physiology in Luria-Bertani broth.</a> J Bacteriol. 189 (23), 8746-8749 (2007).</li><li>Egli, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+growth+and+physiology:+a+call+for+better+craftsmanship.">Microbial growth and physiology: a call for better craftsmanship.</a> Front Microbiol. 6, 287 (2015).</li><li>Kurokawa, M., Seno, S., Matsuda, H., Ying, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+between+genome+reduction+and+bacterial+growth.">Correlation between genome reduction and bacterial growth.</a> DNA Res. 23 (6), 517-525 (2016).</li><li>Matsumoto, Y., Murakami, Y., Tsuru, S., Ying, B. W., Yomo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+rate-coordinated+transcriptome+reorganization+in+bacteria.">Growth rate-coordinated transcriptome reorganization in bacteria.</a> BMC Genomics. 14, 808 (2013).</li><li>Nahku, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+growth+rate+dependent+transcriptome+profiling+of+Escherichia+coli+K12+MG1655+in+accelerostat+cultures.">Specific growth rate dependent transcriptome profiling of Escherichia coli K12 MG1655 in accelerostat cultures.</a> J Biotechnol. 145 (1), 60-65 (2010).</li><li>Dai, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduction+of+translating+ribosomes+enables+Escherichia+coli+to+maintain+elongation+rates+during+slow+growth.">Reduction of translating ribosomes enables Escherichia coli to maintain elongation rates during slow growth.</a> Nat Microbiol. 2, 16231 (2016).</li><li>Madrid, R. E., Felice, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+biomass+estimation.">Microbial biomass estimation.</a> Crit Rev Biotechnol. 25 (3), 97-112 (2005).</li><li>Harris, C. M., Kell, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+estimation+of+microbial+biomass.">The estimation of microbial biomass.</a> Biosensors. 1 (1), 17-84 (1985).</li><li>Yates, G. T., Smotzer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+lag+phase+and+initial+decline+of+microbial+growth+curves.">On the lag phase and initial decline of microbial growth curves.</a> J Theor Biol. 244 (3), 511-517 (2007).</li><li>Kargi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Re-interpretation+of+the+logistic+equation+for+batch+microbial+growth+in+relation+to+Monod+kinetics.">Re-interpretation of the logistic equation for batch microbial growth in relation to Monod kinetics.</a> Lett Appl Microbiol. 48 (4), 398-401 (2009).</li><li>Peleg, M., Corradini, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+growth+curves:+what+the+models+tell+us+and+what+they+cannot.">Microbial growth curves: what the models tell us and what they cannot.</a> Crit Rev Food Sci Nutr. 51 (10), 917-945 (2011).</li><li>Sprouffske, K., Wagner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growthcurver:+an+R+package+for+obtaining+interpretable+metrics+from+microbial+growth+curves.">Growthcurver: an R package for obtaining interpretable metrics from microbial growth curves.</a> BMC Bioinformatics. 17, 172 (2016).</li><li>Hall, B. G., Acar, H., Nandipati, A., Barlow, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+rates+made+easy.">Growth rates made easy.</a> Mol Biol Evol. 31 (1), 232-238 (2014).</li><li>Hermsen, R., Okano, H., You, C., Werner, N., Hwa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+growth-rate+composition+formula+for+the+growth+of+E.coli+on+co-utilized+carbon+substrates.">A growth-rate composition formula for the growth of E.coli on co-utilized carbon substrates.</a> Mol Syst Biol. 11 (4), 801 (2015).</li><li>Engen, S., Saether, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=r-+and+K-selection+in+fluctuating+populations+is+determined+by+the+evolutionary+trade-off+between+two+fitness+measures:+Growth+rate+and+lifetime+reproductive+success.">r- and K-selection in fluctuating populations is determined by the evolutionary trade-off between two fitness measures: Growth rate and lifetime reproductive success.</a> Evolution. 71 (1), 167-173 (2017).</li></ol>

Les étapes critiques du protocole comprennent la préparation d’un stock commun en croissance exponentielle des cellules et la réplication des mêmes échantillons dans plusieurs puits à différentes positions sur la microplaque. Auparavant, microbiologistes ont commencé la culture d’une culture avant une nuit ou plus. Alors que cette méthode peut réduire le temps de latence de la croissance bactérienne, il est difficile d’obtenir des courbes de croissance reproductibles. Comme illustré à la <strong class=...

