Name: precise, high-throughput analysis of bacterial growth
Uploaded: 2017-09-19T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Precise, High-throughput Analysis of Bacterial Growth at JoVE.com

Författarna har något att avslöja.

1. förbereda odlingsmedium Obs: den kemiska sammansättningen av minimal medium M63 är följande: 62 mM K 2 HPO 4, 39 mM KH 2 PO 4, 15 mM (NH 4) 2 SO 4, 1,8 µM FeSO 4, 15 µM tiamin-HCl, 0,2 mM MgSO 4 och 22 mM glukos. M63 görs genom att blanda tre lager lösningar: fem X lösning, 20% glukos och MgSO 4 tiamin lösning. Lagra alla lösningar vid 4 ° C.
<ol><li>Beredning av fe...

<ol>
	<li>Kovarova-Kovar, K., Egli, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+kinetics+of+suspended+microbial+cells:+from+single-substrate-controlled+growth+to+mixed-substrate+kinetics.">Growth kinetics of suspended microbial cells: from single-substrate-controlled growth to mixed-substrate kinetics.</a> Microbiol Mol Biol Rev. 62 (3), 646-666 (1998).</li><li>Soupene, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+studies+of+Escherichia+coli+strain+MG1655:+growth+defects+and+apparent+cross-regulation+of+gene+expression.">Physiological studies of Escherichia coli strain MG1655: growth defects and apparent cross-regulation of gene expression.</a> J Bacteriol. 185 (18), 5611-5626 (2003).</li><li>Sezonov, G., Joseleau-Petit, D., D'Ari, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escherichia+coli+physiology+in+Luria-Bertani+broth.">Escherichia coli physiology in Luria-Bertani broth.</a> J Bacteriol. 189 (23), 8746-8749 (2007).</li><li>Egli, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+growth+and+physiology:+a+call+for+better+craftsmanship.">Microbial growth and physiology: a call for better craftsmanship.</a> Front Microbiol. 6, 287 (2015).</li><li>Kurokawa, M., Seno, S., Matsuda, H., Ying, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+between+genome+reduction+and+bacterial+growth.">Correlation between genome reduction and bacterial growth.</a> DNA Res. 23 (6), 517-525 (2016).</li><li>Matsumoto, Y., Murakami, Y., Tsuru, S., Ying, B. W., Yomo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+rate-coordinated+transcriptome+reorganization+in+bacteria.">Growth rate-coordinated transcriptome reorganization in bacteria.</a> BMC Genomics. 14, 808 (2013).</li><li>Nahku, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+growth+rate+dependent+transcriptome+profiling+of+Escherichia+coli+K12+MG1655+in+accelerostat+cultures.">Specific growth rate dependent transcriptome profiling of Escherichia coli K12 MG1655 in accelerostat cultures.</a> J Biotechnol. 145 (1), 60-65 (2010).</li><li>Dai, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduction+of+translating+ribosomes+enables+Escherichia+coli+to+maintain+elongation+rates+during+slow+growth.">Reduction of translating ribosomes enables Escherichia coli to maintain elongation rates during slow growth.</a> Nat Microbiol. 2, 16231 (2016).</li><li>Madrid, R. E., Felice, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+biomass+estimation.">Microbial biomass estimation.</a> Crit Rev Biotechnol. 25 (3), 97-112 (2005).</li><li>Harris, C. M., Kell, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+estimation+of+microbial+biomass.">The estimation of microbial biomass.</a> Biosensors. 1 (1), 17-84 (1985).</li><li>Yates, G. T., Smotzer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+lag+phase+and+initial+decline+of+microbial+growth+curves.">On the lag phase and initial decline of microbial growth curves.</a> J Theor Biol. 244 (3), 511-517 (2007).</li><li>Kargi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Re-interpretation+of+the+logistic+equation+for+batch+microbial+growth+in+relation+to+Monod+kinetics.">Re-interpretation of the logistic equation for batch microbial growth in relation to Monod kinetics.</a> Lett Appl Microbiol. 48 (4), 398-401 (2009).</li><li>Peleg, M., Corradini, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+growth+curves:+what+the+models+tell+us+and+what+they+cannot.">Microbial growth curves: what the models tell us and what they cannot.</a> Crit Rev Food Sci Nutr. 51 (10), 917-945 (2011).</li><li>Sprouffske, K., Wagner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growthcurver:+an+R+package+for+obtaining+interpretable+metrics+from+microbial+growth+curves.">Growthcurver: an R package for obtaining interpretable metrics from microbial growth curves.</a> BMC Bioinformatics. 17, 172 (2016).</li><li>Hall, B. G., Acar, H., Nandipati, A., Barlow, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+rates+made+easy.">Growth rates made easy.</a> Mol Biol Evol. 31 (1), 232-238 (2014).</li><li>Hermsen, R., Okano, H., You, C., Werner, N., Hwa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+growth-rate+composition+formula+for+the+growth+of+E.coli+on+co-utilized+carbon+substrates.">A growth-rate composition formula for the growth of E.coli on co-utilized carbon substrates.</a> Mol Syst Biol. 11 (4), 801 (2015).</li><li>Engen, S., Saether, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=r-+and+K-selection+in+fluctuating+populations+is+determined+by+the+evolutionary+trade-off+between+two+fitness+measures:+Growth+rate+and+lifetime+reproductive+success.">r- and K-selection in fluctuating populations is determined by the evolutionary trade-off between two fitness measures: Growth rate and lifetime reproductive success.</a> Evolution. 71 (1), 167-173 (2017).</li></ol>

Kritiska steg i protokollet inbegripa förberedelse av en stamaktier av exponentiellt växande celler och replikering av samma proverna i flera brunnar på olika befattningar på mikroplattan. Tidigare startade mikrobiologer kulturen från en övernattning före kultur. Även denna metod kan minska fördröjning av bakterietillväxt, är det svårt att uppnå reproducerbara tillväxtkurvor. Som visas i figur 2, resulterade de oberoende mätningar med gemensamma glycerol bestånden i nästan ...

Mikrobiologiska undersökningar börjar ofta med kulturen av bakterieceller och bedömningen av bakterietillväxt kurvorna, som utgör ett grundläggande fenomen av bakteriell fysiologi1,2,3. Grundläggande kultur principer är allmänt tillgängliga i publicerad forskningslitteratur och läroböcker eftersom bakterieodling är en grundläggande metodik. På bänk nivå, betydande uppmärksamhet har traditionellt fokuserats på optimera tillväxt medier och odlingsskålar villkor, men kontrollera tillväxttakten, som sannolikt skulle ge ännu större förståelse för mikrobiell fysiologi, har inte varit flitigt studerade4. För exponentiellt växande bakterier, är en viktig parameter i den cellulära staten tillväxttakten, som har rapporterats vara samordnad med den genomet och transkriptom proteomet5,6,7,8 . Kvantitativ utvärdering av bakterietillväxt är alltså avgörande för att förstå mikrobiell fysiologi.
Utvärdera bakterietillväxt, de experimentella metoder som används för att beräkna biomassa är väl etablerad9,10 och baseras på påvisande av biokemiska, fysiska eller biologiska parametrar, till exempel optiska grumlighet. Dessutom är de analysmetoder som används för att fånga de dynamiska egenskaperna hos tillväxt förändringar vanligen baserade på etablerade ickelinjära modeller11,12,13, exempelvis logistiska ekvationer. Tillväxtdynamik förvärvas generellt genom tidsstyrd provtagning av celltillväxt i kultur av antingen mäta optiska grumlighet eller utför kolonibildande enhet (CFU) analyser. Begränsning av dessa metoder för odling och upptäckt är att datapunkterna inte är en sann bild av populationsdynamik eftersom mätning intervallen är ofta i timmar och eftersom villkoret kultur (t.ex.förändringar i temperatur och Luftning) är störd vid tidpunkten för provtagning. Kultur och analystekniker måste uppdateras med senaste tekniska utvecklingen och förståelse. Senaste framstegen inom mikroplattan läsare tillåter realtid observationen av bakterietillväxt och avsevärt minska arbetskostnader. Använda dessa avancerade enheter, har de senaste undersökningarna på bakterietillväxt rapporterat analysmetoder för hög genomströmning mätningar14,15.
Syftet med detta protokoll är att utvärdera den exakta tillväxtdynamiken i en hög genomströmning sätt, vilket kommer att vara värdefullt för kvantitativa studier som slutligen ta itu med frågorna om hur tillväxttakten bestäms och vilka faktorer påverkar tillväxttakten. Protokollet behandlar alla faktorer som bör beaktas för repeterbara och noggrann kvantitering av bakterietillväxt. Den experimentella metoden och analysen beskrivs i detalj i huvudtexten. Denna metod tillåter exakta och reproducerbara analysen av bakterietillväxt på en hög genomströmning sätt. Mikrobiologer kan använda det här protokollet för att härleda ytterligare kvantitativa resultat från deras experimentella bevis. Detta protokoll kan också användas för studier i systembiologi som försöker dra konceptuella slutsatser eller uppnå en teoretisk översikt av tillväxt.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>Wako</td>
			<td>164-04295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Wako</td>
			<td>166-04255</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(NH4)2SO4</td>
			<td>Wako</td>
			<td>019-03435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4-7H2O</td>
			<td>Wako</td>
			<td>138-00415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiamine-HCl</td>
			<td>Wako</td>
			<td>201-00852</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glucose</td>
			<td>Wako</td>
			<td>049-31165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Wako</td>
			<td>080-01066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iron (II) sulfate heptahydrate (FeSO4-7H2O)</td>
			<td>Wako</td>
			<td>094-01082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH</td>
			<td>Wako</td>
			<td>168-21815</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Wako</td>
			<td>075-00611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tube (50 mL, sterilized)</td>
			<td>WATSON</td>
			<td>1342-050S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips, 200 &#181;L</td>
			<td>WATSON</td>
			<td>110-705Y</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips, 1000 &#181;L</td>
			<td>WATSON</td>
			<td>110-8040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtube (1.5 mL)</td>