Des études microbiologiques commencent souvent avec la culture de cellules bactériennes et l’évaluation des courbes de croissance bactérienne, qui représentent un phénomène fondamental de la physiologie bactérienne1,2,3. Principes de base de la culture sont largement disponibles dans la littérature de recherche publiés et les manuels scolaires parce que la culture bactérienne est une méthodologie fondamentale. À l’échelle de banc, une attention particulière a traditionnellement été axée sur l’optimisation des milieux et des conditions de culture, mais contrôle le taux de croissance, qui permettrait sans doute une plus grande compréhension de la physiologie microbienne, n’a pas été étudiés4. Pour les bactéries en croissance exponentielle, un paramètre-clé de l’État cellulaire est le taux de croissance, qui a été rapporté pour être coordonné avec le génome, transcriptome et du protéome5,6,7,8 . Ainsi, une évaluation quantitative de la croissance bactérienne est cruciale pour comprendre la physiologie microbienne.
Pour évaluer la croissance bactérienne, les méthodes expérimentales utilisées pour estimer la biomasse sont bien établis9,10 et sont basées sur la détection des paramètres biochimiques, physiques ou biologiques, telles que la turbidité optique. En outre, les méthodes analytiques utilisées pour capturer les propriétés dynamiques des changements de croissance couramment reposent sur des modèles non linéaires établi11,12,13, par exemple, les équations logistiques. Dynamique de croissance est généralement acquises par échantillonnage chronométré de la croissance des cellules en culture par mesure de turbidité optique ou effectuant des tests d’unité (CFU) formatrices. La limitation de ces méthodes de détection et de mise en culture, c’est que les points de données ne sont pas un reflet fidèle de la dynamique des populations, parce que les intervalles de mesure sont souvent en heures et que la condition de la culture (p. ex., changements de température et aération) est perturbée au moment de l’échantillonnage. Techniques de culture et d’analyse doivent être actualisés à l’aide des développements récents dans la technologie et la compréhension. Les progrès récents dans des lecteurs de microplaque permettent l’observation en temps réel de la croissance bactérienne et diminuent considérablement les coûts de main-d'œuvre. En utilisant ces dispositifs avancés, les dernières études sur la croissance bactérienne ont signalé des méthodes analytiques pour les mesures haut débit14,15.
Le but du présent protocole est d’évaluer la dynamique de croissance précis d’une manière de haut débit, qui est très utile pour les études quantitatives qui finalement répondre aux questions de la façon dont le taux de croissance est déterminé et quels facteurs influent sur le taux de croissance. Le protocole porte sur tous les facteurs qui doivent être pris en compte pour la quantification précise et reproductible de la croissance bactérienne. La méthode expérimentale et l’analyse sont décrites en détail dans le texte principal. Cette méthode permet l’analyse précise et reproductible de la croissance bactérienne dans une manière de haut débit. Microbiologistes peuvent utiliser ce protocole, de déduire des résultats quantitatifs supplémentaires leurs preuves expérimentales. Ce protocole peut également servir pour les études en biologie des systèmes qui tentent de tirer des conclusions conceptuelles ou pour obtenir un aperçu théorique de la croissance.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>Wako</td>
			<td>164-04295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Wako</td>
			<td>166-04255</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(NH4)2SO4</td>
			<td>Wako</td>
			<td>019-03435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4-7H2O</td>
			<td>Wako</td>
			<td>138-00415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiamine-HCl</td>
			<td>Wako</td>
			<td>201-00852</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glucose</td>
			<td>Wako</td>
			<td>049-31165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Wako</td>
			<td>080-01066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iron (II) sulfate heptahydrate (FeSO4-7H2O)</td>
			<td>Wako</td>
			<td>094-01082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH</td>
			<td>Wako</td>
			<td>168-21815</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Wako</td>
			<td>075-00611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tube (50 mL, sterilized)</td>
			<td>WATSON</td>
			<td>1342-050S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips, 200 &#181;L</td>
			<td>WATSON</td>
			<td>110-705Y</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips, 1000 &#181;L</td>
			<td>WATSON</td>
			<td>110-8040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtube (1.5 mL)</td>
			<td>WATSON</td>
			<td>131-715C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8 multichannel-pipette</td>
			<td>WATSON</td>
			<td>NT-8200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PASORINA STIRRER</td>
			<td>AS ONE</td>
			<td>2-4990-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass cylinder (200 mL)</td>
			<td>AS ONE</td>
			<td>1-8562-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision pH mater</td>
			<td>AS ONE</td>
			<td>AS800 / 1-054-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman P-200</td>
			<td>GILSON</td>
			<td>1-6855-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman P-1000</td>
			<td>GILSON</td>
			<td>1-6855-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Serolocical Pipettes (10 mL)</td>
			<td>SANPLATEC</td>
			<td>SAN27014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Serolocical Pipettes (25 mL)</td>
			<td>SANPLATEC</td>
			<td>SAN27015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtube stand</td>
			<td>BM Bio</td>
			<td>801-02Y</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>BM Bio</td>
			<td>BM-V1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Costar 96-well microplate with lid (Flat bottom, Clear)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Corning, 3370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Costar reagent reservoir (50 mL)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Corning, 4870</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stericup GV PVDF (250 mL, 0.22 &#181;M)</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>SCGVU02RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet-Aid XP</td>
			<td>DRUMMOND</td>
			<td>4-000-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioshaker (BR-23UM MR)</td>
			<td>TAITEC</td>
			<td>0053778-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposal cell (1.5 mL)</td>
			<td>Kartell</td>
			<td>1938 / 2-478-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DU 730 Life Science UV/Vis Spectrophotometer</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A23616</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EPOCH2</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>2014-EP2-002 / EPOCH2T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beaker (500 mL)</td>
			<td>IWAKI</td>
			<td>82-0008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BIO clean bench</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>MCV-B131F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass tubes</td>
			<td>NICHIDEN RIKA GLASS</td>
			<td>P-10M~P-30 /101019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone rubber stoppers</td>
			<td>ShinEtsu Polymer</td>
			<td>T-19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacterial strains</td>
			<td>Strain bank organization; National Bio Resource Project (NBRP) in Japan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