			<td>WATSON</td>
			<td>131-715C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8 multichannel-pipette</td>
			<td>WATSON</td>
			<td>NT-8200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PASORINA STIRRER</td>
			<td>AS ONE</td>
			<td>2-4990-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass cylinder (200 mL)</td>
			<td>AS ONE</td>
			<td>1-8562-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision pH mater</td>
			<td>AS ONE</td>
			<td>AS800 / 1-054-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman P-200</td>
			<td>GILSON</td>
			<td>1-6855-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman P-1000</td>
			<td>GILSON</td>
			<td>1-6855-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Serolocical Pipettes (10 mL)</td>
			<td>SANPLATEC</td>
			<td>SAN27014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Serolocical Pipettes (25 mL)</td>
			<td>SANPLATEC</td>
			<td>SAN27015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtube stand</td>
			<td>BM Bio</td>
			<td>801-02Y</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>BM Bio</td>
			<td>BM-V1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Costar 96-well microplate with lid (Flat bottom, Clear)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Corning, 3370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Costar reagent reservoir (50 mL)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Corning, 4870</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stericup GV PVDF (250 mL, 0.22 &#181;M)</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>SCGVU02RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet-Aid XP</td>
			<td>DRUMMOND</td>
			<td>4-000-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioshaker (BR-23UM MR)</td>
			<td>TAITEC</td>
			<td>0053778-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposal cell (1.5 mL)</td>
			<td>Kartell</td>
			<td>1938 / 2-478-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DU 730 Life Science UV/Vis Spectrophotometer</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A23616</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EPOCH2</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>2014-EP2-002 / EPOCH2T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beaker (500 mL)</td>
			<td>IWAKI</td>
			<td>82-0008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BIO clean bench</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>MCV-B131F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass tubes</td>
			<td>NICHIDEN RIKA GLASS</td>
			<td>P-10M~P-30 /101019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone rubber stoppers</td>
			<td>ShinEtsu Polymer</td>
			<td>T-19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacterial strains</td>
			<td>Strain bank organization; National Bio Resource Project (NBRP) in Japan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

precise, high-throughput analysis of bacterial growth

Bakteriell tillväxt är ett centralt begrepp i utvecklingen av moderna mikrobiell fysiologi, liksom i utredningen av cellulära dynamics på systemnivå. Nyligen genomförda studier har rapporterat korrelationer mellan bakterietillväxt och genome-wide händelser, såsom genomet minskning och transkriptom omorganisation. Korrekt analysera bakterietillväxt är avgörande för att förstå tillväxt-beroende samordning av genen funktioner och cellulära komponenter. Följaktligen krävs den precisa kvantitativa utvärderingen av bakterietillväxt på ett sätt som hög genomströmning. Framväxande tekniska utvecklingen erbjuder nya experimentella verktyg som tillåter uppdateringar av de metoder som används för att studera bakterietillväxt. Protokollet införs här sysselsätter en microplate reader med en mycket optimerad experimentell förfarande för reproducerbara och exakt utvärdering av bakterietillväxt. Detta protokoll användes för att utvärdera tillväxten av flera tidigare beskrivits Escherichia coli stammar. De viktigaste stegen i protokollet är följande: utarbetandet av ett stort antal cell bestånd i små flaskor för upprepade tester med reproducerbara resultat, användning av 96 brunnar för hög genomströmning tillväxt utvärdering och manuell beräkning av två större parametrar (dvs, maximal tillväxt takt och befolkningstätheten) som representerar tillväxtdynamiken. I jämförelse med traditionella kolonibildande enhet (CFU) analysen, som räknar de celler som odlas i glasrör med tiden på agarplattor, denna metod är mer effektiv och ger mer detaljerad temporal records tillväxt förändringar, men har en strängare detektionsgränsen på låg befolkningstäthet. Sammanfattningsvis är den beskrivna metoden fördelaktiga för exakt och reproducerbar hög genomströmning analys av bakterietillväxt, som kan användas till begreppsmässig slutsatser eller göra teoretiska observationer.

Den beskrivna metoden gör det möjligt att fånga dynamiska bakterietillväxt i en kontinuerlig och hög genomströmning sätt genom att utnyttja en 96 brunnar format läsare som tar flera optiska densitet mätningar vid olika tidsintervall (från minuter till timmar till dagar). Tillväxtkurvorna av ett sortiment av E. coli -stammar som uttrycker olika genomen kan förvärvas just i ett enda experiment (figur 1A). I jämförelse med den beskrivna m...

Watch this Scientific Journal Video about Precise, High-throughput Analysis of Bacterial Growth at JoVE.com

Precise, High-throughput Analysis of Bacterial Growth

Exakt, High-throughput analys av bakterietillväxt

Kvantitativ utvärdering av bakteriell tillväxt är nödvändig för att förstå mikrobiell fysiologi som system-nivå fenomen. Ett protokoll för experimentell manipulation och en analytisk metod introduceras, vilket möjliggör precisa, hög genomströmning analys av bakterietillväxt, som är en viktig fråga av intresse i systembiologi.

Bacterial growth is a central concept in the development of modern microbial physiology, as well as in the investigation of cellular dynamics at the ...

Research

JoVE Journal

Biology

High-throughput Yeast Plasmid Overexpression Screen

Med hög kapacitet Jäst Plasmid Överuttryck skärm

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a powerful model system for defining fundamental mechanisms of many important cellular processes, ...

High Throughput Microinjections of Sea Urchin Zygotes

Hög genomströmning microinjections av Sea Urchin Zygotes

Microinjection into cells and embryos is a common technique that is used to study a wide range of biological processes. In this method a small amount of ...

A High Throughput MHC II Binding Assay for Quantitative Analysis of Peptide Epitopes

En hög genomströmning MHC II-bindningsanalys för kvantitativ analys av peptidepitoper

Biochemical assays with recombinant human MHC II molecules can provide rapid, quantitative insights into immunogenic epitope identification, deletion, or ...

Recovery of Adult Zebrafish Hearts for High-throughput Applications

Återvinning av vuxna zebrafisk Hjärtan för hög genomströmning Applications

Use of the zebrafish model system for studying development, regeneration, and disease is expanding toward use of adult hearts for cell dissociation and ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Hög kapacitet Screening för kemiska modulatorer av Post-transkription Reglerade Gener

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

qPCRTag Analysis - A High Throughput, Real Time PCR Assay for Sc2.0 Genotyping

qPCRTag Analys - En hög genomströmning, Realtid PCR-analys för Sc2.0 Genotypning

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic ...

Automated Modular High Throughput Exopolysaccharide Screening Platform Coupled with Highly Sensitive Carbohydrate Fingerprint Analysis

Automatiserad Modular hög genomströmning exopolysackarid Screening Plattform Tillsammans med högkänslig Carbohydrate Fingerprint Analysis

Many microorganisms are capable of producing and secreting exopolysaccharides (EPS), which have important implications in medical fields, food ...

High Throughput Danio Rerio Energy Expenditure Assay

High Throughput Danio Rerio Energy Expenditure Assay

Hög genomströmning<em&gt; Danio rerio</em&gt; Energi Utgifter analys

Zebrafish are an important model organism with inherent advantages that have the potential to make zebrafish a widely applied model for the study of ...

Applications of pHluorin for Quantitative, Kinetic and High-throughput Analysis of Endocytosis in Budding Yeast

Tillämpningar av pHluorin för kvantitativ, kinetisk och hög kapacitet Analys av Endocytosis i knoppande jäst

Green fluorescent protein (GFP) and its variants are widely used tools for studying protein localization and dynamics of events such as cytoskeletal ...

Isolation, Characterization, And High Throughput Extracellular Flux Analysis of Mouse Primary Renal Tubular Epithelial Cells

Isolering, karakterisering och hög genomströmning extracellulära Flux analys av mus primära renala tubulära epitelceller

Mitochondrial dysfunction in the renal tubular epithelial cells (TECs) can lead to renal fibrosis, a major cause of&#160;chronic kidney disease (CKD). ...