precise, high-throughput analysis of bacterial growth

La croissance bactérienne est un concept central dans le développement de la physiologie microbienne moderne, ainsi que dans l’investigation de la dynamique cellulaire au niveau des systèmes. Des études récentes ont rapporté des corrélations entre la croissance bactérienne et les événements de génome, comme la réorganisation de la réduction et le transcriptome du génome. Analyser correctement la croissance bactérienne est cruciale pour comprendre la coordination axées sur la croissance des fonctions des gènes et des composants cellulaires. Par conséquent, l’évaluation quantitative précise de la croissance bactérienne de manière haut débit est requise. Nouveaux développements technologiques offrent de nouveaux outils expérimentaux qui permettent des mises à jour des méthodes utilisées pour l’étude de la croissance bactérienne. Le protocole présenté ici utilise un lecteur de microplaques avec une procédure expérimentale hautement optimisé pour l’évaluation précise et reproductible de la croissance bactérienne. Ce protocole a été utilisé pour évaluer la croissance de plusieurs précédemment décrit des souches d’Escherichia coli . Les principales étapes du protocole sont les suivants : la préparation d’un grand nombre de stocks de cellules de petites fioles pour essais répétés avec des résultats reproductibles, l’utilisation des plaques à 96 puits, pour l’évaluation de la croissance du haut débit et le calcul manuel de deux grandes paramètres (p. ex., densité de population et taux de croissance maximal) qui représente la dynamique de croissance. En comparaison avec le test d’unité (CFU) formatrices traditionnels, qui compte les cellules qui sont cultivées dans des tubes de verre au fil du temps sur milieu gélosé, la présente méthode est plus efficace et fournit des notices plus détaillées temporelles des variations de croissance, mais a une plus stricte limite de détection à faible densité de population. En résumé, la méthode décrite est avantageuse pour l’analyse précise et reproductible de haut débit de la croissance bactérienne, qui peut être utilisée pour tirer des conclusions conceptuelles ou de présenter des observations théoriques.

La méthode décrite fournit un moyen de capturer la croissance bactérienne dynamique de façon continue et à haut débit en utilisant un lecteur de format 96 puits qui prend plusieurs mesures de la densité optique à divers intervalles de temps (à partir de minutes, heures ou jours). Les courbes de croissance d’un assortiment de souches d’Escherichia coli exprimant différents génomes peuvent être précisément acquises dans une expérience simple (<strong class="xfig"...

Watch this Scientific Journal Video about Precise, High-throughput Analysis of Bacterial Growth at JoVE.com

Precise, High-throughput Analysis of Bacterial Growth

Analyse précise, haut débit de la croissance bactérienne

Une évaluation quantitative de la croissance bactérienne est essentielle pour comprendre la physiologie microbienne comme un phénomène de niveau système. Un protocole pour la manipulation expérimentale et une approche analytique sont introduites, permettant une analyse précise et à haut débit de la croissance bactérienne, qui est un sujet clé d’intérêt en biologie des systèmes.

Bacterial growth is a central concept in the development of modern microbial physiology, as well as in the investigation of cellular dynamics at the ...

Research

JoVE Journal

Biology

High-throughput Yeast Plasmid Overexpression Screen

Haut débit écran surexpression plasmide de levure

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a powerful model system for defining fundamental mechanisms of many important cellular processes, ...

Recherche

Biologie

High Throughput Microinjections of Sea Urchin Zygotes

À haut débit microinjections oursins zygotes

Microinjection into cells and embryos is a common technique that is used to study a wide range of biological processes. In this method a small amount of ...

A High Throughput MHC II Binding Assay for Quantitative Analysis of Peptide Epitopes

Un essai de liaison à haut débit CMH II pour l&#39;analyse quantitative du peptide épitopes

Biochemical assays with recombinant human MHC II molecules can provide rapid, quantitative insights into immunogenic epitope identification, deletion, or ...

Recovery of Adult Zebrafish Hearts for High-throughput Applications

Recouvrement des adultes coeurs de poisson zèbre à haut débit pour des applications

Use of the zebrafish model system for studying development, regeneration, and disease is expanding toward use of adult hearts for cell dissociation and ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Haut-débit criblage de modulateurs chimique des gènes post-transcriptionnelle réglementées

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

qPCRTag Analysis - A High Throughput, Real Time PCR Assay for Sc2.0 Genotyping

Analyse qPCRTag - un débit élevé, PCR temps réel pour Sc2.0 Génotypage

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic ...

Automated Modular High Throughput Exopolysaccharide Screening Platform Coupled with Highly Sensitive Carbohydrate Fingerprint Analysis

Automated Modular High Throughput exopolysaccharide plateforme de criblage Couplé avec très sensible Analyse Glucides d&#39;empreintes digitales

Many microorganisms are capable of producing and secreting exopolysaccharides (EPS), which have important implications in medical fields, food ...

High Throughput Danio Rerio Energy Expenditure Assay

High Throughput Danio Rerio Energy Expenditure Assay

High Throughput<em&gt; Danio rerio</em&gt; Dépense énergétique Assay

Zebrafish are an important model organism with inherent advantages that have the potential to make zebrafish a widely applied model for the study of ...

Applications of pHluorin for Quantitative, Kinetic and High-throughput Analysis of Endocytosis in Budding Yeast

Applications de pHluorin pour Quantitative, Kinetic et à haut débit Analyse des endocytose dans la levure bourgeonnante

Green fluorescent protein (GFP) and its variants are widely used tools for studying protein localization and dynamics of events such as cytoskeletal ...

Isolation, Characterization, And High Throughput Extracellular Flux Analysis of Mouse Primary Renal Tubular Epithelial Cells

Analyse de Flux extracellulaire isolement, caractérisation et un débit élevé de souris primaire tubulaire les cellules épithéliales rénales

Mitochondrial dysfunction in the renal tubular epithelial cells (TECs) can lead to renal fibrosis, a major cause of&#160;chronic kidney disease (CKD). ...